本發(fā)明涉及祛除低密度粒細(xì)胞的方法技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及外周血單個核細(xì)胞中祛除低密度粒細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus,sle)患者的外周血單個核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells,pbmcs)中存在一類不同于普通中性粒細(xì)胞的粒細(xì)胞，稱為低密度粒細(xì)胞(low-densitygranulocytes,ldgs)。ldgs的細(xì)胞表面標(biāo)記與成熟的自體或健康對照的中性粒細(xì)胞類似，高表達(dá)中性粒細(xì)胞表面標(biāo)記cd15、cd10、cd11b、cd11c和cd16，但是它們的細(xì)胞核形態(tài)與中性粒細(xì)胞不同，為不成熟的細(xì)胞核表型。ldgs表現(xiàn)出前炎癥細(xì)胞的特點(diǎn)，激活后會損傷內(nèi)皮細(xì)胞，并大量分泌腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，tnf)、ⅰ型和ⅱ型干擾素(interferon，ifn)等細(xì)胞因子。
被病原微生物或細(xì)胞因子激活后，ldgs可以釋放由dsdna、組蛋白、蛋白酶類和抗菌肽等形成的中性粒細(xì)胞胞外網(wǎng)狀陷阱(neutrophilextracellulartraps，nets)去誘捕并殺滅病原微生物。與同源的中性粒細(xì)胞和健康對照的中性粒細(xì)胞相比，ldgs表現(xiàn)出了更強(qiáng)的nets形成能力，且更易形成nets。nets除了起防御作用外，對免疫系統(tǒng)也有調(diào)節(jié)作用。體外培養(yǎng)pbmcs做淋巴細(xì)胞相關(guān)研究時，其內(nèi)所含的異常增多的ldgs可能會在短短幾小時內(nèi)大量形成nets。而nets對培養(yǎng)的t淋巴細(xì)胞有廣泛的影響，可以使cd4+t細(xì)胞群集，使活化標(biāo)記cd25和cd69上調(diào)，導(dǎo)致tcr相關(guān)的信號激酶zap70的磷酸化，并使cd4+t細(xì)胞的激活閾值下調(diào)。與發(fā)生nets的中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的共培養(yǎng)，導(dǎo)致了t細(xì)胞的激活，并使ifn-γ和il-17的分泌顯著增加。
可見在做pbmcs培養(yǎng)時，ldgs通過形成nets對t細(xì)胞的影響不容忽視。除了昂貴且復(fù)雜的流式分選或磁珠分選，非常有必要發(fā)現(xiàn)一種簡單易用的從 pbmcs中祛除ldgs的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于，針對上述的問題，提供外周血單個核細(xì)胞中祛除低密度粒細(xì)胞的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：
外周血單個核細(xì)胞中祛除低密度粒細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：
第一步，將分離的外周血單個核細(xì)胞重懸在未加胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基中；
第二步，吸取細(xì)胞濃度1×105/ml的培養(yǎng)基溶液，放入孔板中，所述的孔板，具體是96孔板或48孔板或24孔板或12孔板或6孔板，選取96孔板時，每孔加入100ul，選取48孔板時，每孔加入300ul，選取24孔板時，每孔加入0.6ml，選取12孔板時，每孔加入1.5ml，選6孔板時，每孔加入3ml；
第三步，將孔板放入濃度為5％的co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1小時；
第四步，吸取上清液加入到離心管中，并加入兩倍體積的磷酸緩沖鹽溶液，放入離心機(jī)中離心10分鐘；
第五步，去除上清液后用rpmi1640培養(yǎng)基重懸外周血單個核細(xì)胞備用。
本發(fā)明的有益效果是，解決了從pbmcs中祛除ldgs的技術(shù)難題。由于自身免疫病中pbmcs中l(wèi)dgs普遍異常升高，而且pbmcs中所含的ldgs會嚴(yán)重影響t細(xì)胞的功能，所以在以t細(xì)胞為研究對象的研究中，需要祛除pbmcs中的ldgs。目前從pbmcs中祛除ldgs的方法有磁珠分選和流式分選。這兩種方法利用磁珠標(biāo)記或熒光標(biāo)記的單克隆抗體分別與目標(biāo)細(xì)胞受體進(jìn)行特異性結(jié)合而獲得特定細(xì)胞株，分為陽性選擇和陰性選擇。陽性選擇獲得的t細(xì)胞，由于結(jié)合了特異性抗體，可能會影響細(xì)胞的某些功能。而陰性選擇時需要使用多種抗體去結(jié)合非目的細(xì)胞而保留t細(xì)胞，所以分選成本比很高。這兩種分選方法費(fèi)時費(fèi)力，分選成本很高，完全不適合臨床應(yīng)用。本發(fā)明所述方法 解決了這一難題，從pbmcs中祛除ldgs省時省力，不增加額外費(fèi)用，適合臨床及科研應(yīng)用。
附圖說明
圖1是本發(fā)明的關(guān)于ldgs在自身免疫病中普遍異常升高的統(tǒng)計(jì)示意圖。
圖2是本發(fā)明的關(guān)于離心力對清除pbmcs中l(wèi)dgs影響的統(tǒng)計(jì)圖。
圖3是本發(fā)明的清除pbmcs中l(wèi)dgs優(yōu)于先沉淀后離心的統(tǒng)計(jì)圖。
圖4是本發(fā)明的ldgs清除率優(yōu)于其他方法的統(tǒng)計(jì)圖。
圖5是本發(fā)明的祛除ldgs后對pbmcs中t細(xì)胞比例無明顯影響的統(tǒng)計(jì)圖。
圖6是本發(fā)明的祛除ldgs后對pbmcs中t細(xì)胞比例幾乎無影響的統(tǒng)計(jì)圖。
具體實(shí)施方式
外周血單個核細(xì)胞中祛除低密度粒細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：
第一步，將分離的外周血單個核細(xì)胞重懸在未加胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基中；
第二步，吸取細(xì)胞濃度1×105/ml的培養(yǎng)基溶液，放入孔板中，所述的孔板，具體是96孔板或48孔板或24孔板或12孔板或6孔板，選取96孔板時，每孔加入100ul，選取48孔板時，每孔加入300ul，選取24孔板時，每孔加入0.6ml，選取12孔板時，每孔加入1.5ml，選6孔板時，每孔加入3ml；
第三步，將孔板放入濃度為5％的co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1小時；
第四步，吸取上清液加入到離心管中，并加入兩倍體積的磷酸緩沖鹽溶液，放入離心機(jī)中離心10分鐘；
第五步，去除上清液后用rpmi1640培養(yǎng)基重懸外周血單個核細(xì)胞備用。
本發(fā)明在實(shí)際臨床試驗(yàn)中，以2012年11月到2014年4月期間在中日友好醫(yī)院住院治療患者作為臨床對象，其中55例皮肌炎 (dermatomyositis,dm)患者和15例多發(fā)性肌炎(polymyositis,pm)患者滿足b/p診斷標(biāo)準(zhǔn)作為dm組和pm組，42例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,ra)患者滿足2010ra分類標(biāo)準(zhǔn)作為ra組，25例sle患者滿足1997acr關(guān)于sle分類標(biāo)準(zhǔn)作為sle組。19例性別和年齡匹配的健康志愿者作為對照組，各組基本資料見表1。
表1.研究人群的基本信息
1.pbmcs的分離
采用edta抗凝管抽取10ml健康對照和患者的全血，在6小時內(nèi)采用密度梯度離心法分離pbmcs。具體步驟為：①將4ml的histopaque-1077分離液加入15ml離心管，其上小心加入5ml到8ml全血；
②采用水平離心機(jī)400×g離心30分鐘；③最上層為血漿，其下依次為 pbmcs和紅細(xì)胞沉淀層，小心從上吸取血漿，分裝后凍存在-80℃?zhèn)溆?；④?ml移液器輕柔吸取pbmcs云霧層，將pbmcs加入新的15ml離心管，加入磷酸鹽緩沖液10ml輕柔吹打洗滌細(xì)胞；⑤300×g離心10分鐘，若pbmcs中混有較多紅細(xì)胞可用低滲鹽水溶紅；⑥用0.2％的低滲鹽水溶紅30秒，再加入1.6％的高滲鹽水平衡滲透壓(選用步驟)；
⑦用磷酸鹽緩沖液再洗1次后，將pbmcs重懸入磷酸鹽緩沖液中，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，根據(jù)需要的細(xì)胞數(shù)計(jì)算細(xì)胞懸液量；⑧每例取1×106細(xì)胞用于流式測定ldgs；
2.ldgs的測定
pbmcs中l(wèi)dgs的測定采用流式細(xì)胞術(shù)。單核細(xì)胞高表達(dá)cd14，低表達(dá)或不表達(dá)cd15；而ldgs高表達(dá)cd15，低表達(dá)或不表達(dá)cd14。采用fitc-標(biāo)記的抗cd15抗體(biolegend)和pe標(biāo)記的抗cd14抗體(biolegend)，可以容易的區(qū)分出ldgs。用單標(biāo)的樣本調(diào)節(jié)電壓補(bǔ)償，用對應(yīng)的同型對照抗體消除非特異性染色。檢測采用貝克曼c(diǎn)oulter流式細(xì)胞儀。具體步驟為：①新鮮分離的pbmcs，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后取含有1×106個細(xì)胞的細(xì)胞懸液加入流式管，每例樣本取兩管；②其中一管加入cd14-pe和cd15-fitc,另一管加入相應(yīng)的同型對照，旋渦器混勻后室溫避光孵育20分鐘③每管中加入2ml磷酸鹽緩沖液洗液，振蕩混勻，1500rpm離心5分鐘，棄上清，重復(fù)一次。④棄上清，加入4％的多聚甲醛0.4ml固定；⑤epics-xl型流式細(xì)胞儀檢測同型對照，同時調(diào)整電壓和顏色補(bǔ)償，在散射圖中設(shè)定全門，收集30000個細(xì)胞，讀取免疫表型為cd14lo/cd15+和cd14－/cd15+亞群的百分比。
3.采用不同離心力分離pbmcs對ldgs比例的影響
嚴(yán)格按照sigma公司histopaque-1077分離液說明書分離pbmcs，此 方法定為標(biāo)準(zhǔn)方法。為了分析增大離心力是否能祛除pbmcs中異常增多的ldgs，本研究中進(jìn)一步比較了400×g離心30分鐘(標(biāo)準(zhǔn)方法)、600×g離心30分鐘和800×g離心30分鐘對pbmcs中l(wèi)dgs比例的影響。
4.本發(fā)明所述方法對pbmcs中l(wèi)dgs比例的影響
淋巴細(xì)胞是懸浮細(xì)胞，而中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和ldgs更容易貼壁生長。利用這一特性，對分離的pbmcs在培養(yǎng)板中靜置培養(yǎng)1小時，利用ldgs主動貼壁的特點(diǎn)將ldgs從pbmcs中除掉。將分離的pbmcs重懸在未加胎牛血清的rpmi1640中，細(xì)胞濃度1×105/ml，96孔板每孔100ul，48孔板每孔300ul，24孔板每孔加0.6ml,12孔板每孔加1.5ml,6孔板中每孔加3ml。5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1小時后，輕柔吸取上清加入15ml離心管，并加入兩倍體積的磷酸鹽緩沖液，300×g離心10分鐘后，用磷酸鹽緩沖液重懸，取2×105個細(xì)胞行流式抗體染色，采用流式細(xì)胞儀測定ldgs。
5.全血沉淀3小時對pbmcs中l(wèi)dgs比例的影響
edta抗凝的全血正置在試管架上3小時，輕柔吸取上清血漿加入15ml離心管，300×g離心10分鐘后輕柔吸取血漿，避免碰到細(xì)胞團(tuán)，加入磷酸鹽緩沖液10ml洗滌細(xì)胞一次，，300×g離心10分鐘后磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，取2×105個細(xì)胞行流式抗體染色，采用流式細(xì)胞儀做ldgs測定。此方法命名為全血沉淀后離心法。
6.pbmcs中t細(xì)胞比例的測定
采用fitc-標(biāo)記的抗cd15抗體(biolegend)、pe標(biāo)記的抗cd3抗體(bd)和pe-cy5標(biāo)記的抗cd8抗體(bd)三色標(biāo)記行流式細(xì)胞儀檢測，也可以容易的測定出pbmcs中的ldgs比例。同時對pbmcs中t細(xì)胞比例和cd8+t細(xì)胞比例進(jìn)行測定，以明確不同祛除ldgs的方法對pbmcs中t細(xì) 胞比例的影響。具體步驟參見測定ldgs部分。
7.統(tǒng)計(jì)分析
采用graphpadprism5軟件進(jìn)行組間比較和制圖，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的采用配對t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的采用mann-whitneyu檢驗(yàn)。p<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
8.結(jié)果
8.1pbmcs中l(wèi)dgs的比例在5組間的比較
如圖1所示，ⅱ圖中，4種疾病中l(wèi)dgs在pbmcs中比例的比較dm：皮肌炎；sle：系統(tǒng)性紅斑狼瘡；ra：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；pm：多發(fā)性肌炎；#表示dm、sle和pm組ldgs比例顯著高于健康對照(p<0.001)；$表示ra組ldgs比例顯著高于健康對照(p<0.05)。統(tǒng)計(jì)采用mann-whitneyu檢驗(yàn)，ⅰ圖為在流式散射圖，圖中l(wèi)dgs的細(xì)胞復(fù)雜程度和細(xì)胞大小明顯大于單核細(xì)胞，ldgs的分布接近中性粒細(xì)胞。相比較于健康對照pbmcs中的ldgs比例(1.28％±0.73％)，dm患者(8.41％±10.87％，p<0.0001)、pm患者(8.41％±10.39％,p<0.0001)、ra患者(4.05％±6.97％,p＝0.0249)和sle患者(7.53％±11.52％,p＝0.0006)中的ldgs比例均顯著升高；相比較于陽性對照sle患者，dm、pm和ra患者pbmcs中l(wèi)dgs比例升高或降低的程度均未達(dá)到顯著性水平(p＝0.0677，p＝0.2884，p＝0.0768)。而dm組和pm組顯著高于ra組比例(p<0.0001,p＝0.006)。說明在這幾種常見的自身免疫病中l(wèi)dgs在pbmcs中的比例都顯著高于健康對照。
8.2離心力對pbmcs中l(wèi)dgs比例的影響
如圖2所示，與標(biāo)準(zhǔn)方法相比，600×g離心30分鐘和800×g離心30 分鐘都能減少pbmcs中l(wèi)dgs的比例，但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)水平(p＝0.1572,p＝0.1156)。進(jìn)一步比較600×g離心30分鐘和800×g離心30分鐘的結(jié)果，800×g離心30分鐘的方法不能更明顯地減少pbmcs中l(wèi)dgs的比例(p＝0.6477)。說明一定范圍內(nèi)提高離心力有助于減少pbmcs中的ldgs，但是離心力大于600×g不能進(jìn)一步明顯減少pbmcs中的ldgs。單靠提高離心力不能完全移除pbmcs中的ldgs。
8.3本發(fā)明所述方法對pbmcs中l(wèi)dgs比例的影響
如圖3中所示，在標(biāo)準(zhǔn)方法分離pbmcs的基礎(chǔ)上，利用中性粒細(xì)胞主動貼壁的特性，將分離的pbmcs在培養(yǎng)板中靜置1小時后，檢測上清液中l(wèi)dgs的比例。結(jié)果提示離心后貼壁的方法(adherence)，即本發(fā)明所述方法，能顯著降低pbmcs中l(wèi)dgs的比例(p＝0.0314，圖3a)。但對于ldgs比例極端升高的樣本，該方法不能一次完全清除pbmcs中的ldgs。針對這些樣本，可以采用延長貼壁時間的方法進(jìn)一步增加ldgs的清除率。
8.4全血沉淀后離心法對pbmcs中l(wèi)dgs比例的影響
如圖3中的b所示，先離心后沉淀可以顯著降低pbmcs中l(wèi)dgs的比例，為了進(jìn)一步簡化方法，實(shí)驗(yàn)中嘗試了先沉淀全血再離心的方法(sediment)。先沉淀后離心的方法也能降低pbmcs中l(wèi)dgs的比例，但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)水平(p＝0.078，圖3b)。由圖3b可見，該方法也不能完全清除pbmcs中的ldgs，比例顯著升高樣本中的ldgs清除更差。
8.5比較4種祛除pbmcs中l(wèi)dgs方法的清除率
為了不同方法間比較祛除pbmcs中l(wèi)dgs的方法，實(shí)驗(yàn)中引入了ldgs清除率的概念。標(biāo)準(zhǔn)分離方法的結(jié)果減去各種祛除ldgs方法的結(jié)果，再各自除以采用標(biāo)準(zhǔn)方法的結(jié)果，即為ldgs的清除率。比較了本發(fā)明所述方法 (adherence)、先沉淀全血再離心的方法(sediment)、histopaque-1077分離液600×g離心30分鐘的方法(600g)和histopaque-1077分離液800×g離心30分鐘的方法(800g)中l(wèi)dgs的清除率。結(jié)果如圖4所示，adherence方法的ldgs清除率顯著高于600g方法(p＝0.0057)和800g方法(p＝0.0073)；adherence方法與sediment方法相比的話有一定優(yōu)勢，但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)水平(p＝0.1927)。。由于sediment方法、600g方法和800g方法分離pbmcs時，部分患者pbmcs中的ldgs比例高于標(biāo)準(zhǔn)分離方法，所以ldgs清除率出現(xiàn)了負(fù)值，對于這些患者，這3種方法非但不能清除ldgs，反而ldgs的殘留比標(biāo)準(zhǔn)方法還高，提示這3種方法祛除ldgs的穩(wěn)定性較差。
8.6比較祛除pbmcs中l(wèi)dgs的方法對pbmcs中t細(xì)胞比例的影響
在從pbmcs中祛除ldgs方面，相比較sediment方法，adherence方法展出了更好的穩(wěn)定性和更高的清除率。但清除ldgs的目的，是為了富集淋巴細(xì)胞，所以實(shí)驗(yàn)中比較了這兩種方法對pbmcs中t細(xì)胞比例的影響程度。與標(biāo)準(zhǔn)方法(standardm)，adherence方法對pbmcs中t細(xì)胞的比例影響較小(p＝0.8087，圖5a)，而sediment方法使pbmcs中t細(xì)胞的比例降低較明顯(p＝0.0533，圖5b)但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)水平；adherence方法對pbmcs中t細(xì)胞的比例影響顯著低于sediment方法(p＝0.0387，圖5c)。與standardm方法相比，adherence方法對pbmcs中cd8+t細(xì)胞的比例影響較小(p＝0.3638，圖5d)，而sediment方法使pbmcs中cd8+t細(xì)胞的比例降低較明顯(p＝0.1238，圖5e)；adherence方法對pbmcs中cd8+t細(xì)胞比例的影響似乎比sediment方法小，但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)水平(p＝0.1203，圖5f)。這些結(jié)果提示adherence方法對 pbmcs中t細(xì)胞比例和cd8+t細(xì)胞比例的影響均較小。
8.7pbmcs中t細(xì)胞比例與血常規(guī)淋巴細(xì)胞比例的相關(guān)性在3種方法中的比較
如圖6所示，為了進(jìn)一步分析這3種方法對pbmcs中t細(xì)胞比例的影響，實(shí)驗(yàn)中分析了pbmcs中t細(xì)胞比例與血常規(guī)淋巴細(xì)胞比例的相關(guān)性。結(jié)果提示標(biāo)準(zhǔn)分離方法和adherence方法中pbmcs中t細(xì)胞比例與血常規(guī)淋巴細(xì)胞比例的相關(guān)性較好(p＝0.0325，p＝0.0004)，而sediment方法中pbmcs中t細(xì)胞比例與血常規(guī)淋巴細(xì)胞比例的相關(guān)性很差(p＝0.4249)，提示采用adherence方法分離全血使pbmcs中l(wèi)dgs的比例與未分離的全血中淋巴細(xì)胞的比例一致性非常好。
總結(jié)
與最典型的自身免疫病sle患者類似，dm、pm和ra患者pbmcs中l(wèi)dgs比例均顯著高于健康對照，說明pbmcs中l(wèi)dgs的比例升高在自身免疫病中是普遍的。在一定范圍內(nèi)提高離心力可以降低pbmcs中l(wèi)dgs的比例，但ldgs清除率不穩(wěn)定；離心后貼壁較沉淀后離心能顯著減少pbmcs中l(wèi)dgs的比例；本發(fā)明所述方法的ldgs清除率最高且對pbmcs中t細(xì)胞比例的影響最小。提示本發(fā)明所述方法是祛除pbmcs中l(wèi)dgs的最有效最簡便的方法。
ldgs的細(xì)胞表面標(biāo)記與成熟的自體或健康對照的中性粒細(xì)胞類似，高表達(dá)中性粒細(xì)胞表面標(biāo)記cd15、cd10和cd16，不表達(dá)mhcⅱ類分子和cd86。但是細(xì)胞核形態(tài)與中性粒細(xì)胞不同，為不成熟的細(xì)胞核表型。ldgs可能代表一群在未知因素刺激下從骨髓中提前釋放出來的幼稚中性粒細(xì)胞。自身免疫病中各種促炎細(xì)胞因子和物質(zhì)表達(dá)較多，這些物質(zhì)可能促進(jìn)中性粒細(xì)胞前體細(xì)胞從骨髓中提前釋放，或者干擾中性粒細(xì)胞前體細(xì)胞的分化能力。ldgs表現(xiàn)出前炎癥細(xì)胞的表型，在受到刺激時，會大量分泌tnf、ⅰ型和ⅱ型ifn，這些特征會促發(fā)和加重組織損傷。另外，ldgs不但可以通過形成nets方式損 傷內(nèi)皮細(xì)胞，還可以通過直接與內(nèi)皮細(xì)胞接觸而損傷內(nèi)皮細(xì)胞。
與sle來源的正常密度的中性粒細(xì)胞和健康對照的中性粒細(xì)胞相比，ldgs表現(xiàn)出更強(qiáng)的nets形成能力，而且更易形成nets。體外培養(yǎng)pbmcs做淋巴細(xì)胞相關(guān)研究時，其內(nèi)所含的異常增多的ldgs可能會在短短幾小時內(nèi)大量形成nets。而nets刺激對培養(yǎng)的t淋巴細(xì)胞有廣泛的影響，使cd4+t細(xì)胞群集，上調(diào)了活化標(biāo)記cd25和cd69，導(dǎo)致了tcr相關(guān)的信號激酶zap70的磷酸化，并下調(diào)了cd4+t細(xì)胞的激活閾值。與發(fā)生nets的中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的共培養(yǎng)，可導(dǎo)致了t細(xì)胞的激活，ifn-γ和il-17的分泌顯著增加?？梢娫谧鰌bmcs培養(yǎng)時，ldgs形成的nets對t細(xì)胞的影響不容忽視。
目前從混合細(xì)胞群中獲取或除去某型細(xì)胞的方法有磁珠分選和流式分選。這兩種方法都是利用磁珠標(biāo)記或熒光標(biāo)記的單克隆抗體分進(jìn)行特異性結(jié)合而獲得特定細(xì)胞株，分為陽性選擇和陰性選擇。陽性選擇獲得的細(xì)胞，由于結(jié)合了特異性抗體，可能會影響細(xì)胞的某些功能。而陰性選擇時需要使用多種抗體去結(jié)合非目的細(xì)胞而保留目的細(xì)胞，所以分選成本比較高。所以發(fā)現(xiàn)一種簡單易用的從pbmcs中祛除ldgs的方法是現(xiàn)實(shí)需求。
首先驗(yàn)證了提高離心力對pbmcs中l(wèi)dgs比例的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較之400×g離心力，600×g離心力和800×g離心力均能降低ldgs比例，但是從600×g離心力提高到800×g離心力不能進(jìn)一步顯著降低ldgs比例，提示一定范圍內(nèi)提高離心力有助于降低ldgs比例,但是過大的離心力對祛除ldgs無益。本發(fā)明所述方法對標(biāo)準(zhǔn)方法分離的pbmcs進(jìn)行貼壁處理，可以顯著降低pbmcs中l(wèi)dgs的比例，展示了最高的ldgs清除率。而先沉淀全血再離心血漿的方法雖也能在部分患者中祛除一部分ldgs，但結(jié)果不穩(wěn)定，ldgs清除率不及本發(fā)明所述方法。可見在這幾種方法的比較中，本發(fā)明所述方法是最高效、最穩(wěn)定的祛除pbmcs中l(wèi)dgs的方法。
一個好的方法不但要ldgs清除率高，而且對pbmcs中淋巴細(xì)胞的影響 要小。所以進(jìn)一步比較了本發(fā)明所述方法和先沉淀后離心法對pbmcs中淋巴細(xì)胞的影響。本發(fā)明所述方法不但對pbmcs中t細(xì)胞的影響小，而且pbmcs中t細(xì)胞的比例與血常規(guī)淋巴細(xì)胞比例呈顯著正相關(guān)，提示本發(fā)明所述方法能真實(shí)還原外周血中t細(xì)胞的比例。
一個好的方法不但要高效、對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響小，而且要簡單易行。本發(fā)明所述方法非常易于實(shí)驗(yàn)操作。分離的pbmcs不管是用96孔板，還是48孔板，或者24孔板培養(yǎng)，只需接種細(xì)胞后靜置1小時，再換新培養(yǎng)板就可實(shí)現(xiàn)。根據(jù)清除ldgs的情況及實(shí)驗(yàn)需要，可以適當(dāng)延長靜置時間，或者再換一個新培養(yǎng)板可能會幾乎完全清除pbmcs中的ldgs。
總之，pbmcs中l(wèi)dgs的比例異常增高在sle、pm、dm和ra中是普遍存在的，ldgs形成nets可能會影響這組疾病中針對pbmcs研究的結(jié)果。本發(fā)明所述方法可以在幾乎不影響pbmcs中t細(xì)胞的前提下高效地祛除ldgs。培養(yǎng)pbmcs做淋巴細(xì)胞相關(guān)研究時，推薦細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)板后先靜置一小時，再換板后培養(yǎng)，可以高效、簡便的祛除pbmcs中的ldgs，從而預(yù)防和減少殘留的ldgs通過形成nets而影響t細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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