專利名稱：一種融合蛋白及其編碼基因與其在抗植物真菌病害中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種融合蛋白及其編碼基因與其在抗植物真菌病害中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
真菌病害是植物病害中研究最早和種類最多，其中可以為害植物的近3萬(wàn)種，很多都可以造成嚴(yán)重的危害。因此通過(guò)基因工程手段獲得廣譜抗真菌的種質(zhì)將極大的促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及消除病害的防治時(shí)施用農(nóng)藥帶來(lái)的環(huán)境污染。
植物對(duì)病原菌的免疫可以分為兩個(gè)層次第一層為病原相關(guān)分子模式，(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)激發(fā)的免疫性 (PAMP-triggeredimmunity, PTI),即植物通過(guò)細(xì)胞表面模式識(shí)別受體(pattern recognitionreceptors, PRRs)對(duì)病原菌的PAMPs進(jìn)行分子識(shí)別，從而啟動(dòng)植物的防衛(wèi)反應(yīng)，這種反應(yīng)被定義為植物的基礎(chǔ)抗(basal disease resistance),也稱為基礎(chǔ)免疫(basal immunity);第二層為病原菌效應(yīng)子激發(fā)的免疫性(effector triggered immunity, ETI),即有些毒性強(qiáng)的病原菌通過(guò)產(chǎn)生效應(yīng)子(effectors)來(lái)抑制PTI,從而突破植物的第一道防線，而植物又進(jìn)化出新的分子受體(例如R基因編碼的NBS-LRR蛋白質(zhì)) 以偵察病原菌效應(yīng)子并啟動(dòng)第二道防衛(wèi)反應(yīng)。數(shù)億年來(lái)，病原菌的侵染和植物的防衛(wèi)交替進(jìn)行，促進(jìn)了病原菌和植物基因組的共進(jìn)化。Brutus等認(rèn)為PAMPs在病原菌中都是基本的、 保守的成分，因此與效應(yīng)子激發(fā)的免疫反應(yīng)相比較，由PAMPs所引起的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)將可能獲得更廣譜與持久的抗性。
真菌幾丁質(zhì)也是一種PAMPs分子，目前已從水稻中分離出結(jié)合幾丁質(zhì)的模式識(shí)別受體基因CEBiP，其編碼的跨膜糖蛋白含有兩個(gè)胞外LysM結(jié)構(gòu)域，但是缺乏胞內(nèi)激酶域， 而水稻中的另一個(gè)幾丁質(zhì)識(shí)別受體OsCERKI卻是一個(gè)跨膜受體激酶，并與CEBiP協(xié)同進(jìn)行幾丁質(zhì)識(shí)別信號(hào)傳導(dǎo)。Chen等詳細(xì)分析了水稻幾丁質(zhì)識(shí)別受體OsCERKI在成熟、運(yùn)輸、質(zhì)膜定位及識(shí)別幾丁質(zhì)信號(hào)等方面的蛋白網(wǎng)絡(luò)。
Xa21是一個(gè)受體激酶(receptor-like kinases, RLKs),在體內(nèi)通過(guò)識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞外受體的相應(yīng)功能區(qū)，引起受體的磷酸化，從而激發(fā)其下游一系列信號(hào)的傳導(dǎo)。有意思的是，Xa21還可以通過(guò)更換其胞外受體結(jié)構(gòu)域，識(shí)別相應(yīng)的配體激發(fā)Xa21所引起的防衛(wèi)反應(yīng)。He等把油菜素內(nèi)酯酯(Brassinosteroids, BR) BRII的LRR-JM結(jié)構(gòu)域與XA21的絲氨酸/蘇氨酸激酶重組構(gòu)建了一個(gè)嵌合受體的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。當(dāng)用油菜素內(nèi)酯處理水稻細(xì)胞株時(shí)，這個(gè)嵌合受體可以引發(fā)與XA21相同的植物防衛(wèi)反應(yīng)。選用幾丁質(zhì)有強(qiáng)結(jié)合能力的受體與Xa21構(gòu)建嵌合受體，不僅可能獲得對(duì)稻瘟病更強(qiáng)的抗性，還可能獲得對(duì)其他真菌更廣譜的抗性。OsCERKI是水稻中另一個(gè)幾丁質(zhì)識(shí)別受體,Shimizu等通過(guò)研究認(rèn)為OsCERKI比 CEBIP在幾丁質(zhì)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程發(fā)揮著更為重要的作用。因此通過(guò)OsCERKI的識(shí)別幾丁質(zhì)的受體區(qū)結(jié)構(gòu)域與M21的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域重組構(gòu)建的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植株可能獲得對(duì)真菌的廣譜抗性。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種融合蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明提供的一種融合蛋白，名稱為0sCERKl_Xa21 ;是如下(a)或(b)
(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(b)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
上述融合蛋白中，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
編碼上述蛋白的多核苷酸也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
上述多核苷酸是如下(1)-(4)中任種的DNA分子
(I)序列表中序列I所示的DNA分子；
(2)序列表中序列2所示的DNA分子；
(3)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病性相關(guān)蛋白的DNA分子；
(4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物抗病性相關(guān)蛋白的DNA分子。
上述嚴(yán)格條件為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用 2 X SSC, O. 1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。
序列表中序列I所示的DNA分子包括蔗糖合酶I啟動(dòng)子、水稻幾丁質(zhì)識(shí)別受體 OsCERKI和Xa21的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；序列表中序列I所示的DNA分子的編碼基因?yàn)樾蛄斜碇械男蛄? ;該基因編碼的蛋白的氣基酸序列為序列表中的序列3。
含有上述多核苷酸的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
上述重組載體為將編碼上述蛋白的多核苷酸插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)上述蛋白的重組載體。上述重組載體具體為將序列表中的序列I插入PCAMBIA1300的Kpn I和SalI 位點(diǎn)間得到的載體。
擴(kuò)增上述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
上述蛋白、上述多核苷酸或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)節(jié)植物抗病性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
在上述應(yīng)用中，所述調(diào)節(jié)植物抗病性為提高植物抗病性；所述病為由真菌引起的?。凰鲇烧婢鸬牟【唧w為稻瘟病或紋枯??；所述稻瘟病的病原菌具體進(jìn)一步為稻梨孢菌(Pyricularia oryae Cav.);所述紋枯病的病原菌具體進(jìn)一步為立枯絲核菌 (Rhizoctonia solani Kiihn)；
在上述應(yīng)用中，所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物，所述單子葉植物進(jìn)一步具體為水稻。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
本發(fā)明提供的方法，為將編碼上述蛋白的多核苷酸導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的抗病性高于所述目的植物。上述方法中，所述病為由真菌引起的?。凰鲇烧婢鸬牟【唧w為稻瘟病或紋枯??；所述稻痕病的病原菌具體進(jìn)一步為稻梨孢菌(Pyricularia oryae Cav.);所述紋枯病的病原菌具體進(jìn)一步為立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)。上述方法中，編碼上述蛋白的多核苷酸通過(guò)上述的重組載體導(dǎo)入目的植物；所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述單子葉植物進(jìn)一步具體為水稻。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種融合蛋白，將含有該融合蛋白的編碼基因的片段通過(guò)植物表達(dá)載體導(dǎo)入水稻中，獲得轉(zhuǎn)基因水稻；接種真菌紋枯病病原菌或稻瘟病 病原菌，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻具有高度抗性；說(shuō)明可以利用本發(fā)明的融合蛋白培育廣譜抗真菌的水稻，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。


圖I為部分轉(zhuǎn)0sCERKl_Xa21水稻的分子檢測(cè)圖2為部分轉(zhuǎn)0sCERKl_Xa21水稻抗紋枯病與稻瘟病鑒定
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、融合蛋白及其編碼基因與含有編碼基因的載體的構(gòu)建I、鹿糖合酶I啟動(dòng)子的獲得以水稻品種明恢63(記載在如下文獻(xiàn)中謝華安.明恢63的選育與利用，福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),1998, 13⑷1-6 ;公眾可從海南大學(xué)和中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)為實(shí)驗(yàn)材料，提取其葉片總DNA，以此DNA為模板，以SpecialF-KpnI (5 ’gggagctcctccttcattttcagtgcaaatg 3 ')和SpecialR-BamHI(5，gggtaccccaatggtggtcagagacgag 3 ’ )為引物，PCR擴(kuò)增水稻蔗糖合酶I啟動(dòng)子片段(命名為pRSUSl)。PCR反應(yīng)條件先94°C預(yù)變性4min ;然后94°C變性45S ;56°C退火45S ;72°C延2min，共29個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得約1700bp左右的片段。回收該1700bp左右的片段，連接到T-easy載體(購(gòu)于Promega公司，產(chǎn)品號(hào)A1360)上，獲得重組載體命名為T-pRSUSl。對(duì)T-pRSUSl進(jìn)行測(cè)序；1700bp左右的片段的核苷酸序列如序列表中序列I自5’末端第1-1727位核苷酸，即為蔗糖合酶I啟動(dòng)子。2、水稻幾丁質(zhì)識(shí)別受體OsCERKI胞外結(jié)構(gòu)域片段的獲得提取水稻品種臺(tái)北309(記載在如下文獻(xiàn)中曹孟良.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，25 (5) =349-356 ;公眾可從海南大學(xué)和中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)，以下也稱為野生型水稻，葉片所提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以此 cDNA 作為模板 OsCERKlF-BamHI (5 ; TAGGATCCATGGAAGCTTCCACCTCCCTC 3 ;)與 OsCERKlR-BamHI (5 ; TAGGATCCTATGATATACAAGAAGATGGC 3 ;)為引物，PCR 擴(kuò)增水稻幾丁質(zhì)識(shí)別受體OsCERKI片段(命名為OsCERKI )。
PCR反應(yīng)條件 先94°C預(yù)變性4min ;然后94°C變性45S ;56°C退火45S ;72°C延lmin，共29個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得約800bp左右的片段。回收該800bp左右的片段，連接到T-easy載體上，獲得重組載體命名為T_0sCERKl。對(duì)T-OsCERKI進(jìn)行測(cè)序，SOObp左右的片段的核苷酸序列如序列表中序列I自5’末端第1728-2513位核苷酸所示，為幾丁質(zhì)識(shí)別受體OsCERKI片段。3、水稻抗白葉枯病基因Xa21胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域片段的獲得以中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所翟文學(xué)課題組擁有的攜有Xa21基因組DNA的質(zhì)粒pDBXa21 (記載在如下文獻(xiàn)中夏志輝等.無(wú)選擇標(biāo)記和載體骨干序列的Xa21轉(zhuǎn)基因水稻的獲得，生物工程學(xué)報(bào)，2006, 22 (2) =213-218 ；公眾可從海南大學(xué)和中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)作為模板，Xa21F-BamHI(5 ; TAGGATCCCACAAGAGAACTAAAAAGGG 3 ')與 Xa21R_SalI(5 ;ATGTCGACGTGAGTCAAGTAGAGACATG3 ;)為引物，PCR擴(kuò)增Xa21的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域片段(命名為Xa21)。PCR反應(yīng)條件先94°C預(yù)變性4min ;然后94°C變性45S ;56°C退火45S ;72°C延3min，共29個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得約2700bp左右的片段?；厥赵?700bp左右的片段，連接到T-easy載體上，獲得重組載體命名為T_Xa21。對(duì)T_21進(jìn)行測(cè)序，2700bp左右的片段的核苷酸序列如序列表中序列I自5’末端第2514-5199位核苷酸，為Xa21的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域片段。4、重組載體的構(gòu)建將T-pRSUSl與適用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的雙元載體pCAMBIA1300(購(gòu)于CAMBIA公司)分別用KpnI和BamHI雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收1700bp左右的pRSUSl片段和9K左右的pCAMBIA1300大片段，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、鑒定后獲得重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA1300-pRSUSl ；再用BamHI 分別單酶切 T-OsCERKI 和 pCAMBIA1300_pRSUSl，回收 800bp 左右的OsCERKI片段和10. 7Kb左右的pCAMBIA1300_pRSUSl載體片段，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、鑒定方向后獲得重組質(zhì)粒命名為 pCAMBIA1300-pRSUSI-OsCERKI ；用BamHI和Sal I分別雙酶切載體T_Xa21，回收2700bp左右Xa21片段與11. 4Kb的pCAMBIA1300-pRSUSI-OsCERKI的載體大片段，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、鑒定方向后獲得重組質(zhì)粒命名為p0sCERKl-Xa21，為重組載體。經(jīng)過(guò)測(cè)序，重組載體P0sCERKl-Xa21為將序列I所示的核苷酸插入pCAMBIA1300的Kpn I和Sal I位點(diǎn)間得到的載體。上述序列I所示的DNA分子包括蔗糖合酶I啟動(dòng)子、水稻幾丁質(zhì)識(shí)別受體OsCERKI和Xa21的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；其中，蔗糖合酶I啟動(dòng)子為序列表中序列I自5’末端第1-1727位核苷酸；水稻幾丁質(zhì)識(shí)別受體OsCERKI為序列表中序列I自5’末端第1728-2513位核苷酸；Xa21的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?yàn)樾蛄斜碇行蛄蠭自5’末端第2514-5199位核苷酸。序列I所示的DNA分子的編碼基因0sCERKl_Xa21為序列表中的序列2 ;該基因編碼的蛋白命名為融合蛋白0sCERKl-Xa21 ;該融合蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列3。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)0sCERKl_Xa21水稻的獲得及功能鑒定
I、轉(zhuǎn) OsCERKI-Xa21 水稻的獲得將重組載體P0sCERKl-Xa21轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404 (寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品號(hào)D9115)中，得到LBA4404/p0sCERKl-Xa21 (提取質(zhì)粒，送去測(cè)序，質(zhì)粒為p0sCERKl-Xa21，則含有該質(zhì)粒的農(nóng)桿菌為 LBA4404/p0sCERKl_Xa21 )。將重組農(nóng)桿菌LBA4404/p0sCERKl-Xa21導(dǎo)入到水稻臺(tái)北309 (簡(jiǎn)寫成TP309)中，得到Ttl代轉(zhuǎn)0sCERKl-Xa21水稻；轉(zhuǎn)基因方法參照Toki S的快速轉(zhuǎn)化方法(TokiS等.2006. Early infection of scutelIum tissue with Agrobacterium allowshigh-speedtransformation of rice. Plant. J. 47 (6) :969-76);具體如下I)、預(yù)培養(yǎng) (I)去殼種子用70%乙醇浸30秒，無(wú)菌水沖洗2-3次； (2)30% NaClO(原液為有效氯 10% )浸 30min ；(3)重復(fù)步驟2，無(wú)菌水沖洗3-5次；(4)滅菌后的種子接種于N6D培養(yǎng)基上，32°C持續(xù)光照培養(yǎng)5天。2 )、農(nóng)桿菌侵染及轉(zhuǎn)化苗篩選(I)帶相應(yīng)載體的農(nóng)桿菌 LBA4404/p0sCERKl-Xa21 在 YEB+Rif (25_50mg/L) +Kan(50mg/L)培養(yǎng)基上28°C暗培養(yǎng)2_3天，挑單菌落于3_5mLYEB+Kan+Rif培養(yǎng)基中，28°C暗搖床中培養(yǎng)約24 - 36h至OD=O. 6左右，取500uL接于50mLAAM培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)至 0D600 約 0. I ;(2)愈傷浸于農(nóng)桿菌菌液中，120rpm輕輕晃動(dòng)約20min，然后靜置IOmin ;倒掉菌液，將愈傷置于無(wú)菌濾紙上吸去多余菌液，吹干；(3)愈傷接于N6D-As (添加IOOuM的乙酰丁香酮)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基上預(yù)先墊一層浸有AAM (0. 5毫升即可)的無(wú)菌濾紙；(4)25 °C 共培養(yǎng) 3 天；(5)共培養(yǎng)后的愈傷先用無(wú)菌水沖洗2-3次用，再用含500mg/L羧芐的無(wú)菌水沖洗2-3次，并用之浸泡30分鐘左右(若浸染愈傷的菌液濃度0D600>0. 1，可將浸泡時(shí)間增加到I小時(shí)左右，30分鐘左右更換一次)，以徹底去除農(nóng)桿菌；(6)無(wú)菌濾紙上吸去水分，并吹干，接種于含50mg/L潮霉素B和400mg/L羧芐的N6D培養(yǎng)基上32°C持續(xù)光照培養(yǎng)兩周；(7)將生長(zhǎng)旺盛的愈傷轉(zhuǎn)移到含50mg/L潮霉素B和250mg/L羧芐的RE-III培養(yǎng)基上32°C持續(xù)光照培養(yǎng)誘導(dǎo)分化。愈傷變綠后很快就會(huì)分化出幼苗；98)轉(zhuǎn)移分化出的幼苗至含50mg/L潮霉素B和200mg/L羧芐的HF培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，得到Ttl代轉(zhuǎn)0sCERKl-Xa21水稻。以Ttl代轉(zhuǎn)0sCERKl_Xa21水稻為模板，以hptF和hptR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)潮霉素基因hpt是否整合到水稻基因組；以Xa21SF和Xa21SR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)目標(biāo)基因片段是否整合到水稻基因組；hptF5' -TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3'；hptR 5' -TACACAGCCATCGGTCCAGA-3'；Xa21SF:5' -CTACATGAACTGATGGAGGAG-3'；Xa21SR:5' -CCATACTCTGTTTGAGCAGGA-3'。
結(jié)果如圖I所示，其中，A圖為潮霉素基因hpt的PCR分子鑒定；B圖為目標(biāo)基因的鑒定；1-13為Ttl代轉(zhuǎn)OsCERKI-Xa21水稻，Positive CK (陽(yáng)性對(duì)照)為重組載體p0sCERKl-Xa21，陰性對(duì)照為TP309對(duì)照；可以看出，圖IA中得到845bp且對(duì)應(yīng)的圖2B中得到574bp為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，共獲得38個(gè)陽(yáng)性Ttl代轉(zhuǎn)0sCERKl-Xa21水稻。
采用同樣的方法將空載體PCAMBIA1300接種到野生型水稻中，得到轉(zhuǎn)空載體水稻。2、轉(zhuǎn)0sCERKl_Xa21水稻的抗病性研究將10個(gè)陽(yáng)性Ttl代轉(zhuǎn)0sCERKl_Xa21水稻后代和水稻臺(tái)北309對(duì)照(也稱為野生型水稻)，移栽到海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院基地，每個(gè)株系100株，隨機(jī)分成2組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)小區(qū)。以轉(zhuǎn)空載體水稻為對(duì)照。I)稻瘟菌培養(yǎng)及接種方法稻痕病的病原菌為子囊菌亞門Magnaporthe grisea (Hebert) Barr,其無(wú)性世代為半知菌亞門真菌灰梨孢屬Pyricularia grisea (Cooke) Sacc.;有性態(tài)為稻梨孢菌Pyricularia oryae Cav.。接種稻梨孢菌(Pyricularia oryae Cav. )ZB15(記載在如下文獻(xiàn)中譚向紅等.秈稻品種地谷抗稻瘟病基因的遺傳，遺傳學(xué)報(bào)，2000，27(8) =701-705 ;公眾可從海南大學(xué)和中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)于米糠培養(yǎng)基上(米糠40g/L，瓊脂粉15g / L，PH 7.0)，置于25-28°C培養(yǎng)一周，待菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿后，用無(wú)滅涂布器刮擦菌絲，然后用無(wú)菌沙布蓋住培養(yǎng)皿，25-28°C光下培養(yǎng)3天誘導(dǎo)產(chǎn)孢，鏡檢發(fā)現(xiàn)有大量孢子產(chǎn)生時(shí)，用無(wú)菌水把孢子洗脫下來(lái)，調(diào)節(jié)稻瘟病原菌孢子懸浮液濃度至IO5個(gè)孢子/ mL。通過(guò)注射法將稻瘟病原菌孢子懸浮液接種到植株中，接種5d當(dāng)病斑長(zhǎng)度明顯而穩(wěn)定時(shí)進(jìn)行調(diào)查，每一植株調(diào)查三個(gè)分蘗。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。上述植株分別為10個(gè)陽(yáng)性Ttl代轉(zhuǎn)OsCERKI-Xa21水稻、10個(gè)水稻臺(tái)北309對(duì)照(也稱為野生型水稻；TP309)和10個(gè)轉(zhuǎn)空載體水稻。觀察表型，結(jié)果如圖2A所示，10個(gè)水稻臺(tái)北309接種稻瘟病菌后均產(chǎn)生病斑，且約有20%(平均值)的葉面積被病斑覆蓋；10個(gè)陽(yáng)性Ttl代轉(zhuǎn)P0sCERKl-Xa21水稻中有4個(gè)株系為無(wú)病斑(對(duì)應(yīng)圖2A陽(yáng)性Ttl代轉(zhuǎn)P0sCERKl-Xa21水稻株號(hào)的1、3、4、5號(hào))；另有3株株系只有少量病斑(對(duì)應(yīng)圖2A陽(yáng)性Ttl代轉(zhuǎn)P0sCERKl-Xa21水稻株號(hào)的2、6、7號(hào))，不超過(guò)5%(平均值)的葉面積被病斑覆蓋；可以看出陽(yáng)性Ttl代轉(zhuǎn)P0sCERKl-Xa21水稻對(duì)稻瘟病高度抗性。野生型水稻與轉(zhuǎn)空載體水稻的結(jié)果無(wú)顯著差異。2)紋枯病菌培養(yǎng)及接種方法紋枯病的病原菌為擔(dān)子菌亞門真菌的瓜亡革菌Thanatephoruscucumeris(Frank)Donk.,其無(wú)性態(tài)為立枯絲核菌Rhizoctonia solani Kiihn,屬半知菌亞門真菌。接種立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)C30 (記載在如下文獻(xiàn)中陳夕軍等.水稻紋枯病寄主-病原物互作鑒別品種與菌株的篩選，植物病理學(xué)報(bào)，2009，39 (5)514-520 ;公眾可從海南大學(xué)和中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)接種在PDA培養(yǎng)基上(馬鈴薯300g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂15-20g/L，PH 7. 0)，置于28°C培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿后，再切開0. 3*0. 3cm的小菌塊置于裝有新鮮的PDA培養(yǎng)基上(每皿3塊)，然后將剪成0. 8-1. Ocm的無(wú)菌木質(zhì)牙簽，鋪放在已經(jīng)放置了菌塊的PDA培養(yǎng)皿上，接菌培養(yǎng)3天，待菌絲密集地布滿培養(yǎng)皿時(shí)，田間用鑷子將短牙簽嵌入植株自上向下第3葉葉鞘內(nèi)側(cè)，使葉鞘包莖狀態(tài)不變.并在相應(yīng)的葉片上做好標(biāo)記。每株接種3個(gè)莖桿。上述植株分別為10個(gè)陽(yáng)性Ttl代轉(zhuǎn)OsCERKI-Xa21水稻、10個(gè)水稻臺(tái)北309 (也稱為野生型水稻)和10個(gè)轉(zhuǎn)空載體水稻。紋枯病接種結(jié)果如圖2B所示，10個(gè)水稻臺(tái)北309接種紋枯病菌后均產(chǎn)生病斑，且在葉鞘上的病斑離接種部位的長(zhǎng)度超過(guò)8cm (平均值)；10個(gè)陽(yáng)性Ttl代轉(zhuǎn)P0sCERKl-Xa21水稻中有I個(gè)株系為無(wú)病斑(對(duì)應(yīng)圖2B陽(yáng)性Ttl代轉(zhuǎn)P0sCERKl-Xa21水稻的I號(hào))；5個(gè)株系只有少量病斑(對(duì)應(yīng)圖2B陽(yáng)性Ttl代轉(zhuǎn)P0sCERKl-Xa21水稻的2、3、4、5、7號(hào))，在葉鞘上的病斑離接種部位的長(zhǎng)度都在Icm以下；可以看出陽(yáng)性Ttl代轉(zhuǎn)P0sCERKl-Xa21水稻對(duì)紋枯病菌高度抗性。野生型水稻與轉(zhuǎn)空載體水稻的結(jié)果無(wú)顯著差異。
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白的多核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸是如下(I)-(4)中任一一種的DNA分子 (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)序列表中序列2所示的DNA分子； (3)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病性相關(guān)蛋白的DNA分子; (4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物抗病性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述多核苷酸的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于 所述重組載體為將編碼權(quán)利要求I所述蛋白的多核苷酸插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)權(quán)利要求I所述蛋白的重組載體。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。
7.權(quán)利要求I所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述多核苷酸或權(quán)利要求4所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)節(jié)植物抗病性中的應(yīng)用； 所述調(diào)節(jié)植物抗病性具體為提高植物抗病性；所述病為由真菌引起的病；所述由真菌引起的病具體為稻瘟病或紋枯病；所述稻瘟病的病原菌具體進(jìn)一步為稻梨孢菌(Pyricularia oryae Cav.);所述紋枯病的病原菌具體進(jìn)一步為立枯絲核菌(Rhizoctoniaso Iani Kiihn)； 所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物，所述單子葉植物進(jìn)一步具體為水稻。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將編碼權(quán)利要求I所述蛋白的多核苷酸導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的抗病性高于所述目的植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述病為由真菌引起的?。凰鲇烧婢鸬牟【唧w為稻瘟病或紋枯?。凰龅疚敛〉牟≡唧w進(jìn)一步為稻梨孢菌(Pyriculariaoryae Cav.);所述紋枯病的病原菌具體進(jìn)一步為立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于 編碼權(quán)利要求I所述蛋白的多核苷酸通過(guò)權(quán)利要求4或5所述的重組載體導(dǎo)入目的植物； 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述單子葉植物進(jìn)一步具體為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的融合蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種融合蛋白，將含有該融合蛋白的編碼基因的片段通過(guò)植物表達(dá)載體導(dǎo)入水稻中，獲得的轉(zhuǎn)基因水稻；接種真菌紋枯病病原菌或稻瘟病病原菌，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻具有高度抗性；說(shuō)明可以利用本發(fā)明的融合蛋白培育廣譜抗真菌的水稻，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102978178SQ20121048911
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月27日
發(fā)明者夏志輝, 翟文學(xué), 李明容, 曹玉鑫, 花龍, 黃惜 申請(qǐng)人:海南大學(xué), 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所