一種遠(yuǎn)程投遞重組羊膜培養(yǎng)上皮膜片的方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種遠(yuǎn)程投遞重組羊膜培養(yǎng)上皮膜片的方法，首先制備圓柱體形明膠海綿的底墊，再制備用于盛裝膜片套筒的明膠海綿圓柱環(huán)；將底墊和圓柱環(huán)滅菌后放入培養(yǎng)孔中，然后將培養(yǎng)完全的重組羊膜培養(yǎng)上皮膜片套筒放入海綿環(huán)的內(nèi)部，加入細(xì)胞培養(yǎng)基浸濕細(xì)胞膜片和填充明膠海綿，然后封口膜封口后進(jìn)行遠(yuǎn)程投遞。本發(fā)明以明膠海綿做三維立體支架，其加入營養(yǎng)液后高度膨脹，可將培養(yǎng)套筒牢固固定，同時(shí)在底部的明膠海綿內(nèi)吸附的營養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞保持良好的營養(yǎng)作用，較好的保持細(xì)胞活性。且明膠海綿吸附的營養(yǎng)液可使細(xì)胞保持無菌、活性狀態(tài)，同時(shí)添加的營養(yǎng)液不會(huì)因外漏造成細(xì)胞的污染，方便遠(yuǎn)程投遞。
【專利說明】一種遠(yuǎn)程投遞重組羊膜培養(yǎng)上皮膜片的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種遠(yuǎn)程投遞重組羊膜培養(yǎng)上皮膜片的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]角膜病是我國第二大致盲性眼病，據(jù)統(tǒng)計(jì)全國有單眼和雙眼角膜盲人約400-500萬，其中由于各種原因?qū)е碌慕悄ぞ壐杉?xì)胞缺乏癥患者占有相當(dāng)比例。角膜緣干細(xì)胞的缺乏使角膜上皮失去再生和修復(fù)的能力，引起角膜結(jié)膜上皮化、新生血管長入、持續(xù)慢性炎癥、反復(fù)的上皮缺損、基質(zhì)瘢痕化以及角膜的自溶及潰瘍，嚴(yán)重者可導(dǎo)致失明。對(duì)于全部角膜緣干細(xì)胞缺失的病人，必須采用自體或異體角膜緣干細(xì)胞移植才能得到穩(wěn)定的角膜上皮表型，重建眼表。體外培養(yǎng)的角膜緣上皮移植或口腔黏膜上皮移植因要求材料小，對(duì)供體自身造成的損傷輕，體外擴(kuò)增允許小量材料治療大范圍干細(xì)胞缺損，避免了異體材料免疫排斥，解決了雙眼角膜緣干細(xì)胞全部缺失患者自體角膜緣無法取材的難題，成為治療角膜緣干細(xì)胞缺乏癥極具前景的技術(shù)，也是再生醫(yī)學(xué)最早的成功實(shí)例之一。但是成熟的培養(yǎng)體系過程繁瑣，且多采用飼養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)基成分復(fù)雜，并不很好掌握，因此能將培養(yǎng)性狀良好的膜片安全運(yùn)送給需要移植的患者改善眼表狀況尤為重要。但是目前遠(yuǎn)途運(yùn)輸重組羊膜培養(yǎng)上皮膜片時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)培養(yǎng)基缺失，細(xì)胞易污染凋亡的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種遠(yuǎn)程投遞重組羊膜培養(yǎng)上皮膜片的方法，即以三維立體支架，浸滿營養(yǎng)液進(jìn)行遠(yuǎn)程投遞重組細(xì)胞上皮膜片的運(yùn)送方法，從而有效彌補(bǔ)現(xiàn)有運(yùn)輸方法存在的問題，為現(xiàn)有的眼表重建手術(shù)治療開辟廣闊前景。
[0004]本發(fā)明的方法，首先制備圓柱體形明膠海綿的底墊，再制備用于盛裝膜片套筒的明膠海綿圓柱環(huán)；將底墊和圓柱環(huán)滅菌后放入培養(yǎng)孔中，然后將培養(yǎng)完全的重組羊膜培養(yǎng)上皮膜片套筒放入海綿環(huán)的內(nèi)部，加入細(xì)胞培養(yǎng)基浸濕細(xì)胞膜片和填充明膠海綿，然后封口膜封口后進(jìn)行遠(yuǎn)程投遞。
[0005]作為實(shí)施例的優(yōu)選，底墊和圓柱環(huán)用明膠海綿制備的。底墊的一種尺寸為直徑32mm,高 6mm ；
[0006]且圓柱環(huán)的內(nèi)徑大于上皮膜片套筒的外徑，其一種具體尺寸為內(nèi)徑25mm，高10mm,厚 3mm η
[0007]作為實(shí)施例的一種優(yōu)選，底墊和圓柱環(huán)是用環(huán)氧乙烷進(jìn)行滅菌的。
[0008]本發(fā)明以明膠海綿做三維立體支架，其加入營養(yǎng)液后高度膨脹，可將培養(yǎng)套筒牢固固定，同時(shí)在底部的明膠海綿內(nèi)吸附的營養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞保持良好的營養(yǎng)作用，較好的保持細(xì)胞活性。且明膠海綿吸附的營養(yǎng)液可使細(xì)胞保持無菌、活性狀態(tài)，同時(shí)添加的營養(yǎng)液不會(huì)因外漏造成細(xì)胞的污染，方便遠(yuǎn)程投遞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1:本發(fā)明所使用的底墊和圓柱環(huán)的組裝結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為底墊，2為圓柱環(huán)。
[0010]圖2:本發(fā)明所使用的底墊和圓柱環(huán)的組裝結(jié)構(gòu)的剖面圖。

【具體實(shí)施方式】
[0011]本發(fā)明利用可吸收明膠海綿制備成了三維立體支架，固定細(xì)胞膜片，同時(shí)將明膠海綿吸滿營養(yǎng)液保持細(xì)胞膜片活性，行遠(yuǎn)程投遞，滿足不同地區(qū)的角膜緣干細(xì)胞的缺乏病人手術(shù)治療。本發(fā)明使用的明膠海綿符合藥典，其主要成分為膠原蛋白、蛋白質(zhì)。無菌、無熱原能被人體組織所吸收，可任其留在人體內(nèi)不必取出，可自然消化。
[0012]下面對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0013]一、三維立體明膠支架的制備:
[0014]制備明膠海綿底墊:將明膠海綿用圓規(guī)畫出直徑32mm的圓，量高度6mm，裁取圓墊制成底墊；
[0015]制備明膠圓柱環(huán):將明膠海綿用圓規(guī)畫出直徑25mm的圓，量高度10mm，截取圓柱，保留圓柱壁厚3mm，其余用環(huán)形不銹鋼刀切去。將制備好的底墊和圓柱環(huán)用環(huán)氧乙烷滅菌備用(圖1和圖2)。
[0016]二、三維立體明膠支架包裝細(xì)胞膜片:
[0017]將滅菌明膠海綿墊墊入6孔培養(yǎng)板底部，明膠海綿環(huán)置于培養(yǎng)孔邊緣，培養(yǎng)的細(xì)胞膜片套筒從transwell中取出，上皮面朝上卡入明膠海綿環(huán)內(nèi)，加入角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)液或口腔黏膜細(xì)胞培養(yǎng)液至飽和，封口膜密閉培養(yǎng)板，裝入帶有微電腦定時(shí)微控器保溫盒內(nèi)(溫度控制為37°C )快遞送出。
[0018]三、運(yùn)輸48小時(shí)后細(xì)胞膜片檢測
[0019]1.細(xì)胞活性檢測:取出細(xì)胞膜片，加入0.25%胰酶-0.02% EDTA，37°C消化lOmin，1500rpm/min離心5min，加入細(xì)胞培養(yǎng)基離心重懸制成單細(xì)胞懸液，取10 μ 1細(xì)胞懸液，加入等體積0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞比例和總細(xì)胞量。
[0020]2.細(xì)胞復(fù)層檢測:取出細(xì)胞膜片，置于PBS中漂洗，加入快速固定液固定24小時(shí)后，脫水、包埋、切片、HE染色。細(xì)胞膜片緊密貼敷于羊膜面，細(xì)胞復(fù)層3-5層。
[0021]實(shí)施例1
[0022]運(yùn)輸48小時(shí)后，取出細(xì)胞膜片，一半膜片加入0.25%胰酶-0.02% EDTA，37°C消化lOmin, 1500rpm/min離心5min,加入細(xì)胞培養(yǎng)基離心重懸制成單細(xì)胞懸液,取10 μ 1細(xì)胞懸液，加入等體積0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液吹打混勻，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞比例和總細(xì)胞量，細(xì)胞總量為6.26Χ105，其中活細(xì)胞比例為56%;另一半細(xì)胞膜片使用多聚甲醛固定、石蠟包埋后制作石蠟切片，行HE染色，觀察細(xì)胞形態(tài)及膜片結(jié)構(gòu)，鏡下可見細(xì)胞膜片呈復(fù)層結(jié)構(gòu)緊密貼附于均質(zhì)的羊膜表面，約3-5層，細(xì)胞間排列緊密，底層細(xì)胞近立方狀，而上層細(xì)胞較為扁平。
[0023]實(shí)施例2
[0024]按照常規(guī)方法制備三維立體明膠支架，滅菌明膠海綿墊墊入6孔培養(yǎng)板底部，明膠海綿環(huán)放入其上，將培養(yǎng)好的細(xì)胞膜片自transwell中取出，上皮面朝上卡入明膠海綿環(huán)內(nèi)，向海綿中加入營養(yǎng)液至其飽和，蓋上培養(yǎng)板上蓋，封口膜密閉培養(yǎng)板，裝入保溫盒內(nèi)快遞運(yùn)送。
[0025]傳統(tǒng)運(yùn)輸方法，將培養(yǎng)好的細(xì)胞膜片取出后，直接放在60mm培養(yǎng)皿中，加入少量培養(yǎng)基覆蓋膜片，封口膜密閉后即裝盒快遞。由于細(xì)胞膜片無法固定，在運(yùn)輸過程中極易因?yàn)槲恢米兓斐杉?xì)胞膜片或細(xì)胞的脫落，且培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基容易溢出，均會(huì)影響細(xì)胞膜片的臨床使用效果。本發(fā)明方法可使套筒在運(yùn)輸過程中保持穩(wěn)定，從而避免細(xì)胞膜片發(fā)生脫落；其次，明膠海綿在運(yùn)輸過程能夠保證膜片在較長時(shí)間的營養(yǎng)供給，對(duì)細(xì)胞活性影響較小。
【權(quán)利要求】
1.一種遠(yuǎn)程投遞重組羊膜培養(yǎng)上皮膜片的方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步驟: 首先制備圓柱體形明膠海綿的底墊，再制備用于盛裝膜片套筒的明膠海綿圓柱環(huán)；將底墊和圓柱環(huán)滅菌后放入培養(yǎng)孔中，然后將培養(yǎng)完全的重組羊膜培養(yǎng)上皮膜片套筒放入海綿環(huán)的內(nèi)部，加入細(xì)胞培養(yǎng)基浸濕細(xì)胞膜片和填充明膠海綿，然后封口膜封口后進(jìn)行遠(yuǎn)程投遞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的底墊和圓柱環(huán)用明膠海綿制備的。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的底墊的直徑為32mm，高度為6mm。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的圓柱環(huán)的內(nèi)徑大于上皮膜片套筒的外徑。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的圓柱環(huán)的內(nèi)徑為25mm，高度為10mm，厚度為3mm。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的底墊和圓柱環(huán)用環(huán)氧乙烷進(jìn)行滅菌。
【文檔編號(hào)】A61L27/36GK104436304SQ201410559472
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月20日
【發(fā)明者】周慶軍, 王瑤, 段豪云, 楊玲玲 申請人:山東省眼科研究所