本發(fā)明屬于胚胎冷凍保存領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及Clusterin蛋白在胚胎冷凍保存中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在胚胎移植、體外受精、轉(zhuǎn)基因和克隆等胚胎生物技術(shù)中，往往會涉及到胚胎的冷凍保存，而如何能更好地冷凍胚胎，使得胚胎在解凍之后能夠依然能夠正常發(fā)育，一直以來備受關(guān)注。
在當前的胚胎冷凍方法中經(jīng)常采用抗凍保護劑。采用抗凍保護劑主要是為了防止細胞在冷凍過程中受到損傷。抗凍保護劑多為滲透性小分子物質(zhì)，主要通過滲入細胞內(nèi)部，發(fā)生水合作用，使細胞內(nèi)溶液的黏性增加，從而保護細胞不受冷凍損傷。不同的抗凍保護劑由于其種類、濃度、分子大小、滲透能力、水活性及胞內(nèi)作用機理等各不相同，對細胞冷凍保存效果亦有差異。隨著抗凍液濃度的增加,滲入細胞內(nèi)的抗凍保護劑會隨之增多。通常，抗凍液本身具有毒性，濃度太高會在降溫前殺死細胞，而濃度過低又起不到對細胞的保護作用。
同時，現(xiàn)有技術(shù)也有數(shù)據(jù)表明，經(jīng)過冷凍的胚胎在移植時比鮮胚的產(chǎn)子率下降很多。這也說明冷凍或者冷凍保護劑的外在處理會使胚胎的后期發(fā)育受到或多或少的影響。
因此，本領(lǐng)域亟需一種新的胚胎冷凍方案，其能夠提高胚胎的抗凍性以及解凍復(fù)蘇率。另外地或可能地，該胚胎冷凍方案還可以降低抗凍保護劑的使用量，從而減少其對胚胎的毒副作用，實現(xiàn)有效的胚胎冷凍。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種新的胚胎冷凍方案，其能夠提高胚胎的抗凍性以及解凍復(fù)蘇率。另外地或可能地，該胚胎冷凍方案還可以降低抗凍保護劑的使用量，從而減少其對胚胎的毒副作用，實現(xiàn)有效的胚胎冷凍。
本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，先將胚胎在含有Clusterin蛋白的體外胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時間，然后再對其進行冷凍例如程序化冷凍，可以顯著地提高胚胎的抗凍性和解凍復(fù)蘇率。基于此發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人得到了如下發(fā)明：
第一方面，本發(fā)明提供了一種體外胚胎培養(yǎng)液，所述體外胚胎培養(yǎng)液包含Clusterin蛋白。
第二方面，本發(fā)明提供了一種提高胚胎抗凍性和解凍復(fù)蘇率的方法，包括在冷凍胚胎之前用根據(jù)本發(fā)明第一方面的體外胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)所述胚胎。
第三方面，本發(fā)明提供了一種冷凍胚胎的方法，包括以下步驟：用根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的體外胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)胚胎；并將經(jīng)培養(yǎng)的胚胎進行冷凍。
通過在體外胚胎培養(yǎng)基中添加Clusterin蛋白，并將待冷凍胚胎在該添加有Clusterin蛋白的體外胚胎培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，可以顯著地提高胚胎的抗凍性和解凍復(fù)蘇率。另外地或可能地，通過所述培養(yǎng)程序，可以減少在冷凍液中使用的抗凍保護劑的量，從而減少其對胚胎的毒副作用。
具體實施方式
下面對本發(fā)明的具體技術(shù)方案作進一步清楚和完整的描述。需要理解的是，本文中具體描述的技術(shù)方案僅用于示例目的，無意于以任何方式對本發(fā)明的保護范圍進行限制。在不背離本發(fā)明的精神和宗旨的情況下，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改。本發(fā)明的保護范圍由隨附的權(quán)利要求書來進行限定。
如上文所述，本發(fā)明的目的在于提供一種新的胚胎冷凍方案，其能夠提高胚胎的抗凍性以及解凍復(fù)蘇率；另外地或者可能地，還可以降低抗凍保護劑的使用量，從而減少其對胚胎的毒副作用，實現(xiàn)有效的胚胎冷凍。
通過將胚胎在含有Clusterin蛋白的體外胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時間，然后再對其進行冷凍，例如程序化冷凍，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，胚胎的抗凍性和解凍復(fù)蘇率得到了顯著提高?；诖税l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人得到了如下發(fā)明：
第一方面，本發(fā)明提供了一種體外胚胎培養(yǎng)液，所述體外胚胎培養(yǎng)液包含Clusterin蛋白。
除了Clusterin蛋白之外，所述體外胚胎培養(yǎng)液還包含選自CZB培養(yǎng)基、MTF培養(yǎng)基、KSOM培養(yǎng)基、CR1培養(yǎng)基和CR2培養(yǎng)基中的任何一種培養(yǎng)基。
CZB培養(yǎng)基是一種可以使多種品系的小鼠受精后胚胎發(fā)育至囊胚期的培養(yǎng)基，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于胚胎操作和各種小鼠克隆實驗中。
MTF培養(yǎng)基是一種以Krebs-Ring碳酸鹽溶液為基礎(chǔ)的著床前胚胎培養(yǎng)基，其成分相當簡單，主要包括提供能量的丙酮酸鈉、乳酸鈉和葡萄糖，并且還包括血清白蛋白。
KSOM培養(yǎng)基是一種主要用于培養(yǎng)體外授精(IVF)的小鼠胚胎以及去核和電融合后重構(gòu)的B6C3F1小鼠卵子的培養(yǎng)基。
CR1培養(yǎng)基和CR2培養(yǎng)基是用于豬、牛、羊等物種后期胚胎的培養(yǎng)基，根據(jù)胚胎所處具體階段不同，具體配方略有調(diào)整。
在本發(fā)明中使用的Clusterin蛋白可以來源于任何物種，例如可以來源于哺乳動物如小鼠、大鼠、豬、牛、羊、或者靈長類動物例如人。
在本發(fā)明中使用的Clusterin蛋白可以通過任何方式獲得，例如可以通過分離提純獲得或者通過重組或者合成方式生產(chǎn)。舉例而言，由轉(zhuǎn)染有小鼠Clusterin基因并可正常表達Clusterin蛋白的HEK293細胞系(重組蛋白體外細胞表達系統(tǒng))來生產(chǎn)。從經(jīng)濟的角度上看，所述Clusterin蛋白優(yōu)選通過重組方式生產(chǎn)來獲得。
在一個實施方案中，所述Clusterin蛋白的濃度為10至30μg/μl。例如，所述Clusterin蛋白的濃度可以為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30μg/μl，或者由這些數(shù)值組成的任何濃度區(qū)間，例如12-28μg/μl、15-25μg/μl。優(yōu)選地，所述Clusterin蛋白的濃度為20μg/μl。
在冷凍胚胎前將胚胎在本發(fā)明第一方面的包含Clusterin蛋白的體外胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時間，可以顯著地提高胚胎的抗凍性和解凍復(fù)蘇率，該解凍復(fù)蘇率至少可以提高15％。
第二方面，本發(fā)明提供了一種提高胚胎抗凍性和解凍復(fù)蘇率的方法，包括在冷凍胚胎之前用本發(fā)明第一方面的體外胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)所述胚胎。
所述培養(yǎng)在37℃、5％CO2和100％濕度條件下進行，可以持續(xù)適當長的一段時間，例如可以持續(xù)4-8小時，如4、5、6、7或8小時，優(yōu)選地持續(xù)6小時。
所述胚胎可以是任何物種來源的胚胎。例如，所述胚胎可以是來源于哺乳動物例如小鼠、大鼠、豬、牛、羊、或者靈長類動物例如人的胚胎。
所述胚胎可以是處于任何適合冷凍時期的胚胎。例如，所述胚胎可以是處于4-細胞期至囊胚期的胚胎。
所述胚胎可以是通過任何方式例如體內(nèi)法或體外法獲得的胚胎。對于通過體內(nèi)法獲得的胚胎，可以示例的是，在非人哺乳動物本交或人工輸精后在母體中發(fā)育到例如4-細胞期至囊胚期時通過手術(shù)或非手術(shù)法從該母體中獲取的已受精胚胎。所述非人哺乳動物可以為例如小鼠、大鼠、豬、牛、羊或者不包括人在內(nèi)的靈長類動物。對于通過體外法獲得的胚胎，可以示例的是，對成熟卵母細胞采取體外授精方式例如孤雌激活或單精子注射等方式獲得的受精胚胎。所述成熟卵母細胞可以來源于任何物種，例如哺乳動物如小鼠、大鼠、豬、牛、羊、或者靈長類動物如人。
所述胚胎的物種來源與所述Clusterin蛋白的物種來源可以相同，也可以相同。優(yōu)選地，所述胚胎的物種來源與所述Clusterin蛋白的物種來源是相同的。在物種來源不相同的情況下，兩個物種產(chǎn)生的Clusterin蛋白之間應(yīng)該具有相同或者相似的功能。
第三方面，本發(fā)明提供了一種冷凍胚胎的方法，包括以下步驟：用本發(fā)明第一方面的體外胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)胚胎；并將該經(jīng)培養(yǎng)的胚胎進行冷凍。
所述培養(yǎng)在37℃、5％CO2和100％濕度條件下進行，可以持續(xù)適當長的一段時間，例如可以持續(xù)4-8小時，如4、5、6、7或8小時，優(yōu)選地持續(xù)6小時。
所述胚胎可以是任何物種來源的胚胎。例如，所述胚胎可以是來源于哺乳動物例如小鼠、大鼠、豬、牛、羊、或者靈長類動物例如人的胚胎。
所述胚胎可以是處于任何適合冷凍時期的胚胎。例如，所述胚胎可以是處于4-細胞期至囊胚期的胚胎。
所述胚胎可以是通過任何方式例如體內(nèi)法或體外法獲得的胚胎。對于通過體內(nèi)法獲得的胚胎，可以示例的是，在非人哺乳動物本交或人工輸精后在母體中發(fā)育到例如4-細胞期至囊胚期時通過手術(shù)或非手術(shù)法從該母體中獲取的已受精胚胎。所述非人哺乳動物可以為，例如，小鼠、大鼠、豬、牛、羊或者不包括人在內(nèi)的靈長類動物。對于通過體外法獲得的胚胎，可以示例的是，對成熟卵母細胞采取體外授精方式例如孤雌激活或單精子注射等方式獲得的受精胚胎。所述成熟卵母細胞可以來源于任何物種，例如哺乳動物如小鼠、大鼠、豬、牛、羊、或者靈長類動物如人。
所述胚胎的物種來源與所述Clusterin蛋白的物種來源可以相同，也可以相同。優(yōu)選地，所述胚胎的物種來源與所述Clusterin蛋白的物種來源是相同的。在物種來源不相同的情況下，兩個物種產(chǎn)生的Clusterin蛋白之間應(yīng)該具有相同或者相似的功能。
可以以任何合適的方式將經(jīng)培養(yǎng)的胚胎進行冷凍。本領(lǐng)域中采用的胚胎冷凍方法包括例如程序化冷凍法、快速冷凍法、玻璃化冷凍法等。
程序化冷凍法主要采用低濃度凍結(jié)保存劑梯度脫水，經(jīng)程序冷凍儀緩慢降溫。主要操作步驟包括：將胚胎順序放入一系列逐漸增加保存劑濃度的溶液中梯度脫水，再置入程序冷凍儀快速降溫至-5℃至-7℃植冰(人工誘導(dǎo)冰晶形成)，然后使程序冷凍儀緩慢降溫至-30℃至-80℃，之后如果需要的話進行液氮貯存。
玻璃化冷凍法是Rall和Fahy于1985年提出來的胚胎冷凍方法。玻璃化冷凍技術(shù)的基本原理就是用高濃度的冷凍保護劑溶液將細胞內(nèi)水分置換出來，經(jīng)急速降溫由液態(tài)轉(zhuǎn)化為外形似玻璃狀的非晶體化固體狀態(tài)。玻璃化冷凍法的主要操作步驟簡單，包括：高濃度的冷凍保護劑置換細胞內(nèi)外的溶液，快速降溫，使溶液黏稠度極度提高并固化，放置液氮保存。
一步冷凍法利用高濃度的抗凍劑使胚胎在冷凍前脫水，從而減少冷凍過程中細胞內(nèi)冰晶的形成。該方法的特點是胚胎在室溫脫水后不需要特殊的降溫程序，能在很短的時間內(nèi)完成冷凍過程，具有重要的實用價值。
在本發(fā)明中采用了程序化冷凍法，但是其他方法也可以使用。在本發(fā)明中采用的程序化冷凍法大體程序如下：在保護劑濃度遞增的溶液中梯度脫水，快速降溫(例如1℃/min)至-5℃至-7℃植冰，緩慢降溫(例如0.3℃/min)至-30℃至-80℃。如果需要長期冷凍，隨后可以將胚胎放入液氮中。
通過在體外胚胎培養(yǎng)基中添加Clusterin蛋白，并將待冷凍胚胎在該添加有Clusterin蛋白的體外胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時間，可以顯著地提高胚胎的抗凍性和解凍復(fù)蘇率。另外地或可能地，通過所述培養(yǎng)程序，可以減少在冷凍液中使用的抗凍保護劑的量，從而減少其對胚胎的毒副作用。
實施例
1材料
1.1主要儀器和設(shè)備
1.2主要試劑
1.2.1鼠源體外重組Clusterin蛋白，購自Abcam公司(貨號：ab194035)，其氨基酸序列如下：
EQEVSDNELQELSTQGSRYINKEIQNAVQGVKHIKTLIEKTNAERKSLLNSLEEAKKKKEDALEDTRDSEMKLKAFPEVCNETMMALWEECKPCLKHTCMKFYARVCRSGSGLVGQQLEEFLNQSSPFYFWMNGDRIDSLLESDRQQSQVLDAMQDSFARASGIIDTLFQDRFFARELHDPHYFSPIGFPHKRPHFLYPKSRLVRSLMSPSHYGPPSFHNMFQPFFEMIHQAQQAMDVQLHSPAFQFPDVDFLREGEDDRTVCKEIRRNSTGCLKMKGQCEKCQEILSVDCSTNNPAQANLRQELNDSLQVAERLTEQYKELLQSFQSKMLNTSSLLEQLNDQFNWVSQLANLTQGEDKYYLRVSTVTTHSSDSEVPSRVTEVVVKLFDSDPITVVLPEEVSKDNPKFMDTVAEKALQEYRRKSRAEVDHHHHHH
1.2.2 CZB培養(yǎng)基
(1)CZB儲液100mL配方
配制方法：將A液和B液混合，再用高壓后超純水定容至100mL。
(2)CZB工作液5mL配方
1.2.3含有Clusterin重組蛋白的體外胚胎培養(yǎng)液
將Clusterin重組蛋白添加至CZB工作液中，使其達到所需的終濃度例如10、20、30μg/μl。將該體外培養(yǎng)液保存于4℃。
1.3試驗材料
本實驗選用8～12周齡性成熟、體重為28g左右的ICR系小鼠，該小鼠購自北京維通利華實驗動物科技有限公司。
2方法
2.1小鼠休眠囊胚和正常孵化囊胚的獲取與收集
選擇陰門淡粉色的雌性小鼠，腹腔注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)，10IU/只。48小時后，再注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)，10IU/只。之后立即使該雌性小鼠與成年公鼠1:1合籠過夜交配，次日早8點檢查交配情況。見陰道栓后注射抗孕馬血清(A-PMSG)，10IU/只。
(a)休眠囊胚的獲取與收集
于見栓的第四天上午9～10點摘除小鼠的雙側(cè)卵巢，之后連續(xù)三天在其頸部皮下注射0.2mg/mL的孕酮，每次0.1mL。術(shù)后第四天9點處死小鼠，取下小鼠兩側(cè)子宮，用PBS工作液正反沖洗兩次，即可獲得休眠胚胎。
(b)正常孵化囊胚的獲取和收集
于見栓的第五天上午9點處死小鼠，取下小鼠兩側(cè)子宮，用PBS工作液沖出子宮中的正常孵化囊胚，即可獲得正常孵化囊胚。
2.2小鼠休眠囊胚和正常孵化囊胚的冷凍
將獲取的小鼠休眠囊胚和正常孵化囊胚(各100枚左右)用100μl PBS液滴清洗3遍，再用100μl CZB工作液清洗3遍，之后移入含20μg/μlClusterin重組蛋白的覆油CZB工作液液滴中，培養(yǎng)箱37℃、5％CO2空氣和100％濕度條件下體外培養(yǎng)6小時。
將培養(yǎng)后的胚胎用PBS工作液洗滌2遍，然后三步法脫去PBS，再放到冷凍液(Bioniche，ViGROTM，ETHYLENE GLYCOL FREEZE(with Sucrose)，Lot：150206-2P)中平衡5分鐘，用0.25ml塑料麥管裝取胚胎。將裝好的麥管置于冷凍儀中，以1℃/分鐘的速度降到-5℃，平衡10分鐘，期間用預(yù)冷的鑷子夾住裝有胚胎的麥管上端冷凍液處3-5秒出現(xiàn)冰晶即植冰完成，隨后再平衡10分鐘，以0.3℃/分鐘的速度降至-35℃。隨后，將冷凍麥管放入液氮中。
解凍時，把冷凍麥管從液氮中取出，室溫下輕輕晃動5-10秒后，投入35℃水中10-15秒取出。剪掉麥管兩端栓部，將細管里的胚胎置于表面皿中，按三步法脫去冷凍液，解凍復(fù)蘇后再放到平衡過的新CZB液滴中進行24小時的復(fù)蘇。24小時后統(tǒng)計胚胎的解凍復(fù)蘇率。
上文所述脫去PBS的三步法具體程序如下：在將胚胎浸入完全冷凍液中并裝管冷凍前，將胚胎依次在100μl的下述溶液的液滴中洗滌(每種溶液中分別洗滌3-5分鐘)：1/3冷凍液+2/3PBS、1/2冷凍液+1/2PBS、2/3冷凍液+1/3PBS。
上文所述脫去冷凍液的三步法具體程序如下：將胚胎依次在100μl的下述溶液的液滴中洗滌(每種溶液中分別洗滌3-5分鐘)：2/3冷凍液+1/3PBS、1/2冷凍液+1/2PBS、1/3冷凍液+2/3PBS。
3數(shù)據(jù)分析
所有實驗數(shù)據(jù)用SAS 9.0統(tǒng)計軟件進行卡方分析。
數(shù)據(jù)分析圖為GraphPad軟件制作。
4結(jié)果
4.1培養(yǎng)基中添加Clusterin重組蛋白對小鼠正常孵化囊胚及休眠胚胎的解凍復(fù)蘇率的影響
表1添加Clusterin重組蛋白培養(yǎng)后的囊胚的解凍復(fù)蘇率(％)
注：數(shù)值表示為平均值±標準差。不同大寫字母之間顯示為差異極其顯著(P<0.01)；不同小寫字母之間表示為差異顯著(P<0.05)；無標注為差異不顯著(P>0.05)。實驗重復(fù)三次。
6討論
在低溫條件下，Clusterin蛋白通過影響細胞膜的穩(wěn)定性來保護細胞，但是其具體機制尚不清楚。已有研究發(fā)現(xiàn)，Clusterin蛋白是一種細胞外的伴侶分子，與熱休克蛋白相似。在多種應(yīng)激狀態(tài)下其表達出現(xiàn)增加，并能作用于此環(huán)境中的不穩(wěn)定蛋白，進而形成穩(wěn)定的水溶性高分子復(fù)合物，組織自身沉淀并促使蛋白正確折疊。此外，之前的研究還發(fā)現(xiàn)Clusterin蛋白產(chǎn)生伴侶蛋白作用時不需要ATP提供能量，這暗示Clusterin蛋白可通過伴侶分子的作用來提高細胞膜的穩(wěn)定性，從而保護細胞。
在本研究中，對小鼠正常孵化囊胚和休眠囊胚體外添加一定濃度的Clusterin重組蛋白并進行培養(yǎng)，藉此探索Clusterin蛋白能否提高小鼠胚胎的抗凍性，進而實現(xiàn)該蛋白作為一種新型胚胎冷凍保護劑規(guī)?；瘧?yīng)用于胚胎冷凍技術(shù)。
本研究的結(jié)果表明，與在沒有添加Clusterin重組蛋白的體外胚胎培養(yǎng)基中培養(yǎng)過的對照相比較，在添加有Clusterin重組蛋白的體外胚胎培養(yǎng)基中培養(yǎng)過的小鼠囊胚的解凍復(fù)蘇率有著不同程度的升高，但是該升高程度在正常孵化囊胚和休眠囊胚之間存在一定的差異。具體地，小鼠正常孵化囊胚相對于其對照解凍復(fù)蘇率顯著提高(P<0.05)，而休眠囊胚相對于其對照解凍復(fù)蘇率略有升高但不顯著(P>0.05)。
以上結(jié)果說明，Clusterin蛋白對胚胎的抗凍性和解凍復(fù)蘇率有著顯著的影響。與常規(guī)的僅僅在冷凍液中添加抗凍保護劑的處理方式不同，本試驗比較特殊的地方在于：先將Clusterin蛋白添加到體外培養(yǎng)基例如CZB培養(yǎng)基中，然后將胚胎在該體外培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，之后對該培養(yǎng)過的胚胎進行冷凍。結(jié)果證明，經(jīng)Clusterin蛋白培養(yǎng)處理可以提高胚胎的抗凍性和解凍復(fù)蘇率，并且該提高效應(yīng)對于正常孵化囊胚而言是顯著的。
7結(jié)論
添加Clusterin蛋白能提高胚胎的抗凍性和解凍復(fù)蘇率，并且該提高效應(yīng)對于正常孵化囊胚而言是顯著的。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，本發(fā)明并不限于上述示例的細節(jié)，在不背離本發(fā)明的精神和宗旨的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到本文所描述技術(shù)方案的變化方案，并且該變化方案也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。本發(fā)明的保護范圍由隨附權(quán)利要求所限定。
另外，應(yīng)當理解，雖然本說明書通過實施方式來對本發(fā)明進行了描述，但是并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案。本說明書的這種敘述方案僅為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當將本說明書當作一個整體，各個實施方式中的技術(shù)方案可以適當組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其它實施方式。