本發(fā)明涉及一種人羊膜間充質(zhì)干細胞的專用培養(yǎng)基，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

人羊膜干細胞具有高度自我更新、增殖、可植入性和多系分化能力，異基因個體移植后無免疫排斥和致瘤性風險。而且，人羊膜干細胞來源于產(chǎn)婦分娩后廢棄的胎盤，應用到臨床不會帶來醫(yī)學倫理爭議。羊膜干細胞具有明顯的集落形成能力、增殖能力、胚胎干性、免疫調(diào)節(jié)能力及無異基因移植排斥反應與致瘤性等優(yōu)良生物學特性，可用來進行諸多疾病的細胞治療、組織器官損傷的修復與重建，是再生醫(yī)學領(lǐng)域理想的種子細胞資源，具有廣闊的臨床應用前景。

近些年來，大量的研究表明，羊膜干細胞，既具有向同一胚層不同類型細胞分化的多向分化潛能，又有跨系跨胚層分化的能力，展示出良好的可塑性。如，起源中胚層的細胞既能向成骨、軟骨、脂肪等中胚層細胞分化，亦可向胰腺細胞、肝細胞等內(nèi)胚層細胞、神經(jīng)細胞等外胚層細胞分化。

人羊膜干細胞不僅具有顯著的自我更新能力及跨系跨胚層多系分化潛能，且相對胚胎干細胞和其它成體干細胞，其資源豐富，易獲得，無倫理爭議，免疫原性低，無致瘤風險，還具分泌免疫抑制因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子等多種生物活性因子的強大旁分泌或自分泌功能。這些特性賦予了它在組織工程、細胞治療、基因治療等相關(guān)再生醫(yī)學領(lǐng)域不可估量的臨床應用價值。

現(xiàn)有技術(shù)中，干細胞的培養(yǎng)體系主要應用含動物血清(如FBS)的培養(yǎng)基，BMSCs和臍帶血間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)也多采用FBS。人羊膜間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)體系通常為LG-DMEM培養(yǎng)基中加入10％的FBS、2mmol/L L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸2-巰基乙醇和1mmol/L丙酮酸鈉。但FBS等動物血清的應用，在干細胞移植后，輸入異種蛋白對患者存在潛在的威脅，可產(chǎn)生抗FBS抗體及其他尚未知曉的不良反應，而且可能造成人與其他物種間病毒感染的傳播。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決技術(shù)問題是提供一種不含動物血清的人羊膜間充質(zhì)干細胞的專用培養(yǎng)基。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

人羊膜間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基，由α-MEM培養(yǎng)基、人血漿和人血白蛋白組成，其中人血漿的體積百分比濃度是10％，人血白蛋白的濃度為1％(g/100ml)。

α-MEM培養(yǎng)基為干細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其成分和配制方法為本領(lǐng)域公知常識。自行配制或購買商業(yè)化的α-MEM培養(yǎng)基均可用于本發(fā)明。

所述人血漿為人AB型血漿。

所述人羊膜間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基的pH值為7.2-7.4。

本發(fā)明所述人羊膜間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基可以用于培養(yǎng)人羊膜單個核細胞和/或人羊膜間充質(zhì)干細胞。

本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細胞的方法，將離體的人羊膜單個核細胞按個細胞/cm²接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)于37℃，培養(yǎng)箱，培養(yǎng)液為本發(fā)明的人羊膜間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基；24小時后換液，棄非貼壁細胞，以后每2～3天換液；待人羊膜間充質(zhì)干細胞生長到70～80％融合，用胰酶消化(1～2分鐘)，按0.8×10⁴～1.0×10⁴個細胞/cm²傳代；每2～3天用該人羊膜間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基中傳代一次，使細胞濃度維持在5×10⁵～10×10⁵個細胞/mL；每次傳代培養(yǎng)的條件均為37℃，傳代得到人羊膜間充質(zhì)干細胞。

本發(fā)明還提供了一種采用本發(fā)明人羊膜間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的人羊膜間充質(zhì)干細胞，表達如下三種間充質(zhì)干細胞細胞膜分子：人白細胞分化抗原CD73、人白細胞分化抗原CD90和人白細胞分化抗原不表達如下二種細胞膜分子：人白細胞分化抗原和人白細胞抗原HLA-DR。

本發(fā)明的優(yōu)點是：本發(fā)明的專用培養(yǎng)基成分簡單，制備方便，不含動物血清，既能促進人羊膜間充質(zhì)干細胞增殖，細胞純度高，可滿足細胞治療的臨床條件，安全可靠，可用于干細胞體外擴增。本發(fā)明培養(yǎng)基選擇性強，可從人羊膜單個核細胞中特異性富集人羊膜間充質(zhì)干細胞。

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明做詳細說明，并非對本發(fā)明的限定，凡依照本申請公開文件所進行的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

附圖說明

圖1A為人羊膜間充質(zhì)干細胞剛貼壁時的情況

圖1B為人羊膜間充質(zhì)干細胞開始生長時的情況

圖1C為人羊膜間充質(zhì)干細胞增殖后的情況

圖2A為人羊膜間充質(zhì)干細胞通過流式細胞儀檢測人白細胞分化抗原CD73的表達情況

圖2B為人羊膜間充質(zhì)干細胞通過流式細胞儀檢測人白細胞分化抗原CD90的表達情況

圖2C為人羊膜間充質(zhì)干細胞通過流式細胞儀檢測人白細胞分化抗原的表達情況

圖2D為人羊膜間充質(zhì)干細胞通過流式細胞儀檢測人白細胞分化抗原的表達情況

圖2E為人羊膜間充質(zhì)干細胞通過流式細胞儀檢測人白細胞抗原HLA-DR的表達情況

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

α-MEM培養(yǎng)基為Gibco公司的產(chǎn)品，其產(chǎn)品編號為：11900024。

人AB血漿購自北京紅十字血液中心。

注射用人血白蛋白(國藥準字S20030043)。

實施例1、人羊膜間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基

人羊膜間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基，由α-MEM培養(yǎng)基、人AB型血漿和人血白蛋白組成，其中人AB型血漿的體積百分比濃度是10％，人血白蛋白的濃度為1％(g/100ml)。

α-MEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司的產(chǎn)品，商品編號為11900024。

培養(yǎng)基的pH值為7.2-7.4

實施例2、人羊膜間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)

1、細胞分離

(1)羊膜取自足月剖宮產(chǎn)健康產(chǎn)婦，采集后處理。

(2)將直徑為的羊膜用0.9％氯化鈉溶液清洗，剪碎至約1mm×1mm×1mm，經(jīng)0.1％膠原酶和％的胰酶37℃消化用α-MEM(Gibco，USA)稀釋至40ml。

(3)將上述液體先后用100目及200目濾網(wǎng)過濾，去未消化的組織。

(4)過濾后的含細胞的液體置于離心管中，配平后放置在低溫離心機內(nèi)，以離心力300Xg，溫度4±2℃，離心8分鐘。

停機后輕輕取出離心管置于試管架上，離心管內(nèi)容物分為二部分，上層為膠原酶、胰酶和α-MEM培養(yǎng)基，下層為組織碎塊與細胞混合物。

將上層膠原酶、胰酶和α-MEM培養(yǎng)基吸出。

(7)將所分離的人羊膜單個核細胞用α-MEM培養(yǎng)基稀釋后2000r/min離心10min洗二次。

2、細胞培養(yǎng)

將分離的人羊膜單個核細胞按個細胞/cm²接種于塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)于37℃，培養(yǎng)箱，培養(yǎng)液為人羊膜間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基(按實施例1制備)。24小時后換液，棄非貼壁細胞，以后每2～3天換液；待人羊膜間充質(zhì)干細胞生長到70～80％融合，用胰酶(Sigma，USA)消化(1～2分鐘)，按0.8×10⁴～1.0×10⁴個細胞/cm²傳代。每2～3天用該人羊膜間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基中傳代一次，使細胞濃度維持在5～10×10⁵個細胞/mL。每次傳代培養(yǎng)的條件均為37℃，傳代得到人羊膜間充質(zhì)干細胞。

圖1A為人羊膜間充質(zhì)干細胞剛貼壁時的情況，為形態(tài)呈細小的圓形。

圖1B為人羊膜間充質(zhì)干細胞開始生長時的情況，48小時后，細胞開始增殖，向長梭形轉(zhuǎn)變。

圖1C為人羊膜間充質(zhì)干細胞增殖后的情況，一周后細胞開始增殖形成大小不等的細胞集落。

實施例3：流式細胞檢測

一、方法

實施例2得到的人羊膜間充質(zhì)干細胞，用抗人CD73單克隆抗體(BioLegend，USA)通過流式細胞儀檢測人白細胞分化抗原CD73的表達情況，用抗人CD90單克隆抗體(BioLegend，USA)通過流式細胞儀檢測人白細胞分化抗原CD90的表達情況，用抗人單克隆抗體(BioLegend，USA)通過流式細胞儀檢測人白細胞分化抗原的表達情況，用抗人單克隆抗體(BioLegend，USA)通過流式細胞儀檢測人白細胞分化抗原的表達情況，用抗人白細胞抗原HLA-DR單克隆抗體(BioLegend，USA)通過流式細胞儀(型號FACSCaliburBD公司)檢測人白細胞抗原HLA-DR的表達情況。

二、結(jié)果

結(jié)果如圖2A、圖2B、圖2C、圖2D和圖2E所示，表明該人羊膜間充質(zhì)干細胞表達人白細胞分化抗原CD73、人白細胞分化抗原CD90和人白細胞分化抗原不表達人白細胞分化抗原和人白細胞抗原HLA-DR。流式細胞儀檢測結(jié)果表明該人羊膜間充質(zhì)干細胞的純度達到