本發(fā)明涉及一種羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

人羊膜干細(xì)胞具有高度自我更新、增殖、可植入性和多系分化能力，異基因個(gè)體移植后無免疫排斥和致瘤性風(fēng)險(xiǎn)。而且，人羊膜干細(xì)胞來源于產(chǎn)婦分娩后廢棄的胎盤，應(yīng)用到臨床不會帶來醫(yī)學(xué)倫理爭議。羊膜干細(xì)胞具有明顯的集落形成能力、增殖能力、胚胎干性、免疫調(diào)節(jié)能力及無異基因移植排斥反應(yīng)與致瘤性等優(yōu)良生物學(xué)特性，可用來進(jìn)行諸多疾病的細(xì)胞治療、組織器官損傷的修復(fù)與重建，是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域理想的種子細(xì)胞資源，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

近些年來，大量的研究表明，羊膜干細(xì)胞，既具有向同一胚層不同類型細(xì)胞分化的多向分化潛能，又有跨系跨胚層分化的能力，展示出良好的可塑性。如，起源中胚層的細(xì)胞既能向成骨、軟骨、脂肪等中胚層細(xì)胞分化，亦可向胰腺細(xì)胞、肝細(xì)胞等內(nèi)胚層細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等外胚層細(xì)胞分化。

人羊膜干細(xì)胞不僅具有顯著的自我更新能力及跨系跨胚層多系分化潛能，且相對胚胎干細(xì)胞和其它成體干細(xì)胞，其資源豐富，易獲得，無倫理爭議，免疫原性低，無致瘤風(fēng)險(xiǎn)，還具分泌免疫抑制因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子等多種生物活性因子的強(qiáng)大旁分泌或自分泌功能。這些特性賦予了它在組織工程、細(xì)胞治療、基因治療等相關(guān)再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域不可估量的臨床應(yīng)用價(jià)值。

現(xiàn)有技術(shù)中，干細(xì)胞的培養(yǎng)體系主要應(yīng)用含動(dòng)物血清(如FBS)的培養(yǎng)基，BMSCs和臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)也多采用FBS。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)體系通常為LG-DMEM培養(yǎng)基中加入10％的FBS、2mmol/L L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸/L 2-巰基乙醇和1mmol/L丙酮酸鈉。但FBS等動(dòng)物血清的應(yīng)用，在干細(xì)胞移植后，輸入異種蛋白對患者存在潛在的威脅，可產(chǎn)生抗FBS抗體及其他尚未知曉的不良反應(yīng)，而且可能造成人與其他物種間病毒感染的傳播。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，步驟如下：

(一)細(xì)胞分離

(1)羊膜取自足月剖宮產(chǎn)健康產(chǎn)婦，采集后處理；

(2)將直徑為的羊膜用0.9％氯化鈉溶液清洗，剪碎至約1mm×1mm×1mm，經(jīng)0.1％膠原酶和％的胰酶37℃消化用α-MEM培養(yǎng)基稀釋至40ml；

(3)將上述液體先后用100目及200目濾網(wǎng)過濾，去未消化的組織；

(4)過濾后的含細(xì)胞的液體置于離心管中，配平后放置在低溫離心機(jī)內(nèi)，以離心力300Xg，溫度4±2℃，離心8分鐘；

停機(jī)后輕輕取出離心管置于試管架上，離心管內(nèi)容物分為二部分，上層為膠原酶、胰酶和α-MEM培養(yǎng)基，下層為組織碎塊與細(xì)胞混合物；

將上層膠原酶、胰酶和α-MEM培養(yǎng)基吸出；

(7)將所分離的人羊膜單個(gè)核細(xì)胞用α-MEM培養(yǎng)基稀釋后2000r/min離心10min洗二次；

(二)細(xì)胞培養(yǎng)

將分離的人羊膜單個(gè)核細(xì)胞按個(gè)細(xì)胞/cm²接種于塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)于37℃，培養(yǎng)箱，培養(yǎng)液為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基；24小時(shí)后換液，棄非貼壁細(xì)胞，以后每2～3天換液；待人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞生長到70～80％融合，用％胰酶消化1～2分鐘，按0.8×10⁴～1.0×10⁴個(gè)細(xì)胞/cm²傳代；每2～3天用人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中傳代一次，使細(xì)胞濃度維持在5×10⁵～10×10⁵個(gè)細(xì)胞/M1；每次傳代培養(yǎng)的條件均為37℃，傳代得到人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。

所述人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基由α-MEM培養(yǎng)基、人血漿和人血白蛋白組成，人血漿在所述人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中的濃度是10％(體積百分濃度)，人血白蛋白在該人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中的濃度是1％(體積百分濃度)。

所述人血漿是人AB血漿。

本發(fā)明所提供的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，采用上述人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到。

本發(fā)明所述的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)如下三種細(xì)胞膜分子：人白細(xì)胞分化抗原CD73、人白細(xì)胞分化抗原CD90和人白細(xì)胞分化抗原不表達(dá)人白細(xì)胞分化抗原和人白細(xì)胞抗原HLA-DR。

人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，由α-MEM培養(yǎng)基、人血漿和人血白蛋白組成。人血漿在所述人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中的濃度是10％(體積百分濃度)，人血白蛋白在該人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中的濃度是1％(體積百分濃度)。

本發(fā)明提供了人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法：離體的人羊膜單個(gè)核細(xì)胞在如下人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中培養(yǎng)并傳代得到人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞：在α-MEM培養(yǎng)基中添加人血漿和人血白蛋白得到的培養(yǎng)基，所述人血漿在所述人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中的濃度是10％(體積百分濃度)，所述人血白蛋白在所述人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中的濃度是1％(體積百分濃度)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基不含動(dòng)物血清，既能促進(jìn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，細(xì)胞純度高，可滿足細(xì)胞治療的臨床條件，安全可靠，可用于干細(xì)胞體外擴(kuò)增。本品添加劑均使用人源產(chǎn)品，且均達(dá)到臨床應(yīng)用級別；制備及購買方便、快捷。

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明做詳細(xì)說明，并非對本發(fā)明的限定，凡依照本申請公開文件所進(jìn)行的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

附圖說明

圖1A為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞剛貼壁時(shí)的情況

圖1B為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞開始生長時(shí)的情況

圖1C為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖后的情況

圖2A為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測人白細(xì)胞分化抗原CD73的表達(dá)情況

圖2B為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測人白細(xì)胞分化抗原CD90的表達(dá)情況

圖2C為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測人白細(xì)胞分化抗原的表達(dá)情況

圖2D為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測人白細(xì)胞分化抗原的表達(dá)情況

圖2E為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測人白細(xì)胞抗原HLA-DR的表達(dá)情況

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

α-MEM培養(yǎng)基為Gibco公司的產(chǎn)品，其產(chǎn)品編號為：11900024；人AB血漿購自北京紅十字血液中心；注射用人血白蛋白(國藥準(zhǔn)字S20030043)。

人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基：α-MEM(Gibco，USA)培養(yǎng)基中添加人AB血漿和人血白蛋白的培養(yǎng)基，人AB血漿在該人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中的濃度是10％(體積百分濃度)，人血白蛋白在該人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中的濃度是1％(體積百分濃度)，pH值為7.2-7.4。

實(shí)施例1、人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

1、細(xì)胞分離

(1)羊膜取自足月剖宮產(chǎn)健康產(chǎn)婦，采集后處理。

(2)將直徑為的羊膜用0.9％氯化鈉溶液清洗，剪碎至約1mm×1mm×1mm，經(jīng)0.1％膠原酶和％的胰酶37℃消化用α-MEM(Gibco，USA)稀釋至40ml。

(3)將上述液體先后用100目及200目濾網(wǎng)過濾，去未消化的組織。

(4)過濾后的含細(xì)胞的液體置于離心管中，配平后放置在低溫離心機(jī)內(nèi)，以離心力300Xg，溫度4±2℃，離心8分鐘。

停機(jī)后輕輕取出離心管置于試管架上，離心管內(nèi)容物分為二部分，上層為膠原酶、胰酶和α-MEM培養(yǎng)基，下層為組織碎塊與細(xì)胞混合物。

將上層膠原酶、胰酶和α-MEM培養(yǎng)基吸出。

(7)將所分離的人羊膜單個(gè)核細(xì)胞用α-MEM培養(yǎng)基稀釋后2000r/min離心10min洗二次。

2、細(xì)胞培養(yǎng)

將分離的人羊膜單個(gè)核細(xì)胞按個(gè)細(xì)胞/cm²接種于塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)于37℃，培養(yǎng)箱，培養(yǎng)液為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基。24小時(shí)后換液，棄非貼壁細(xì)胞，以后每2～3天換液；待人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞生長到70～80％融合，用％胰酶(Sigma，USA)消化(1～2分鐘)，按0.8×10⁴～1.0×10⁴個(gè)細(xì)胞/cm²傳代。每2～3天用該人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中傳代一次，使細(xì)胞濃度維持在5×10⁵～10×10⁵個(gè)細(xì)胞/mL。每次傳代培養(yǎng)的條件均為37℃，傳代得到人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。

圖1A為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞剛貼壁時(shí)的情況，為形態(tài)呈細(xì)小的圓形。

圖1B為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞開始生長時(shí)的情況，48小時(shí)后，細(xì)胞開始增殖，向長梭形轉(zhuǎn)變。

圖1C為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖后的情況，一周后細(xì)胞開始增殖形成大小不等的細(xì)胞集落。

實(shí)施例2：流式細(xì)胞檢測

一、方法

實(shí)施例1得到的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，用抗人CD73單克隆抗體(BioLegend，USA)通過流式細(xì)胞儀檢測人白細(xì)胞分化抗原CD73的表達(dá)情況，用抗人CD90單克隆抗體(BioLegend，USA)通過流式細(xì)胞儀檢測人白細(xì)胞分化抗原CD90的表達(dá)情況，用抗人單克隆抗體(BioLegend，USA)通過流式細(xì)胞儀檢測人白細(xì)胞分化抗原的表達(dá)情況，用抗人單克隆抗體(BioLegend，USA)通過流式細(xì)胞儀檢測人白細(xì)胞分化抗原的表達(dá)情況，用抗人白細(xì)胞抗原HLA-DR單克隆抗體(BioLegend，USA)通過流式細(xì)胞儀(型號FACSCaliburBD公司)檢測人白細(xì)胞抗原HLA-DR的表達(dá)情況。

二、結(jié)果

結(jié)果如圖2A、圖2B、圖2C、圖2D和圖2E所示，表明該人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)人白細(xì)胞分化抗原CD73、人白細(xì)胞分化抗原CD90和人白細(xì)胞分化抗原不表達(dá)人白細(xì)胞分化抗原和人白細(xì)胞抗原HLA-DR。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明該人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的純度達(dá)到