本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化的誘導(dǎo)液及方法。
背景技術(shù)：
：心肌梗死是由于冠狀動脈循環(huán)改變引起冠脈血流和心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損壞，是臨床上一種嚴重的缺血性心臟病。壞死后的心肌細胞逐漸被癱痕組織所取代，由于癱痕組織缺乏彈性,難以滿足心臟收舒功能的要求,為代償損失心肌細胞的功能,心臟逐漸發(fā)生退行性左心室重塑，心功能下降，最終導(dǎo)致充血性心力衰竭,甚至猝死。臨床藥物和介入治療雖可以改善癥狀，但卻不能挽回受損的心肌細胞。心臟移植雖可以從根本上解決心室重構(gòu)問題，但因為其供體受限，醫(yī)療費用太高而難以廣泛應(yīng)用。近年來的研究表明，心肌細胞也具有再生能力，在心肌梗死后，心肌細胞也可以發(fā)生分裂和增殖。但是，由于其增殖能力較弱，不能滿足彌補喪失心肌細胞數(shù)量的要求而逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)過程。近年來隨著干細胞技術(shù)和組織工程學(xué)研究的不斷深入，干細胞移植治療心肌梗死成為臨床研究的熱點。干細胞的多向分化潛能及可塑性使心肌梗死心肌細胞再生成為可能，在人體的微環(huán)境作用下，干細胞定向歸巢至損傷處，可以多項分化成各種組織細胞及血管。目前用于心肌梗死治療研究的干細胞主要有骨髓間充質(zhì)干細胞、胚胎干細胞、臍帶間充質(zhì)干細胞、脂肪干細胞等。如專利CN105176920A、CN1536076A分別公開了臍帶間充質(zhì)干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化為心肌樣細胞的方法。目前研究表明，在體外常用5-氮雜胞苷，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2等作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化，如上述所提到的兩個專利均是采用5-氮雜胞苷作為誘導(dǎo)劑。人胎盤來源的羊膜組織作為孕婦分娩后的廢棄物，來源廣、增殖快且不受倫理道德限制，是近幾年的研究熱點。羊膜是胎盤包裹胎兒面的一層半透明膜，其表面沒有神經(jīng)、血管、肌肉和淋巴等組織，可分離出羊膜上皮細胞和羊膜間充質(zhì)干細胞。早在50多年前，科學(xué)家和臨床醫(yī)生們就已經(jīng)認識到羊膜擁有一定的生物學(xué)作用。早期羊膜曾被用作覆蓋皮膚傷口的敷料，可以抗感染、減輕炎癥的發(fā)生，并且抑制細胞的免疫反應(yīng)，還可以刺激血管的生成。這些特點使它在多種疾病的輔助治療中得到了較為廣泛的應(yīng)用，例如治療燒傷，覆蓋手術(shù)傷口，更重要的是用于眼表重建術(shù)。其中人胎盤羊膜來源的間充質(zhì)干細胞(humanamnionmesenchymalcells,hAMSCs)來自于原條期的胚外中胚層，具有在一定條件下向多個細胞系分化潛能，向內(nèi)胚層分化，如肝細胞、胰島樣細胞；向中胚層分化，如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞；向外胚層分化，如神經(jīng)細胞等。hAMSCs不僅具有干細胞的特征，且不排斥性及免疫效果，是細胞移植和組織工程的理想種子細胞。hAMSCs在體外使用合適的誘導(dǎo)劑同樣具有分化為心肌樣細胞的能力。hAMSCs這種功能特性極大地吸引了來自基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究者，給基礎(chǔ)科學(xué)的研究者們提供了一種研究發(fā)展生物學(xué)的模式，hAMSCs所具有的修復(fù)、替代和再生能力也為臨床醫(yī)學(xué)提供了一個發(fā)展新療法的機會。然而，目前對于hAMSCs向心肌樣細胞分化誘導(dǎo)的研究報道尚少。由于生物體是一個復(fù)雜的存在多誘導(dǎo)因素的有機體，不同的干細胞有不同的微環(huán)境，采用現(xiàn)有常規(guī)的誘導(dǎo)方法并不能使hAMSCs具有較高的誘導(dǎo)分化率。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化的誘導(dǎo)液，使得所述誘導(dǎo)液能夠使人胎盤羊膜來源的間充質(zhì)干細胞在向心肌樣細胞分化時具備較高的誘導(dǎo)分化率。同時，基于該誘導(dǎo)液本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)分化方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種誘導(dǎo)羊膜間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化的誘導(dǎo)液，該誘導(dǎo)液為包括胎牛血清、5-氮雜胞苷、血管緊張素II和轉(zhuǎn)錄生長因子β1的DMEM/F12培養(yǎng)液。針對現(xiàn)有技術(shù)中人胎盤羊膜來源的間充質(zhì)干細胞(hAMSCs)向心肌樣細胞分化的誘導(dǎo)分化率較低的問題，本發(fā)明在常用的5-氮雜胞苷(5-aza)基礎(chǔ)上，選擇血管緊張素II(Ang-II)和轉(zhuǎn)錄生長因子β1(TGFβ1)作為新的組分，三者相互作用提高了hAMSCs的誘導(dǎo)分化率。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述誘導(dǎo)液為包括10％胎牛血清、5-10μmol/L5-氮雜胞苷、5-10μmol/L血管緊張素II和5-10μg/L轉(zhuǎn)錄生長因子β1的DMEM/F12培養(yǎng)液。在本發(fā)明具體實施方式中，所述誘導(dǎo)液以DMEM/F12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)組分，同時包含如下之一組分：(1)10％胎牛血清、5μmol/L5-氮雜胞苷、5μmol/L血管緊張素II和5μg/L轉(zhuǎn)錄生長因子β1；(2)10％胎牛血清、10μmol/L5-氮雜胞苷、5μmol/L血管緊張素II和10μg/L轉(zhuǎn)錄生長因子β1；(3)10％胎牛血清、10μmol/L5-氮雜胞苷、10μmol/L血管緊張素II和5μg/L轉(zhuǎn)錄生長因子β1；(4)10％胎牛血清、5μmol/L5-氮雜胞苷、5μmol/L血管緊張素II和10μg/L轉(zhuǎn)錄生長因子β1。在hAMSCs誘導(dǎo)分化的試驗中，采用本發(fā)明誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)分化率均在30％以上，最高可達到43％；而作為對照的誘導(dǎo)液，其誘導(dǎo)分化率均未超過25％?；诖思夹g(shù)效果，本發(fā)明提出了所述誘導(dǎo)液在誘導(dǎo)羊膜間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化和/或制備誘導(dǎo)羊膜間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化的誘導(dǎo)試劑中的應(yīng)用。同時，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)羊膜間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化的方法，將羊膜間充質(zhì)干細胞先進行貼壁培養(yǎng)，然后接種于權(quán)利要求3任意一項所述誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)培養(yǎng)，期間定期更換誘導(dǎo)液。作為優(yōu)選，所述方法為將羊膜間充質(zhì)干細胞按1×104cells/mL密度接種于含10％胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)24h，然后更換本發(fā)明所述誘導(dǎo)液，在37℃、5％CO2、飽和濕度環(huán)境下靜置誘導(dǎo)培養(yǎng)4周，期間2-3天換液一次。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述羊膜間充質(zhì)干細胞為人羊膜間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明所述羊膜間充質(zhì)干細胞可參照本領(lǐng)域常規(guī)方法制備獲得，在本發(fā)明中給出了較佳的制備方法：用剪刀將羊膜從胎盤上剪下并清洗，然后剪成小塊加入胰蛋白酶消化，消化后再次剪碎，加入Ⅰ型膠原酶消化，消化后過篩，加入含10％FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸細胞并進行培養(yǎng)，至細胞長滿80-90％傳代，定期更換新鮮的含10％FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基。更為具體地，制備過程按照如下方法進行：取材：無菌條件下取38-40周正常剖宮產(chǎn)胎盤，無肝炎、梅毒、HIV等傳染性疾病，產(chǎn)婦及其家屬對胎盤可能用于科學(xué)研究均簽署了知情同意書。漂洗：用手術(shù)剪把整個羊膜從胎盤上剪下來放入15cm玻璃培養(yǎng)皿中，去除血塊和損傷較嚴重的部位，PBS緩沖液漂洗3-4次。剪碎：用手術(shù)剪將羊膜剪成(30-50)cm2大小的組織，分裝到50mL離心管中(體積10-15ml)。胰酶消化：加入三倍體積的0.25％胰蛋白酶，置37℃、200R恒溫振蕩器中消化30min，每10min取出用手劇烈搖晃。二次漂洗：消化結(jié)束后，用鑷子將消化好的組織塊轉(zhuǎn)移至裝有PBS緩沖液的250mL儲液瓶中，蓋緊蓋子用手劇烈搖晃，PBS緩沖液漂洗2-3次。二次剪碎：用手術(shù)剪將羊膜剪成(10-30)cm2大小的組織。Ⅰ型膠原酶消化：加入20mL的0.5％Ⅰ型膠原酶，補加DMEM/F12培養(yǎng)基至終體積為100mL。置37℃、200R恒溫振蕩器中消化，每10min取出用手劇烈搖晃，直到組織塊完全消化。過篩：消化完成后，消化好的組織液分裝至50mL離心管，每管20-25mL，加入等體積的PBS緩沖液，2000rpm離心5min。棄上清后加入10mLPBS緩沖液重懸細胞沉淀，200μm細胞篩網(wǎng)過濾。2000rpm離心5min。棄上清，加入5-10mL含10％FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸細胞。細胞計數(shù)與接種：對細胞懸液進行細胞計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果調(diào)整細胞懸液密度到1.0-1.5×105cell/mL接種于培養(yǎng)皿中，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。原代培養(yǎng)：細胞接種48h后，對原代細胞進行換液，更換新鮮的含10％FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，放置5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)至細胞長滿80-90％傳代。作為優(yōu)選，所述傳代為待原代細胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶消化，鏡下觀察細胞收縮變圓時，立即加入含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，離心收集細胞，加入適量含10％FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，每隔3-4天傳代一次。更為具體地，待細胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入2-3mL0.25％胰蛋白酶，消化1-3分鐘，鏡下觀察細胞收縮變圓時，立即加入適量含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，收集細胞，1500rpm離心5min，棄上清。加入適量含10％FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，進行細胞計數(shù)，按1×105cell/mL密度接種于培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔3-4天傳代一次。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明在傳統(tǒng)的誘導(dǎo)劑5-氮雜胞苷基礎(chǔ)上，額外添加了血管緊張素II和轉(zhuǎn)錄生長因子β1兩種適宜組分，利用三者的聯(lián)合作用共同誘導(dǎo)羊膜間充質(zhì)干細胞分化為心肌樣細胞，能夠顯著提高羊膜間充質(zhì)干細胞的誘導(dǎo)分化率。附圖說明圖1所示為hAMSCs各表面抗原流式細胞術(shù)檢測結(jié)果；圖2所示為hAMSCs各組誘導(dǎo)分化率結(jié)果比較。具體實施方式本發(fā)明實施例公開了一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化的誘導(dǎo)液及方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明產(chǎn)品和方法已通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品和方法進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。以下就本發(fā)明所提供的一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化的誘導(dǎo)液及方法做進一步說明。實施例1：hAMSCs原代分離培養(yǎng)、鑒定及傳代取材：無菌條件下取38-40周正常剖宮產(chǎn)胎盤，無肝炎、梅毒、HIV等傳染性疾病，產(chǎn)婦及其家屬對胎盤可能用于科學(xué)研究均簽署了知情同意書。漂洗：用手術(shù)剪把整個羊膜從胎盤上剪下來放入15cm玻璃培養(yǎng)皿中，去除血塊和損傷較嚴重的部位，PBS緩沖液漂洗3-4次。剪碎：用手術(shù)剪將羊膜剪成(30-50)cm2大小的組織，分裝到50mL離心管中(體積10-15ml)。胰酶消化：加入三倍體積的0.25％胰蛋白酶，置37℃、200R恒溫振蕩器中消化30min，每10min取出用手劇烈搖晃。二次漂洗：消化結(jié)束后，用鑷子將消化好的組織塊轉(zhuǎn)移至裝有PBS緩沖液的250mL儲液瓶中，蓋緊蓋子用手劇烈搖晃，PBS緩沖液漂洗2-3次。二次剪碎：用手術(shù)剪將羊膜剪成(10-30)cm2大小的組織。Ⅰ型膠原酶消化：加入20mL的0.5％Ⅰ型膠原酶，補加DMEM/F12培養(yǎng)基至終體積為100mL。置37℃、200R恒溫振蕩器中消化，每10min取出用手劇烈搖晃，直到組織塊完全消化。過篩：消化完成后，消化好的組織液分裝至50mL離心管，每管20-25mL，加入等體積的PBS緩沖液，2000rpm離心5min。棄上清后加入10mLPBS緩沖液重懸細胞沉淀，200μm細胞篩網(wǎng)過濾。2000rpm離心5min。棄上清，加入5-10mL含10％FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸細胞。細胞計數(shù)與接種：對細胞懸液進行細胞計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果調(diào)整細胞懸液密度到1.0-1.5×105cell/mL接種于培養(yǎng)皿中，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。原代培養(yǎng)：細胞接種48h后，對原代細胞進行換液，更換新鮮的含10％FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，放置5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。傳代：待細胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入2-3mL0.25％胰蛋白酶，消化1-3分鐘，鏡下觀察細胞收縮變圓時，立即加入適量含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，收集細胞，1500rpm離心5min，棄上清。加入適量含10％FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，進行細胞計數(shù)，按1×105cell/mL密度接種于培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔3-4天傳代一次。hAMSCs鑒定：取第2代對數(shù)生長期細胞，流式細胞術(shù)檢測表面抗原CD105、CD90、CD73、CD45、CD34、HLA-DR表達情況，Cell-Quest軟件分析結(jié)果。每個樣本分析8000～10000個細胞。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，細胞表面抗原CD105、CD90、CD73表達陽性，而CD45、CD34、HLA-DR表達陰性，說明本發(fā)明中得到的hAMSCs屬來源于中胚層的間充質(zhì)干細胞(表1，圖1)。表1hAMSCs表面抗原陽性表達率細胞表型CD105CD90CD73HLA-DRCD34CD45陽性表達率(％)99.6099.50100.000.000.000.20實施例2：本發(fā)明誘導(dǎo)液誘導(dǎo)hAMSCs分化為心肌樣細胞1、誘導(dǎo)液組成(1)含10％FBS、5μmol/L5-aza、5μg/LTGFβ1、5μmol/LAng-II的DMEM/F12培養(yǎng)液。(2)含10％FBS、10μmol/L5-aza、10μg/LTGFβ1、5μmol/LAng-II的DMEM/F12培養(yǎng)液。(3)含10％FBS、10μmol/L5-aza、5μg/LTGFβ1、10μmol/LAng-II的DMEM/F12培養(yǎng)液。(4)含10％FBS、5μmol/L5-aza、10μg/LTGFβ1、5μmol/LAng-II的DMEM/F12培養(yǎng)液。2、誘導(dǎo)分化方法選取實施例1中第3代hAMSCs，按1×104cells/mL密度接種于放有多聚賴氨酸處理的無菌蓋玻片的六孔板中，每孔加入2mL含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，貼壁培養(yǎng)24h后更換誘導(dǎo)液，在37℃、5％CO2、飽和濕度靜置培養(yǎng)，每隔2-3天更換新的誘導(dǎo)液。實施例3：不同誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化對比試驗為了對比不同誘導(dǎo)液對誘導(dǎo)分化的影響，本實施例設(shè)置了如表2中的各個誘導(dǎo)液處理組，其中實驗組為本發(fā)明誘導(dǎo)液。表2各組分化誘導(dǎo)液配方組別基礎(chǔ)培養(yǎng)基FBS5-azaTGFβ1Ang-II實驗組1DMEM/F1210％5μmol/L5μg/L5μmol/L實驗組2DMEM/F1210％10μmol/L10μg/L5μmol/L實驗組3DMEM/F1210％10μmol/L5μg/L10μmol/L實驗組4DMEM/F1210％5μmol/L10μg/L5μmol/L對照組1DMEM/F1210％——————對照組2DMEM/F1210％10μmol/L————對照組3DMEM/F1210％——10μg/L——對照組4DMEM/F1210％————5μmol/L對照組5DMEM/F1210％5μmol/L5μg/L1μmol/L對照組6DMEM/F1210％15μmol/L15μg/L10μmol/L根據(jù)表2設(shè)置的各誘導(dǎo)液，按照實施例2中的誘導(dǎo)分化方法對相同來源、代數(shù)的hAMSCs進行誘導(dǎo)分化4周，然后通過取出細胞爬片，按照免疫組化染色試劑盒的說明書進行肌間線蛋白(desmin)、心肌肌鈣蛋白I(troponinI)和心肌肌鈣蛋白T(troponinT)的免疫組化染色，DAB顯色。將各組放有蓋玻片6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液吸出，PBS緩沖液漂洗細胞鋪片5分鐘，重復(fù)3次。用4％多聚甲醛固定15分鐘，PBS緩沖液漂洗后甩干，中性樹膠粘附于載玻片上，4℃冰箱過夜。滴加3％過氧化氫孵育15分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)3次。分別滴加適量一抗(desmin、troponinI、troponinT)，37℃濕盒內(nèi)孵育1小時，4℃過夜。次日取出后PBS緩沖液漂洗5分鐘，滴加二抗，37℃濕盒內(nèi)孵育40分鐘，PBS緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)3次，滴加新鮮配制的DAB溶液顯色5-10分鐘，在光鏡下觀察，用自來水進行沖洗終止顯色。將甩干片子后，蘇木素復(fù)染1分鐘，分化返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。對各組所得細胞經(jīng)免疫組化檢測后，對desmin、troponinI、troponinT染色的細胞按公式：誘導(dǎo)分化率＝染色陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100％進行計數(shù)，計算出各組的分化率進行比較。每組取樣3次，分別檢測后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。統(tǒng)計結(jié)果如表3和圖2。表3各組細胞分化率(*表示p<0.05，**表示p<0.01)表3、圖2結(jié)果顯示，對照組1為陰性對照組，細胞無著色；其余各組中，三種蛋白均有細胞著色，表明desmin、troponinI、troponinT均表達陽性。其中實驗組1、實驗組2、實驗組3和實驗組4與對照組1-6之間分化率有極顯著性差異(**，p<0.01)；實驗組2與實驗組1、實驗組3、實驗組4均有顯著性差異(*，p<0.05)，實驗組2中細胞著色最多，誘導(dǎo)分化率為43.36±1.01％，顯著高于其他各組，說明本發(fā)明所用分化培養(yǎng)基能有效的誘導(dǎo)hAMSCs向心肌樣細胞分化，并具有較高的誘導(dǎo)分化率。以上所述只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利的保護范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3