RhoA重組蛋白在制備提高胚胎抗凍性以及解凍后復(fù)蘇率的培養(yǎng)液中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了RhoA重組蛋白在制備提高胚胎抗凍性以及解凍后復(fù)蘇率的培養(yǎng)液中的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠正常孵化胚胎的培養(yǎng)液中添加體外重組RhoA蛋白與對照組相比能夠顯著提高正常孵化胚胎的解凍復(fù)蘇率。本發(fā)明將RhoA重組蛋白首次應(yīng)用于胚胎冷凍領(lǐng)域，通過RhoA重組蛋白的添加顯著提高胚胎的抗凍性以及解凍后的復(fù)蘇率，一定程度上減少了有毒冷凍保護劑的使用，從而降低了對胚胎的不利影響，RhoA重組蛋白在胚胎的冷凍保存【技術(shù)領(lǐng)域】將具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】RhoA重組蛋白在制備提高胚胎抗凍性以及解凍后復(fù)蘇率 的培養(yǎng)液中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及RhoA重組蛋白的新用途，特別涉及RhoA重組蛋白在制備提高胚胎抗 凍性以及解凍后復(fù)蘇率的培養(yǎng)液中的應(yīng)用，本發(fā)明屬于胚胎冷凍保存【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 在家畜繁殖領(lǐng)域中，胚胎冷凍保存技術(shù)等方面發(fā)展迅速，在畜牧業(yè)中，通過對冷凍 保存的囊胚進行解凍，之后在適當?shù)臅r間移植到受體母畜中已成為一種十分普遍的操作方 法。到目前為止，實際生產(chǎn)過程中采用進口的聚乙二醇作為冷凍液的使用已經(jīng)在實際的冷 凍應(yīng)用中起到了較好的效果。但是胚胎經(jīng)過過冷凍后40%都會在冷凍過程中受到損傷，使 得胚胎在移植后的成活率降低，而且這些冷凍液仍會給胚胎帶來或多或少的毒性及危害。
[0003] 因此，開發(fā)出一種可提高胚胎的抗凍性以及解凍后的復(fù)蘇率的方法是目前十分迫 切的需要。
[0004] 本發(fā)明通過體外培養(yǎng)液中添加一定RhoA體外重組蛋白，胚胎培養(yǎng)6h后經(jīng)過程序 化冷凍后觀察其解凍復(fù)蘇率，希望能夠從中找出一種毒性低且能夠提高胚胎抗凍機能的物 質(zhì)，從而應(yīng)用在家畜胚胎冷凍行業(yè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供RhoA重組蛋白在制備提高胚胎抗凍性以及解凍后復(fù)蘇率 的培養(yǎng)液中的應(yīng)用。
[0006] 為了達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)手段為：
[0007] 本發(fā)明通過在試驗中添加體外重組的RhoA蛋白進行胚胎的體外培養(yǎng)，探索這種 體外重組的RhoA蛋白是否使小鼠胚胎抗凍性提高，從而是否可以將其應(yīng)用在規(guī)?；呐?胎冷凍領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠正常孵化胚胎的培養(yǎng)液中添加體外重組RhoA蛋白與對照組 相比能夠顯著提高正常孵化胚胎的解凍復(fù)蘇率（P〈〇. 05)。在Y-27632中培養(yǎng)2h后再放到 RhoA體外重組蛋白中培養(yǎng)6h后進行冷凍，解凍復(fù)蘇后結(jié)果與對照組相比極顯著的降低。說 明RhoA重組蛋白不能夠使Y-27632對于胚胎的損傷可逆。以上研究證明：體外添加重組的 RhoA蛋白可以顯著提高正常孵化胚胎的解凍復(fù)蘇率。
[0008] 在此研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出了 RhoA重組蛋白在制備提高胚胎抗凍性以及解 凍后復(fù)蘇率的培養(yǎng)液中的應(yīng)用。
[0009] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的RhoA重組蛋白為人源RhoA重組蛋白，其gene bank 登錄號為 Accession:NP_001655. 1。
[0010] 進一步的，本發(fā)明還提出了一種提高胚胎抗凍性以及解凍后復(fù)蘇率的培養(yǎng)方法， 其特征在于包括向胚胎培養(yǎng)液中加入RhoA重組蛋白。
[0011] 其中，優(yōu)選的，所加入的RhoA重組蛋白在培養(yǎng)液中的終濃度為1 μ g/μ 1。
[0012] 其中，優(yōu)選的，所述的培養(yǎng)方法包括以下步驟：
[0013] 獲取的正常孵化胚胎用CZB溶液清洗3次，之后再進行體外培養(yǎng)，具體為在37°C、 5%的CO 2空氣和100%濕度條件下，用四孔板進行體外培養(yǎng)，且分別向培養(yǎng)液中添加 RhoA 重組蛋白，使其終濃度為1 μ g/μ 1，經(jīng)過體外培養(yǎng)6h后將胚胎進行程序化冷凍，解凍復(fù)蘇 后再放入平衡過的新CZB溶液中進行24h的復(fù)蘇。
[0014] 相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0015] 1、將RhoA重組蛋白首次應(yīng)用于胚胎冷凍領(lǐng)域，通過RhoA重組蛋白的添加顯著提 高胚胎的抗凍性以及解凍后的復(fù)蘇率；
[0016] 2、通過在含RhoA重組蛋白的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，一定程度上增強了胚胎在冷凍過程 中的抗低溫能力，減少其在冷凍過程中受到的損傷，從而降低了冷凍過程對胚胎的不利影 響。
[0017] 3、將RhoA重組蛋白直接添加到即將要冷凍胚胎的培養(yǎng)液中，增強其抗低溫損傷 的能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為添加抑制劑及重組蛋白后對小鼠正常解凍復(fù)蘇率的影響；
[0019] 圖2為正常孵化胚胎在冷凍前、添加或不添加人源體外重組RhoA蛋白冷凍后Oh、 添加或不添加人源體外重組RhoA蛋白冷凍后24h后的圖；
[0020] 其中，1?3圖分別為正常孵化胚胎的冷凍前、不添加人源體外重組RhoA蛋白冷凍 后Oh、不添加人源體外重組RhoA蛋白冷凍后24h，4?6圖分別為正常孵化胚胎的冷凍前、 添加人源體外重組RhoA蛋白冷凍后Oh、添加人源體外重組RhoA蛋白冷凍后24h。

【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實施例來和附圖進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著 描述而更為清楚"但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制"本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié) 和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0022] 實施例1
[0023] 1、材料
[0024] I. 1主要儀器和設(shè)備
[0025] 移液器：北京百晶移液器（lmL、200y L、100y L、10y L)
[0026] 醫(yī)用離心機：北京醫(yī)用離心機廠，LDZ4-0. 8
[0027] CO2 培養(yǎng)箱：Heal Force 公司，HF9O
[0028] 體視顯微鏡：江南顯微鏡廠，Xl 1-3
[0029] 超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司，ZHJH-1112B
[0030] 電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，BS124S
[0031] 酸度計：Thermo 公司，868
[0032] 精密加熱板：貝達儀器公司，MEH-2
[0033] 水浴鍋：北京長安科學(xué)儀器廠，HH · Sl-Ni
[0034] 1. 2主要試劑
[0035] I. 2· 1 人源體外重組 RhoA 蛋白，購自 Sino Biological 公司，貨號：12441-H07B。
[0036] 1. 2. 2配重組蛋白體外培養(yǎng)液：在50 μ g的體外重組蛋白配成10 μ g/ μ 1的儲液。 保存在4°C。
[0037] L 2. 3培養(yǎng)液配制（CZB儲液）：
[0038]

【權(quán)利要求】
1. RhoA重組蛋白在制備提高胚胎抗凍性以及解凍后復(fù)蘇率的培養(yǎng)液中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的RhoA重組蛋白為人源RhoA重組蛋白， 其 gene bank 登錄號為 Accession:NP_001655. 1。
3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的胚胎為正常孵化胚胎。
4. 一種提高胚胎抗凍性以及解凍后復(fù)蘇率的培養(yǎng)方法，其特征在于包括向胚胎培養(yǎng)液 中加入RhoA重組蛋白。
5. 如權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所加入的RhoA重組蛋白在培養(yǎng)液中的終 濃度為1 μ g/μ 1。
6. 如權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟： 獲取的正常孵化胚胎用CZB溶液清洗3次，之后再進行體外培養(yǎng)，具體為在37°C、5 %的 C02空氣和100%濕度條件下，用四孔板進行體外培養(yǎng)，且分別向培養(yǎng)液中添加 RhoA重組蛋 白，使其終濃度為1 μ g/ μ 1，經(jīng)過體外培養(yǎng)6h后將胚胎進行程序化冷凍，解凍復(fù)蘇后再放 入平衡過的新CZB溶液中進行24h的復(fù)蘇。
【文檔編號】A01N1/02GK104278011SQ201410483815
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】郭勇, 倪和民, 劉云海, 顧美超, 齊曉龍 申請人:北京農(nóng)學(xué)院