本發(fā)明屬于干細(xì)胞治療技術(shù)領(lǐng)域，涉及從人胎盤羊膜制備上皮細(xì)胞的方法，還涉及由該方法制備獲得的人羊膜上皮細(xì)胞，以及它們的治療用途。

背景技術(shù)：

干細(xì)胞是再生醫(yī)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)，其有效的應(yīng)用是實(shí)現(xiàn)人類健康長壽、防癌抗衰、永保年輕狀態(tài)、持續(xù)提高生活質(zhì)量等終極夢想的有效方法。近年來，胚胎干細(xì)胞與成體干細(xì)胞在細(xì)胞生物學(xué)以及再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域倍受重視。然而，盡管胚胎干細(xì)胞具有其他細(xì)胞無法企及的全能性，但致瘤性、同種異體移植后的免疫排斥性以及無法避免的倫理爭議等因素在很大程度上限制了其在臨床的應(yīng)用，而成體干細(xì)胞在組織中含量較少，缺乏特異性的表面標(biāo)志的特點(diǎn)也成為其臨床應(yīng)用的桎梏。相較而言，人羊膜上皮細(xì)胞(Human Amniotic Epithelial Cells，hAECs)也具備胚胎干細(xì)胞特性，有較強(qiáng)的分化能力及可塑性，又沒有風(fēng)險(xiǎn)和倫理問題，且含量豐富，容易獲取，擁有諸多胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞不具備的優(yōu)點(diǎn)，從而成為現(xiàn)在國內(nèi)外研究和臨床應(yīng)用的熱點(diǎn)。

人羊膜上皮細(xì)胞因?yàn)槠錈o致瘤性、無免疫排斥性、安全性高、含量豐富、容易獲取、不引起倫理爭議而獲得醫(yī)學(xué)界廣泛好評。目前為止，人羊膜上皮細(xì)胞已經(jīng)應(yīng)用在多種疾病中，療效顯著。其中最為被研究者津津樂道的是其在自身免疫性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病方面的療效。羊膜上皮細(xì)胞可以分化成神經(jīng)細(xì)胞，分泌多種神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)營養(yǎng)因子來修復(fù)受損以及退化的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如：老年癡呆、帕金森氏病、多發(fā)性硬化、腦出血、腦中風(fēng)等，這是其他干細(xì)胞以及免疫細(xì)胞所不具備的。同時(shí)，人羊膜上皮細(xì)胞通過旁分泌表達(dá)廣譜抗炎因子，表達(dá)多種生長因子，來針對性的抑制自身免疫病的異常炎癥。這為自身免疫性疾病開辟了一種新的有針對性的治療方法。為自身免疫性疾病患者，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等帶來了更好的治療方法。除此之外，人羊膜上皮細(xì)胞對于非神經(jīng)系統(tǒng)的損傷性疾?。喝缣悄虿?、肺和肝的纖維化病變、心肌梗死、急性肝損傷、放射性損傷唾液腺、口腔頜骨缺損等疾病都有一定的療效。近期，國內(nèi)外的研究者都把研究目標(biāo)放在了卵巢早衰和角膜修復(fù)方面，所以，人羊膜上皮細(xì)胞的前景是不可估量的。

最新研究發(fā)現(xiàn)，人羊膜上皮細(xì)胞不但具備胚胎干細(xì)胞特性，有較強(qiáng)的分化能力及可塑性，同時(shí)又沒有涉及倫理問題的風(fēng)險(xiǎn)，且含量豐富，容易獲取，能完全滿足干細(xì)胞臨床應(yīng)用安全性、有效性、質(zhì)量可控性的條件要求，已成為繼胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞后又一個(gè)獨(dú)具特點(diǎn)的再生醫(yī)學(xué)和細(xì)胞治療臨床應(yīng)用的理想種子細(xì)胞。

羊膜位于胎兒絨毛膜的表面，包裹著羊水和胎兒，提供胚胎生長發(fā)育的環(huán)境，是胎盤的最內(nèi)層組織，是與發(fā)育中的胎兒聯(lián)系緊密的胚胎發(fā)育早期產(chǎn)物，也是母體與胎兒之間進(jìn)行物質(zhì)交換的重要組織。羊膜為半透明的薄膜，有韌性，無神經(jīng)、血管、淋巴管，包裹著羊水和胎兒，提供胚胎生長發(fā)育的環(huán)境。其厚度僅為0.02～0.5mm，由上皮層、基底層和基質(zhì)層(結(jié)締組織層)組成。

人羊膜上皮細(xì)胞是由胎盤靠近胎兒一側(cè)的羊膜組織分離而來的上皮細(xì)胞，具有多能干性、有無限增殖性和抗炎特性，無致瘤性和免疫原性，經(jīng)國內(nèi)國際眾多科學(xué)家的多年研究論證，它具備以下特點(diǎn)：

全組織分化能力：羊膜上皮細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞具有同一發(fā)育組織來源，具有多能干性，有較強(qiáng)的分化能力及可塑性；可向三胚層中的多種組織類型細(xì)胞分化；可分化為外胚層來源的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；中胚層來源的骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肌細(xì)胞；以及內(nèi)胚層來源的肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞；羊膜上皮細(xì)胞具有向三個(gè)胚層分化的潛能，羊膜上皮細(xì)胞可表達(dá)早期干細(xì)胞的一些標(biāo)記，這說明既然羊膜形成于胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育早期，就有可能保留未成熟低分化的干細(xì)胞，仍保留多分化潛能；目前，已有越來越多的研究結(jié)果表明，人羊膜上皮細(xì)胞在體外很容易誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，也可不經(jīng)體外誘導(dǎo)，直接移植到體內(nèi)治療神經(jīng)損傷及退行性疾??；因此，在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷方面，羊膜上皮細(xì)胞顯然具有更多的向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能；

無致瘤性：與干細(xì)胞相比，羊膜上皮細(xì)胞缺乏端粒酶，這決定了其在體外擴(kuò)增不超過6代，具有有限的體外增值能力，而且使其不像胚胎干細(xì)胞或其它干細(xì)胞那樣會(huì)在體內(nèi)產(chǎn)生畸胎瘤或其它腫瘤；正是由于羊膜上皮細(xì)胞的這個(gè)特點(diǎn)，使其可成功避免干細(xì)胞臨床應(yīng)用的致瘤性問題，增殖受限和無致瘤性的特點(diǎn)保證了羊膜上皮細(xì)胞治療的安全性；

無需配型：羊膜上皮細(xì)胞不表達(dá)MHC-Ⅱ類抗原，具有免疫耐受能力，移植時(shí)無需HLA或基因配型；

無排斥性：羊膜上皮細(xì)胞缺乏主要組織相容性復(fù)合體抗原，同時(shí)還表達(dá)具有免疫抑制活性的HLA抗原，因此移植后不會(huì)產(chǎn)生免疫原性；由于羊膜組織是來源于胎兒的產(chǎn)物，暴露于母體免疫系統(tǒng)監(jiān)視下，使得移植后不會(huì)產(chǎn)生免疫原性；此外，人羊膜上皮細(xì)胞同時(shí)表達(dá)具有免疫抑制活性HLA-E、-G抗原；正是由于羊膜上皮細(xì)胞這些特點(diǎn)，使其臨床治療時(shí)可多次輸注而不會(huì)引起任何免疫排斥反應(yīng)；

超強(qiáng)的神經(jīng)修復(fù)能力：羊膜上皮細(xì)胞具有干細(xì)胞旁分泌功能，能夠分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF、BDNF、NT3等)、神經(jīng)遞質(zhì)和生長因子，能促使宿主自身神經(jīng)干細(xì)胞功能的活躍及自身修復(fù)，可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長，修復(fù)神經(jīng)損傷；神經(jīng)發(fā)育生物學(xué)研究認(rèn)為神經(jīng)發(fā)生早期，羊膜組織直接與神經(jīng)上皮聯(lián)系，向羊水中釋放神經(jīng)遞質(zhì)及神經(jīng)營養(yǎng)因子，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起著重要作用；羊膜上皮細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞生物化學(xué)方面的特性，能合成和分泌多巴胺(DA)，細(xì)胞膜上表達(dá)多巴胺受體D1和D2，質(zhì)膜上也有多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)；此外，羊膜上皮細(xì)胞能分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子(如BDNF、NT-3、NGF等)和其他神經(jīng)遞質(zhì)與調(diào)質(zhì)(如兒茶酚胺、乙酰膽堿、去甲腎上腺素、組胺、五羥色胺、尿緊張素、神經(jīng)緊張素和生長激素抑制素等)；羊膜上皮細(xì)胞不僅能自身分化神經(jīng)組織，而且也能分泌多種神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)營養(yǎng)因子，促使宿主自身干細(xì)胞功能的活躍及自身修復(fù)；

獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)能力：羊膜上皮細(xì)胞能分泌表達(dá)多種抗炎癥因子和相關(guān)蛋白，能抑制淋巴細(xì)胞的增殖，可用于炎癥性、成纖維性和自身免疫性疾病的細(xì)胞治療；其分泌的免疫抑制因子則對自身免疫性疾病及亞健康人群的免疫調(diào)節(jié)具有較好的效果；

加快組織修復(fù)能力：羊膜上皮細(xì)胞分泌的生長因子(EGF、TGF、IGF等)，不但可促進(jìn)血管上皮細(xì)胞修復(fù)，促進(jìn)損傷區(qū)的毛細(xì)血管的生成，增加膠原蛋白合成能力，而且能激活體內(nèi)休眠狀態(tài)的自體干細(xì)胞向體內(nèi)損傷部位遷移、聚集及轉(zhuǎn)化，從而加速血管生長，加快組織修復(fù)；

倫理認(rèn)同、來源廣泛：羊膜上皮細(xì)胞來源于新生兒產(chǎn)后廢棄物羊膜，為胎盤表面一層可剝離的生物膜，沒有胚胎干細(xì)胞應(yīng)用帶來的倫理學(xué)問題；此外，容易大量獲得細(xì)胞，易于質(zhì)量控制，一張羊膜至少可獲1×108個(gè)羊膜上皮細(xì)胞，而一個(gè)病人單次治療僅需1×107個(gè)，也就是說一張羊膜滿足多個(gè)病人使用。

已經(jīng)有諸多關(guān)于羊膜上取細(xì)胞的制備方法的報(bào)道。例如

CN104818244A(中國專利申請?zhí)?01510263291.8，天晴)公開了一種羊膜上皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)的方法，其特征在于該方法是按以下步驟完成的：一、羊膜組織分離和消毒：將羊膜自胎盤上剝離，然后用生理鹽水沖洗2～3遍，再在含有1％～3％頭孢哌酮的生理鹽水中浸泡3～10min；二、羊膜上皮細(xì)胞分離：將羊膜裁剪成50～150cm²的塊狀，然后將裁剪后羊膜的上皮面朝上貼敷于無菌硝酸纖維膜上，向培養(yǎng)皿A中加入3～10mL生理鹽水，再將羊膜的上皮面朝下貼置在培養(yǎng)皿A中，靜置2～3min，獲得羊膜貼片；將羊膜貼片置于培養(yǎng)皿B中，加入10～30ml質(zhì)量濃度為0.25％的胰酶-EDTA消化15～20min，然后封口膜封口后將培養(yǎng)皿放入恒溫?fù)u床中消化，得到消化液，再加入2～5ml胎牛血清終止酶反應(yīng)，然后去除羊膜貼片上團(tuán)聚、黏連的羊膜上皮細(xì)胞，再將羊膜貼片轉(zhuǎn)移至裝有生理鹽水的培養(yǎng)皿C中，清洗貼壁的羊膜上皮細(xì)胞，得到清洗液，收集消化液和清洗液，經(jīng)100目細(xì)胞篩過濾，獲得羊膜上皮細(xì)胞單細(xì)胞懸液；三、羊膜上皮細(xì)胞純化培養(yǎng)：將步驟二獲得的羊膜上皮細(xì)胞單細(xì)胞懸液在4℃、1500rpm的條件離心5～15min，棄上清，然后加入含有表皮生長因子的低糖DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，混勻后按0.9～1.1×10⁵/cm²的接種量接種于培養(yǎng)瓶中，再置于37℃、CO₂體積濃度為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合率達(dá)到85％后，棄除非貼壁細(xì)胞，并用生理鹽水沖洗2次，然后加入質(zhì)量濃度為0.05％的胰酶-EDTA消化，37℃消化2～5min，棄除消化液，再用生理鹽水沖洗1～2次，然后加入質(zhì)量濃度為0.25％的胰酶-EDTA，在37℃條件下消化3～6min，再加入FBS終止酶反應(yīng)，收集消化液，將消化液在4℃、1500rpm旋轉(zhuǎn)震蕩的條件下離心5～15min，棄上清，然后加入DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，得到高純度P0代羊膜上皮細(xì)胞單細(xì)胞懸液，即完成。據(jù)信該發(fā)明羊膜組織制成羊膜貼片后可以保證羊膜上皮面平整，同時(shí)羊膜背面粘液與結(jié)締組織與硝酸纖維膜緊密貼合，促進(jìn)胰酶消化效率和細(xì)胞與組織的分離，短時(shí)間消化即可收集全部羊膜上皮細(xì)胞，避免了細(xì)胞貼壁率的降低，短時(shí)間培養(yǎng)后進(jìn)行兩次胰酶消化，獲得了高純度羊膜上皮細(xì)胞。據(jù)信該發(fā)明可應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床移植領(lǐng)域。

CN104371971A(中國專利申請?zhí)?01310357351.3，協(xié)和)公開了一種分離獲得羊膜上皮細(xì)胞的方法，該方法包括：將羊膜組織加入膠原酶溶液孵育；然后將羊膜組織加入胰蛋白酶溶液進(jìn)行消化；終止消化并過濾；將上清液離心后獲得羊膜上皮細(xì)胞。本發(fā)明操作簡單，且能保持細(xì)胞原有活性及生長狀態(tài)，提高羊膜上皮細(xì)胞的得率。

CN104974980A(中國專利申請?zhí)?01510261707.2，重慶)公開了一種人類羊膜上皮細(xì)胞的分離方法，包括以下步驟：第一步，采集運(yùn)輸胎盤，先將采集到的新鮮胎盤放入盛有0.9％質(zhì)量濃度生理鹽水的無菌塑料袋中，密封后放入保護(hù)盒中；再將保護(hù)盒放入溫度為2℃～8℃的運(yùn)輸箱中，并在12小時(shí)內(nèi)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞分離室；此過程保證了胎盤組織的新鮮及羊膜上皮細(xì)胞的活性，為接下來的分離培養(yǎng)分離提供質(zhì)量保證；第二步，撕取羊膜，細(xì)胞分離人員將接收到的新鮮胎盤放置在圓盤中，先用生理鹽水沖洗新鮮胎盤表面，再從新鮮胎盤上完整的撕下羊膜；第三步，沖洗羊膜，先將撕下的羊膜放入腎形盤中展開沖洗，并用止血鉗去除羊膜上的血絲，再用生理鹽水反復(fù)沖洗至少5次，直至羊膜干凈；第四步，剪裁羊膜，先將沖洗干凈的羊膜剪裁成圓形，圓形直徑大小較相應(yīng)培養(yǎng)皿直徑大3～4cm，將圓形的羊膜上皮面朝上覆蓋于培養(yǎng)皿上，并且圓形的羊膜邊緣必須在培養(yǎng)皿邊緣之上；這樣操作為了確保在接下來的消化過程中胰蛋白酶只單獨(dú)接觸羊膜上皮面；第五步，消化羊膜上皮面，將0.25％質(zhì)量濃度的胰蛋白酶液加入到覆蓋有羊膜的培養(yǎng)皿中，直至胰蛋白酶液接近裝滿培養(yǎng)皿，在使羊膜上皮面充分接觸胰蛋白酶同時(shí)，羊膜的其他部位接觸不到胰蛋白酶；在37℃恒溫靜止消化40～80分鐘；消化時(shí)間的長短因不同個(gè)體羊膜的厚度、面積等不同而有所變化；第六步，終止消化，消化結(jié)束后，先用移液管將培養(yǎng)皿中的胰蛋白酶液吸出并棄之，再用移液槍加入含10％體積濃度胎牛血清的EMDM-F12培養(yǎng)液，并用移液槍吹打培養(yǎng)皿中的羊膜上皮面，使上面的經(jīng)過消化的羊膜上皮細(xì)胞脫離羊膜進(jìn)入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，經(jīng)過反復(fù)吹打直至細(xì)胞培養(yǎng)液變的渾濁，然后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液置于50ml離心管中；此步驟重復(fù)3～5次，以便分離下更多的羊膜上皮細(xì)胞；第七步，離心收集細(xì)胞，將收集到的細(xì)胞培養(yǎng)液在離心機(jī)上，以300～500g離心力離心5～10分鐘；第八步，羊膜上皮細(xì)胞重懸并接種培養(yǎng)，離心后棄去上清液，離心管底部的羊膜上皮細(xì)胞沉淀用10mlEMDM-F12培養(yǎng)液重懸，取少量懸液用于細(xì)胞計(jì)數(shù)、活率檢測以及流式檢測，以1.0～1.3×10⁵/cm²的密度接種細(xì)胞。據(jù)信該發(fā)明能分離得到高純度的羊膜上皮細(xì)胞，且細(xì)胞數(shù)量多、活性高，為羊膜上皮細(xì)胞的研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

CN104371970A(中國專利申請?zhí)?01310355824.6，協(xié)和)公開了一種用于培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于該培養(yǎng)基由DMEM、胎牛血清、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺、EGF、β-巰基乙醇和非必需氨基酸組成；其中DMEM的含量為10g/1000ml；其中胎牛血清的體積含量為5～15％；其中丙酮酸鈉的含量為0.0550～0.2200g/1000ml；其中L-谷氨酰胺的含量為0.0731～0.2193g/1000ml；其中β-巰基乙醇的含量為1.9287～5.7861g/1000ml；其中EGF的含量為5～15ng/ml；其中非必需氨基酸為L-丙氨酸、L-天門冬酰胺、L-天冬氨酸L、L-谷氨酸、甘氨酸L、L-脯氨酸和L--絲氨酸中組成；非必需氨基酸的含量為0.5～2mM。據(jù)信該發(fā)明的培養(yǎng)基適用于人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，尤其適用于原代人羊膜上皮細(xì)胞的分離和純化過程中的培養(yǎng)，同時(shí)可以降低移植人體過程中引發(fā)免疫反應(yīng)的幾率。

CN103642751A(中國專利申請?zhí)?01310650384.7，同澤)公開了一種從人羊膜中制取干細(xì)胞的方法，具體指一種羊膜中分離上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞方法，涉及細(xì)胞分離技術(shù)領(lǐng)域。通過自制的無菌、高效、穩(wěn)定的胎盤保護(hù)液對胎盤進(jìn)行采集，利用消化法和爬片法的組合，將羊膜上皮細(xì)胞與羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離開來，分別得到高純度的羊膜上皮細(xì)胞和羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在人羊膜采集污染率高、采集后的細(xì)胞活性差，直接影響了后續(xù)的細(xì)胞分離及培養(yǎng)的問題。是對從人羊膜中分離干細(xì)胞的方法進(jìn)行改良和創(chuàng)新，形成了一套標(biāo)準(zhǔn)化的分離方案，能夠更穩(wěn)定，充分利用羊膜的干細(xì)胞資源，無污染，純度高，細(xì)胞數(shù)量更多，在保持細(xì)胞活性的同時(shí)，保證了干細(xì)胞的原始特性。

CN105420179A(中國專利申請?zhí)?01510963676.5，斯坦姆)公開了一種從臍帶和胎盤羊膜組織同時(shí)提取上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于：步驟如下：⑴臍帶和胎盤羊膜取材和接種：①高溫消毒手術(shù)器械和大玻璃皿，同時(shí)紫外線消毒超凈工作臺；②配制培養(yǎng)基：完全培養(yǎng)基的組成是：DMEM/F12加完全培養(yǎng)基總體積5％的胎牛血清、完全培養(yǎng)基總體積1％的胰島素、鐵傳遞蛋白和硒的混合添加物，完全培養(yǎng)基中終濃度為20毫微克/毫升的表皮生長因子和完全培養(yǎng)基中終濃度為20毫微克/毫升的堿性纖維母細(xì)胞生長因子，無菌過濾，4℃保存；所述DMEM/F12中DMEM：F12的體積比為1:1；所述混合添加物及在混合添加物中的終濃度為胰島素5微克/毫升、鐵傳遞蛋白10微克/毫升和亞硒酸鈉5毫微克/毫升；③嚴(yán)格篩選供者，血液化驗(yàn)排除傳染??；④低溫冰盒中運(yùn)送臍帶和胎盤：機(jī)械剝離胎盤羊膜之后，將臍帶和胎盤羊膜分別置于大玻璃皿中，以下步驟都在無菌條件下進(jìn)行，將臍帶剪成1cm長的小段，將胎盤羊膜剪成約5X5cm長的方塊，用磷酸緩沖鹽水+總體積1％的青霉素+總體積1％的鏈霉素清洗組織兩次，洗干凈臍帶的血液；⑤將臍帶和胎盤羊膜組織放在4℃的磷酸緩沖鹽水中，以防止組織在機(jī)械剪碎時(shí)過熱而影響到細(xì)胞存活，使用組織剪碎機(jī)來分別破碎成1-3mm的碎塊，使用低速破碎組織，同時(shí)保持細(xì)胞活性，得到破碎的臍帶和羊膜組織；⑥將破碎的臍帶和羊膜組織分別轉(zhuǎn)移到T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并用組織刮取器將其平鋪于培養(yǎng)瓶底，小心加入少量完全培養(yǎng)基，使培養(yǎng)液既能覆蓋破碎的臍帶和羊膜組織塊，又不至于使其漂浮起來，置于37℃、飽和濕度5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；⑵間充質(zhì)干細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增和傳代：①培養(yǎng)過程中觀察可見細(xì)胞從組織塊逐漸游移出來，并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)貼壁生長和增殖，在培養(yǎng)的第3-4天、當(dāng)細(xì)胞生長融合成片時(shí)，用無菌磷酸緩沖鹽水洗去殘存的組織，全部換為新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；②此后每4天換一次培養(yǎng)液直到細(xì)胞長滿90-100％培養(yǎng)瓶底面積，便進(jìn)行胰酶消化傳代；③胰酶消化傳代：倒棄培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞2次，每T175用10毫升質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.25％的胰酶-EDTA在37℃消化10分鐘，待細(xì)胞懸浮后每個(gè)T175加入1毫升胎牛血清以中和胰酶反應(yīng)，1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，再懸浮于完全培養(yǎng)基中，按1：4細(xì)胞數(shù)比例傳代到新T175培養(yǎng)瓶中；⑶間充質(zhì)干細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞的鑒定：①胰酶消化傳到第三代時(shí)，用流式細(xì)胞儀鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的純度：羊膜上皮細(xì)胞的標(biāo)記物包括：角蛋白CK19，CD29，和CD34；胎盤和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記物包括：CD73，CD90，和CD105；②流式細(xì)胞儀驗(yàn)證細(xì)胞純度達(dá)到90％以上，化驗(yàn)排除常見的傳染病，并排除細(xì)菌，支原體污染，即是符合標(biāo)準(zhǔn)，即得上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的混合物。據(jù)信該發(fā)明的方法成本低、簡單快速，使用組織剪碎機(jī)來將臍帶和胎盤羊膜剪碎成極小的碎塊，極為利于直接接種到培養(yǎng)瓶之后細(xì)胞向組織外游移；不使用任何蛋白酶試劑，從而大幅度地降低成本，減少制備時(shí)間，使得短時(shí)間大規(guī)模細(xì)胞制備成為現(xiàn)實(shí)；該方法使用添加生長因子及其它營養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)基，節(jié)省了血清。

然而，本領(lǐng)域仍然期待有新的方法來制備人羊膜上皮細(xì)胞，并且期待這種方法呈現(xiàn)出一種或者多種有益的技術(shù)效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種從胎盤羊膜制備人羊膜上皮細(xì)胞的方法，期待該方法呈現(xiàn)出一種或者多種有益的技術(shù)效果。

本發(fā)明第一方面提供了一種從胎盤羊膜制備人羊膜上皮細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟：

(1)從胎盤樣品采集盒中取出胎盤，置于白瓷盤中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)沖洗表面，對胎盤進(jìn)行消毒處理；

(2)用手術(shù)鑷慢慢撕取胎膜外層羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)清洗表面污血，剪碎成直徑為5mm的羊膜組織小塊；

(3)羊膜小塊均勻貼于100mm培養(yǎng)皿，羊膜上皮層朝下，晾干30-60min后，緩慢添加完全培養(yǎng)基，沒過組織；在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(4)2天后補(bǔ)液(即補(bǔ)充上述完全培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)；待能夠看到明顯的卵圓形上皮細(xì)胞爬出(通常約6天左右，還可見部分間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞)，去組織，換液(即上述完全培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)；

(5)待出現(xiàn)多處典型的上皮細(xì)胞群(10d左右)，呈鋪路石樣緊密排列，局部融合率達(dá)90％時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)(體視顯微鏡鏡下挑取羊膜上皮細(xì)胞于離心管中，吹散，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按3000/cm²接種至培養(yǎng)瓶中，使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng))；

(6)收獲：用胰酶消化液消化后收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，凍存，即得P1代的人羊膜上皮細(xì)胞，必要時(shí)對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中所述基礎(chǔ)平衡鹽溶液中包括鏈霉素和青霉素兩種抗生素。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中所述基礎(chǔ)平衡鹽溶液是通過如下方式配制得到的：將0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的鏈霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中步驟(3)中所述完全培養(yǎng)基包括：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10％FBS、10mg/L表皮生長因子(EGF)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的完全培養(yǎng)基中還添加了0.01～0.05％(例如0.01～0.04％、例如0.01～0.03％)硝酸硫胺和0.05～0.1％(例如0.06～0.1％、例如0.07～0.1％)麥芽糖。已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)基中添加微量的硝酸硫胺和麥芽糖兩者后，可以顯示地提高人羊膜上皮細(xì)胞的產(chǎn)量，而不使用它們二者或者僅增添其中之一時(shí)無法獲得這種效果。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中步驟(4)中，繼續(xù)培養(yǎng)至能夠看到明顯的卵圓形上皮細(xì)胞爬出，此時(shí)培養(yǎng)約5～7天，通常約6天，并且此時(shí)還可見部分間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中步驟(5)中，出現(xiàn)多處典型的上皮細(xì)胞群時(shí)為培養(yǎng)約8～12天，通常約10天左右。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中步驟(5)中，傳代培養(yǎng)是照如下操作進(jìn)行的：體視顯微鏡鏡下挑取羊膜上皮細(xì)胞于離心管中，吹散，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按3000/cm²接種至培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng))；

根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中步驟(5)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。

進(jìn)一步的，本發(fā)明第二方面提供了一種人羊膜上皮細(xì)胞，其是通過本發(fā)明第一方面所述方法制備得到的。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的人羊膜上皮細(xì)胞，其是通過包括如下步驟的方法制備得到的：

(1)從胎盤樣品采集盒中取出胎盤，置于白瓷盤中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)沖洗表面，對胎盤進(jìn)行消毒處理；

(2)用手術(shù)鑷慢慢撕取胎膜外層羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)清洗表面污血，剪碎成直徑為5mm的羊膜組織小塊；

(3)羊膜小塊均勻貼于100mm培養(yǎng)皿，羊膜上皮層朝下，晾干30-60min后，緩慢添加完全培養(yǎng)基，沒過組織；在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(4)2天后補(bǔ)液(即補(bǔ)充上述完全培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)；待能夠看到明顯的卵圓形上皮細(xì)胞爬出(通常約6天左右，還可見部分間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞)，去組織，換液(即上述完全培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)；

(5)待出現(xiàn)多處典型的上皮細(xì)胞群(10d左右)，呈鋪路石樣緊密排列，局部融合率達(dá)90％時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)(體視顯微鏡鏡下挑取羊膜上皮細(xì)胞于離心管中，吹散，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按3000/cm²接種至培養(yǎng)瓶中，使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng))；

(6)收獲：用胰酶消化液消化后收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，凍存，即得P1代的人羊膜上皮細(xì)胞，必要時(shí)對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實(shí)施方案的人羊膜上皮細(xì)胞，其中所述基礎(chǔ)平衡鹽溶液中包括鏈霉素和青霉素兩種抗生素。

根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實(shí)施方案的人羊膜上皮細(xì)胞，其中所述基礎(chǔ)平衡鹽溶液是通過如下方式配制得到的：將0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的鏈霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。

根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實(shí)施方案的人羊膜上皮細(xì)胞，其中步驟(3)中所述完全培養(yǎng)基包括：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10％FBS、10mg/L表皮生長因子(EGF)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的完全培養(yǎng)基中還添加了0.01～0.05％(例如0.01～0.04％、例如0.01～0.03％)硝酸硫胺和0.05～0.1％(例如0.06～0.1％、例如0.07～0.1％)麥芽糖。

根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實(shí)施方案的人羊膜上皮細(xì)胞，其中步驟(4)中，繼續(xù)培養(yǎng)至能夠看到明顯的卵圓形上皮細(xì)胞爬出，此時(shí)培養(yǎng)約5～7天，通常約6天，并且此時(shí)還可見部分間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實(shí)施方案的人羊膜上皮細(xì)胞，其中步驟(5)中，出現(xiàn)多處典型的上皮細(xì)胞群時(shí)為培養(yǎng)約8～12天，通常約10天左右。

根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實(shí)施方案的人羊膜上皮細(xì)胞，其中步驟(5)中，傳代培養(yǎng)是照如下操作進(jìn)行的：體視顯微鏡鏡下挑取羊膜上皮細(xì)胞于離心管中，吹散，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按3000/cm²接種至培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng))；

根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實(shí)施方案的人羊膜上皮細(xì)胞，其中步驟(5)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。

進(jìn)一步的，本發(fā)明第三方面提供了本發(fā)明第二方面任一實(shí)施方案所述人羊膜上皮細(xì)胞在制備作為細(xì)胞治療劑的藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方案的用途，其中所述人羊膜上皮細(xì)胞是通過包括如下步驟的方法制備得到的：

(1)從胎盤樣品采集盒中取出胎盤，置于白瓷盤中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)沖洗表面，對胎盤進(jìn)行消毒處理；

(2)用手術(shù)鑷慢慢撕取胎膜外層羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)清洗表面污血，剪碎成直徑為5mm的羊膜組織小塊；

(3)羊膜小塊均勻貼于100mm培養(yǎng)皿，羊膜上皮層朝下，晾干30-60min后，緩慢添加完全培養(yǎng)基，沒過組織；在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(4)2天后補(bǔ)液(即補(bǔ)充上述完全培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)；待能夠看到明顯的卵圓形上皮細(xì)胞爬出(通常約6天左右，還可見部分間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞)，去組織，換液(即上述完全培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)；

(5)待出現(xiàn)多處典型的上皮細(xì)胞群(10d左右)，呈鋪路石樣緊密排列，局部融合率達(dá)90％時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)(體視顯微鏡鏡下挑取羊膜上皮細(xì)胞于離心管中，吹散，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按3000/cm²接種至培養(yǎng)瓶中，使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng))；

(6)收獲：用胰酶消化液消化后收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，凍存，即得P1代的人羊膜上皮細(xì)胞，必要時(shí)對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方案的用途，其中所述基礎(chǔ)平衡鹽溶液中包括鏈霉素和青霉素兩種抗生素。

根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方案的用途，其中所述基礎(chǔ)平衡鹽溶液是通過如下方式配制得到的：將0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的鏈霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。

根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方案的用途，其中步驟(3)中所述完全培養(yǎng)基包括：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10％FBS、10mg/L表皮生長因子(EGF)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的完全培養(yǎng)基中還添加了0.01～0.05％(例如0.01～0.04％、例如0.01～0.03％)硝酸硫胺和0.05～0.1％(例如0.06～0.1％、例如0.07～0.1％)麥芽糖。

根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方案的用途，其中步驟(4)中，繼續(xù)培養(yǎng)至能夠看到明顯的卵圓形上皮細(xì)胞爬出，此時(shí)培養(yǎng)約5～7天，通常約6天，并且此時(shí)還可見部分間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方案的用途，其中步驟(5)中，出現(xiàn)多處典型的上皮細(xì)胞群時(shí)為培養(yǎng)約8～12天，通常約10天左右。

根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方案的用途，其中步驟(5)中，傳代培養(yǎng)是照如下操作進(jìn)行的：體視顯微鏡鏡下挑取羊膜上皮細(xì)胞于離心管中，吹散，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按3000/cm²接種至培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng))；

根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方案的用途，其中步驟(5)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。

本發(fā)明任一方面或該任一方面的任一實(shí)施方案所具有的任一技術(shù)特征同樣適用其它任一實(shí)施方案或其它任一方面的任一實(shí)施方案，只要它們不會(huì)相互矛盾，當(dāng)然在相互之間適用時(shí)，必要的話可對相應(yīng)特征作適當(dāng)修飾。下面對本發(fā)明的各個(gè)方面和特點(diǎn)作進(jìn)一步的描述。

本發(fā)明所引述的所有文獻(xiàn)，它們的全部內(nèi)容通過引用并入本文，并且如果這些文獻(xiàn)所表達(dá)的含義與本發(fā)明不一致時(shí)，以本發(fā)明的表述為準(zhǔn)。此外，本發(fā)明使用的各種術(shù)語和短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對這些術(shù)語和短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術(shù)語和短語如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準(zhǔn)。

通常地講，一個(gè)胎盤羊膜的面積約600平方厘米，本發(fā)明羊膜干細(xì)胞即取材于胎盤上的羊膜。

本發(fā)明完全培養(yǎng)基中添加了EGF(表皮生長因子)，能夠更有效促進(jìn)了羊膜上皮細(xì)胞的增殖。在貼壁培養(yǎng)過程中，不可避免會(huì)長出成纖維細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞，本發(fā)明采取挑克隆的方法高效提高了羊膜上皮細(xì)胞的純度，且更利于羊膜上皮細(xì)胞的傳代生長。本發(fā)明方法的整個(gè)流程操作簡單，可控，P1代即可收獲大量細(xì)胞，為臨床應(yīng)用和研究提供了可能。

CK19是上皮細(xì)胞標(biāo)志物的典型特征性生物標(biāo)志物。已以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所得人羊膜上皮細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光染色檢測，結(jié)果均顯示，原代和1-3代培養(yǎng)細(xì)胞均高表達(dá)上皮標(biāo)志CK19，但不表達(dá)波形蛋白，證明本發(fā)明所分離的細(xì)胞為hAECs。此外，針對本發(fā)明獲得的流式檢測顯示：CD9、CD73、CD90、Nanog為陽性，CD34、CD45、HLA-DR陰性；誘導(dǎo)分化結(jié)果顯示其：成軟骨、成脂、成骨為陽性。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過使用本發(fā)明方法，每400平方厘米羊膜可以得到10⁸個(gè)以上的人羊膜上皮細(xì)胞。

附圖說明

圖1顯示了本發(fā)明所得人羊膜上皮細(xì)胞顯微圖(200X)。

具體實(shí)施方式

通過下面的實(shí)施例可以對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實(shí)施例。本領(lǐng)域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾。本發(fā)明對試驗(yàn)中所使用到的材料以及試驗(yàn)方法進(jìn)行一般性和/或具體的描述。雖然為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)的描述。

本發(fā)明下文試驗(yàn)中所使用的材料例如其中所使用的試劑是本領(lǐng)域已知的，其可以采用公知方法配制或者直接從市場購得。

實(shí)施例1：從胎盤羊膜制備人羊膜上皮細(xì)胞

(1)從胎盤樣品采集盒中取出胎盤，置于白瓷盤中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液(將0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的鏈霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液，即得)反復(fù)沖洗表面，對胎盤進(jìn)行消毒處理；

(2)用手術(shù)鑷慢慢撕取胎膜外層羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)清洗表面污血，剪碎成直徑為5mm的羊膜組織小塊；

(3)羊膜小塊均勻貼于100mm培養(yǎng)皿，羊膜上皮層朝下，晾干30-60min(本試驗(yàn)45min)后，緩慢添加完全培養(yǎng)基(DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10％FBS、10mg/L表皮生長因子)，沒過組織；在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(4)2天后補(bǔ)液(即補(bǔ)充上述完全培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)；待能夠看到明顯的卵圓形上皮細(xì)胞爬出(通常約5～7天，本實(shí)驗(yàn)6天，還可見部分間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞)，去組織，換液(即上述完全培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)；

(5)待出現(xiàn)多處典型的上皮細(xì)胞群(通常約8～12天，本實(shí)驗(yàn)10d)，呈鋪路石樣緊密排列，局部融合率達(dá)90％時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)(體視顯微鏡鏡下挑取羊膜上皮細(xì)胞于離心管中，吹散，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按3000/cm²接種至培養(yǎng)瓶中，使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng))；

(6)收獲：用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化后收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，凍存，即得P1代的人羊膜上皮細(xì)胞，必要時(shí)對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

實(shí)施例2：從胎盤羊膜制備人羊膜上皮細(xì)胞

(1)從胎盤樣品采集盒中取出胎盤，置于白瓷盤中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液(將0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的鏈霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液，即得)反復(fù)沖洗表面，對胎盤進(jìn)行消毒處理；

(2)用手術(shù)鑷慢慢撕取胎膜外層羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)清洗表面污血，剪碎成直徑為5mm的羊膜組織小塊；

(3)羊膜小塊均勻貼于100mm培養(yǎng)皿，羊膜上皮層朝下，晾干30-60min(本試驗(yàn)30min)后，緩慢添加完全培養(yǎng)基(DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10％FBS、10mg/L表皮生長因子)，沒過組織；在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(4)2天后補(bǔ)液(即補(bǔ)充上述完全培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)；待能夠看到明顯的卵圓形上皮細(xì)胞爬出(通常約5～7天，本實(shí)驗(yàn)7天，還可見部分間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞)，去組織，換液(即上述完全培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)；

(5)待出現(xiàn)多處典型的上皮細(xì)胞群(通常約8～12天，本實(shí)驗(yàn)8d)，呈鋪路石樣緊密排列，局部融合率達(dá)90％時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)(體視顯微鏡鏡下挑取羊膜上皮細(xì)胞于離心管中，吹散，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按3000/cm²接種至培養(yǎng)瓶中，使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng))；

(6)收獲：用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化后收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，凍存，即得P1代的人羊膜上皮細(xì)胞，必要時(shí)對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

實(shí)施例3：從胎盤羊膜制備人羊膜上皮細(xì)胞

(1)從胎盤樣品采集盒中取出胎盤，置于白瓷盤中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液(將0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的鏈霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液，即得)反復(fù)沖洗表面，對胎盤進(jìn)行消毒處理；

(2)用手術(shù)鑷慢慢撕取胎膜外層羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)清洗表面污血，剪碎成直徑為5mm的羊膜組織小塊；

(3)羊膜小塊均勻貼于100mm培養(yǎng)皿，羊膜上皮層朝下，晾干30-60min(本試驗(yàn)60min)后，緩慢添加完全培養(yǎng)基(DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10％FBS、10mg/L表皮生長因子)，沒過組織；在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(4)2天后補(bǔ)液(即補(bǔ)充上述完全培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)；待能夠看到明顯的卵圓形上皮細(xì)胞爬出(通常約5～7天，本實(shí)驗(yàn)5天，還可見部分間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞)，去組織，換液(即上述完全培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)；

(5)待出現(xiàn)多處典型的上皮細(xì)胞群(通常約8～12天，本實(shí)驗(yàn)12d)，呈鋪路石樣緊密排列，局部融合率達(dá)90％時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)(體視顯微鏡鏡下挑取羊膜上皮細(xì)胞于離心管中，吹散，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按3000/cm²接種至培養(yǎng)瓶中，使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng))；

(6)收獲：用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化后收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，凍存，即得P1代的人羊膜上皮細(xì)胞，必要時(shí)對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例1～3的方法制備P1代的人羊膜上皮細(xì)胞，針對不同胎盤樣本，平均地講，每400平方厘米羊膜可以得到(1.73～2.21)×10⁸個(gè)人羊膜上皮細(xì)胞。但是經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例4～6的方法制備P1代的人羊膜上皮細(xì)胞，針對不同胎盤樣本，平均地講，每400平方厘米羊膜可以得到(7.46～9.38)×10⁸個(gè)人羊膜上皮細(xì)胞，顯著地高于實(shí)施例1～3方法。本發(fā)明在參照實(shí)施例4～6的補(bǔ)充試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)如果在完全培養(yǎng)基中硝酸硫胺和麥芽糖二者只添加其中的一種，則此時(shí)制備P1代的人羊膜上皮細(xì)胞，針對不同胎盤樣本，平均地講，每400平方厘米羊膜可以得到(1.32～1.97)×10⁸個(gè)人羊膜上皮細(xì)胞，這表明將硝酸硫胺和麥芽糖之一增補(bǔ)到完全培養(yǎng)基中無法有效地提高人羊膜上皮細(xì)胞的產(chǎn)量。此外，本發(fā)明人參考其它現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)，例如本發(fā)明已經(jīng)引用的專利文獻(xiàn)中的方法制備P1代(以P1代為比較參數(shù)，更具可比性)的人羊膜上皮細(xì)胞時(shí)，其平均每400平方厘米羊膜可以得到的人羊膜上皮細(xì)胞小于1.6×10⁸個(gè)。

實(shí)施例4：從胎盤羊膜制備人羊膜上皮細(xì)胞

(1)從胎盤樣品采集盒中取出胎盤，置于白瓷盤中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液(將0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的鏈霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液，即得)反復(fù)沖洗表面，對胎盤進(jìn)行消毒處理；

(2)用手術(shù)鑷慢慢撕取胎膜外層羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)清洗表面污血，剪碎成直徑為5mm的羊膜組織小塊；

(3)羊膜小塊均勻貼于100mm培養(yǎng)皿，羊膜上皮層朝下，晾干30-60min(本試驗(yàn)45min)后，緩慢添加完全培養(yǎng)基(DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10％FBS、10mg/L表皮生長因子、0.02％硝酸硫胺、0.085％麥芽糖)，沒過組織；在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(4)2天后補(bǔ)液(即補(bǔ)充上述完全培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)；待能夠看到明顯的卵圓形上皮細(xì)胞爬出(通常約5～7天，本實(shí)驗(yàn)6天，還可見部分間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞)，去組織，換液(即上述完全培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)；

(5)待出現(xiàn)多處典型的上皮細(xì)胞群(通常約8～12天，本實(shí)驗(yàn)10d)，呈鋪路石樣緊密排列，局部融合率達(dá)90％時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)(體視顯微鏡鏡下挑取羊膜上皮細(xì)胞于離心管中，吹散，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按3000/cm²接種至培養(yǎng)瓶中，使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng))；

(6)收獲：用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化后收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，凍存，即得P1代的人羊膜上皮細(xì)胞，必要時(shí)對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。圖1顯示了本實(shí)施例所得人羊膜上皮細(xì)胞顯微圖。

實(shí)施例5：從胎盤羊膜制備人羊膜上皮細(xì)胞

(1)從胎盤樣品采集盒中取出胎盤，置于白瓷盤中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液(將0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的鏈霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液，即得)反復(fù)沖洗表面，對胎盤進(jìn)行消毒處理；

(2)用手術(shù)鑷慢慢撕取胎膜外層羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)清洗表面污血，剪碎成直徑為5mm的羊膜組織小塊；

(3)羊膜小塊均勻貼于100mm培養(yǎng)皿，羊膜上皮層朝下，晾干30-60min(本試驗(yàn)30min)后，緩慢添加完全培養(yǎng)基(DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10％FBS、10mg/L表皮生長因子、0.01％硝酸硫胺、0.1％麥芽糖)，沒過組織；在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(4)2天后補(bǔ)液(即補(bǔ)充上述完全培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)；待能夠看到明顯的卵圓形上皮細(xì)胞爬出(通常約5～7天，本實(shí)驗(yàn)7天，還可見部分間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞)，去組織，換液(即上述完全培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)；

(5)待出現(xiàn)多處典型的上皮細(xì)胞群(通常約8～12天，本實(shí)驗(yàn)8d)，呈鋪路石樣緊密排列，局部融合率達(dá)90％時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)(體視顯微鏡鏡下挑取羊膜上皮細(xì)胞于離心管中，吹散，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按3000/cm²接種至培養(yǎng)瓶中，使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng))；

(6)收獲：用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化后收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，凍存，即得P1代的人羊膜上皮細(xì)胞，必要時(shí)對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

實(shí)施例6：從胎盤羊膜制備人羊膜上皮細(xì)胞

(1)從胎盤樣品采集盒中取出胎盤，置于白瓷盤中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液(將0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的鏈霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液，即得)反復(fù)沖洗表面，對胎盤進(jìn)行消毒處理；

(2)用手術(shù)鑷慢慢撕取胎膜外層羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)清洗表面污血，剪碎成直徑為5mm的羊膜組織小塊；

(3)羊膜小塊均勻貼于100mm培養(yǎng)皿，羊膜上皮層朝下，晾干30-60min(本試驗(yàn)60min)后，緩慢添加完全培養(yǎng)基(DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10％FBS、10mg/L表皮生長因子、0.03％硝酸硫胺、0.07％麥芽糖)，沒過組織；在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(4)2天后補(bǔ)液(即補(bǔ)充上述完全培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)；待能夠看到明顯的卵圓形上皮細(xì)胞爬出(通常約5～7天，本實(shí)驗(yàn)5天，還可見部分間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞)，去組織，換液(即上述完全培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)；

(5)待出現(xiàn)多處典型的上皮細(xì)胞群(通常約8～12天，本實(shí)驗(yàn)12d)，呈鋪路石樣緊密排列，局部融合率達(dá)90％時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)(體視顯微鏡鏡下挑取羊膜上皮細(xì)胞于離心管中，吹散，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按3000/cm²接種至培養(yǎng)瓶中，使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng))；

(6)收獲：用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化后收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，凍存，即得P1代的人羊膜上皮細(xì)胞，必要時(shí)對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

試驗(yàn)例1：羊膜上皮細(xì)胞的驗(yàn)證：

(一)、流式細(xì)胞儀

CD45檢測：準(zhǔn)備兩支流式管，編號，其中一支為質(zhì)控管一支為樣品管，將CD45的control試劑搖勻，向質(zhì)控管中加入20ul，再將CD45試劑搖勻，向樣品管中加入20ul的CD45試劑，然后將樣品震蕩搖勻，向兩支流式管中各加入600ul樣品，然后混勻，置于4℃左右避光孵育30分鐘，然后向質(zhì)控管和樣品管中分別加入1毫升PBS，混勻后1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240ul的PBS后混勻上機(jī)，檢測陽性結(jié)果≦2％則為合格，出具細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測合格報(bào)告。

HLA-DR檢測：準(zhǔn)備兩支流式管，編號，其中一支為質(zhì)控管一支為樣品管，將HLA-DR的control試劑搖勻，向質(zhì)控管中加入20ul，再將HLA-DR試劑搖勻，向樣品管中加入20ulHLA-DR試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600ul樣品，然后混勻，置于4℃左右避光孵育30分鐘，然后質(zhì)控管和樣品管中分別加入1毫升PBS，混勻后1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240ul的PBS后混勻上機(jī)，檢測陽性結(jié)果≦2％則為合格，出具細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測合格報(bào)告。

SSEA-4檢測：準(zhǔn)備兩支流式管，編號，其中一支為質(zhì)控管一支為樣品管，將SSEA-4的control試劑搖勻，向質(zhì)控管中加入20ul，再將SSEA-4試劑搖勻，向樣品管中加入20ulSSEA-4試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600ul樣品，然后混勻，置于4℃左右避光孵育30分鐘，然后質(zhì)控管和樣品管中分別加入1毫升PBS，混勻后1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240ul的PBS后混勻上機(jī)，檢測陽性結(jié)果≧80％則為合格，出具細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測合格報(bào)告。

(二)、熒光定量PCR(檢測Nanog、Oct4、Kcf4和SOX2基因的表達(dá)量，引物由專業(yè)基因公司合成)以下為操作步驟：

1.樣品RNA的抽提

①從-70℃冰箱取出細(xì)胞樣品后，放于冰上，后轉(zhuǎn)移至操凈臺，在細(xì)胞樣品管中迅速加入1毫升Trizol試劑。將此樣品管標(biāo)為1號管。待1號管中細(xì)胞融化后，用1毫升移液槍反復(fù)吹打直至看不見任何不溶物，吸取1毫升細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)移至2號干凈無RNA酶的EP離心管中，寫好與樣品對應(yīng)的編號。

②兩相分離：將已混合均勻的樣品放在掌上離心機(jī)離心3s,使管蓋的Trizol試劑進(jìn)入管內(nèi)。每1毫升的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2毫升的氯仿，蓋緊管蓋。將已蓋緊的2號EP管手動(dòng)劇烈震蕩15s，在15到30℃靜置5分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60％。

③RNA沉淀：小心地從離心機(jī)中拿出已離心好的樣品，放在超凈臺上。將2號管傾斜45°角，將水相上層轉(zhuǎn)移到3號干凈無RNA酶的離心管中，切勿碰到管壁和吸到中間層。加入等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，蓋緊管蓋，寫好與之對應(yīng)的編號。輕輕顛倒5次，使之混勻?；靹蚝笤?5到30℃靜置10分鐘后，于4℃下12000rpm離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

④RNA清洗：移去3號管中的上清液，每1毫升TRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1毫升的75％乙醇(75％乙醇用DEPC水配制)，清洗RNA沉淀。蓋緊管蓋，反復(fù)顛倒數(shù)次，使沉淀漂浮起來。室溫靜置5分鐘。然后將3號管4℃下7500rpm離心5分鐘。

⑤RNA干燥：盡可能的小心吸去3號管中所有乙醇溶液，切勿吸走沉淀。開風(fēng)機(jī)，風(fēng)干5-10分鐘左右。然后使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

⑥溶解RNA沉淀：加入適量的無RNase水，靜置5分鐘。在58℃的的水浴鍋中水浴8分鐘。從水浴鍋中取出溶解好的RNA，在漩渦振蕩器上震蕩10秒。獲得的3號管的RNA溶液保存于-80℃待用。

2.RNA質(zhì)量檢測(紫外吸收法測定)

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液的濃度和純度。

①濃度測定

A260下讀值為1表示40ug RNA/毫升。樣品RNA濃度(ug/毫升)計(jì)算公式為：A260×稀釋倍數(shù)×40ug/毫升。具體計(jì)算如下：

RNA溶于40ul DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495ul的TE中，測得A260＝0.21

RNA濃度＝0.21×100×40ug/毫升＝840ug/毫升或0.84ug/微升

取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35ul，剩余RNA總量為：

35ul×0.84ug/ul＝29.4ug

②純度檢測

RNA溶液A260和A280兩數(shù)值的比值即為RNA純度，質(zhì)量合格的RNA溶液的A260/A280比值范圍應(yīng)為1.8到2.1。

通過本試驗(yàn)例1的測試方法測試本發(fā)明實(shí)施例1～6所得人羊膜上皮細(xì)胞，結(jié)果顯示上述測試的各參數(shù)均與人羊膜上皮細(xì)胞典型特征相符。例如，經(jīng)流式檢測，實(shí)施例1～6所得人羊膜上皮細(xì)胞表面標(biāo)識物SSEA-4百分率均在94％以上。另外，采用本領(lǐng)域公知的方法測試本發(fā)明實(shí)施例1～6所得人羊膜上皮細(xì)胞的CK19、CD9、CD73、CD90、Nanog、CD34、CD45、HLA-DR，結(jié)果顯示這些標(biāo)志物均與人羊膜上皮細(xì)胞符合。特別是，例如，CK19、CD9、CD73、CD90、Nanog均呈陽性，而CD34、CD45、HLA-DR均呈陰性。另外，本發(fā)明實(shí)施例1～6所得人羊膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)果顯示其成軟骨、成脂、成骨均為陽性。