本發(fā)明屬于心肌細(xì)胞分離
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種心肌細(xì)胞分離方法。
背景技術(shù)：
：心肌細(xì)胞動(dòng)物生長發(fā)育、生理、代謝的重要細(xì)胞之一。為了方便研究心肌細(xì)胞的生理功能、觀察細(xì)胞形態(tài)，排除體內(nèi)各種限制因素對心肌細(xì)胞的影響，通常采用體外分離培養(yǎng)方法。由于心肌細(xì)胞位于心臟的心肌組織內(nèi)，實(shí)驗(yàn)人員分離心肌細(xì)胞時(shí)，通常需要向離體的心臟中注射消化液，待消化完成后才收集心肌細(xì)胞。然而，由于分離心肌細(xì)胞時(shí)，心臟已經(jīng)離體，缺乏保護(hù)，長時(shí)間的消化作用容易引起心肌細(xì)胞變形，降低心肌細(xì)胞的存活率。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供的一種心肌細(xì)胞分離方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中長時(shí)間的消化作用容易引起的心肌細(xì)胞變形，降低心肌細(xì)胞的存活率的問題。本發(fā)明提供的一種心肌細(xì)胞分離方法，包括以下步驟：步驟1，將新鮮離體的心臟放入4℃預(yù)冷的保護(hù)液中，剪取心室肌組織，并用沖洗液洗凈，再將心室肌組織剪成1mm×1mm×1mm的小塊，然后于沖洗液中浸泡3-5min，過濾，得到心肌組織樣品，備用；每升所述保護(hù)液含有以下組分：8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3，溶劑為雙蒸水；每升沖洗液中含有以下組分：9g的NaCl、0.3g的KCl，溶劑為雙蒸水；步驟2，將心肌組織樣品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化5-8min，棄去上清液，得到第一次沉淀物；步驟3，將第一次沉淀物置于高濃度緩沖液中浸泡3-5min，過濾，收集第二次上清液和第二次沉淀物；每升高濃度緩沖液中含有以下組分：8.5g的NaCl、0.25g的KCl，溶劑為雙蒸水；步驟4，將第二次沉淀物置于消化液中，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH至7-7.5，37℃消化5-8min，過濾，收集第三次上清液和第三次沉淀物；步驟5，將第三次沉淀物置于低濃度緩沖液中浸泡3-5min，得到細(xì)胞混合物；每升低濃度緩沖液中含有以下組分：6g的NaCl、0.2g的KCl，2-4mg的L-谷氨酸、2-4mg的甘氨酸、1-2g的葡萄糖，溶劑為雙蒸水；步驟6，將第二次上清液、第三次上清液和細(xì)胞混合物混合均勻，并用吸管吹打，然后過濾掉心肌組織沉淀物，收集濾液并離心，得到分離后的心肌細(xì)胞沉淀。優(yōu)選的，上述心肌細(xì)胞分離方法中，步驟6還包括：用吸管吹打后，加入胎牛血清。優(yōu)選的，上述心肌細(xì)胞分離方法中，步驟6中，胎牛血清的添加量為：胎牛血清與所述細(xì)胞混合物的質(zhì)量比例為5～10:100。優(yōu)選的，上述心肌細(xì)胞分離方法中，步驟5中，每升低濃度緩沖液中含有以下組分：6g的NaCl、0.2g的KCl，2mg的L-谷氨酸、2mg的甘氨酸、2g的葡萄糖，溶劑為雙蒸水。優(yōu)選的，上述心肌細(xì)胞分離方法中，步驟5還包括調(diào)節(jié)pH步驟，具體為：先用0.01mol/L的HCl調(diào)節(jié)低濃度緩沖液的pH至6.0-6.5，然后加入第三次沉淀物浸泡。優(yōu)選的，上述心肌細(xì)胞分離方法中，步驟6中，濾液離心的條件為：10000r/min，4℃，離心10min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種心肌細(xì)胞分離方法具有以下有益效果：(1)步驟3中采用高濃度的緩沖液浸泡、步驟5中采用低濃度的緩沖液浸泡，使細(xì)胞外鉀離子濃度下降，對心肌細(xì)胞產(chǎn)生刺激，提高心肌細(xì)胞的活性，避免長時(shí)間的消化引起的心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化、細(xì)胞存活率降低的問題。再者，步驟5中采用的低濃度緩沖液一方面可以促使心肌細(xì)胞快速溶出，另一方面為心肌細(xì)胞提供了維持細(xì)胞滲透壓的NaCl和KCl，以及維持細(xì)胞營養(yǎng)的L-谷氨酸、甘氨酸和葡萄糖，使細(xì)胞能夠維持一定的生理活性。(2)步驟5中，用吸管吹打后，加入胎牛血清，一方面抑制了胰蛋白酶的活性，防止胰蛋白酶對后續(xù)操作的影響，另一方面，心肌細(xì)胞在一定濃度的血清中可以維持生理活性。(3)，用HCl調(diào)節(jié)低濃度緩沖液的pH至6.0-6.5后，可抑制胰蛋白酶的生理活性，快速終止反應(yīng)，避免具有活性的胰蛋白酶長期與心肌細(xì)胞接觸，影響心肌細(xì)胞活性。(4)該提取方法避免使用復(fù)雜的設(shè)備，操作簡單，且經(jīng)過長時(shí)間的消化后，心肌細(xì)胞仍保持良好的細(xì)胞形態(tài)和活性，且能夠存活較長時(shí)間。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的方法分離得到的心肌細(xì)胞的顯微觀察視圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件操作，由于不涉及發(fā)明點(diǎn)，故不對其步驟進(jìn)行詳細(xì)描述。當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。本發(fā)明提供的一種心肌細(xì)胞分離方法，包括以下步驟：步驟1，將新鮮離體的心臟放入4℃預(yù)冷的保護(hù)液中，剪取心室肌組織，并用沖洗液洗凈，再用眼科剪將心室肌組織剪成1mm×1mm×1mm的小塊，然后于沖洗液中浸泡3-5min，過濾，得到心肌組織樣品，備用；每升所述保護(hù)液含有以下組分：8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3，溶劑為雙蒸水；使用該保護(hù)液可保持心肌組織的生理活性。每升沖洗液中含有以下組分：9g的NaCl、0.3g的KCl，溶劑為雙蒸水。步驟2，將心肌組織樣品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化5-8min，棄去上清液，得到第一次沉淀物。步驟3，將第一次沉淀物置于高濃度緩沖液中浸泡3-5min，過濾，收集第二次上清液和第二次沉淀物；每升高濃度緩沖液中含有以下組分：8.5g的NaCl、0.25g的KCl，溶劑為雙蒸水。步驟4，將第二次沉淀物置于消化液中，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH至7-7.5，37℃消化5-8min，過濾，收集第三次上清液和第三次沉淀物；步驟5，用0.01mol/L的HCl調(diào)節(jié)低濃度緩沖液的pH至6.0-6.5，將第三次沉淀物置于低濃度緩沖液中浸泡3-5min，使心肌細(xì)胞分散于低濃度緩沖液中，得到細(xì)胞混合物；每升低濃度緩沖液中含有以下組分：6g的NaCl、0.2g的KCl，2-4mg的L-谷氨酸、2-4mg的甘氨酸、1-2g的葡萄糖，溶劑為雙蒸水。步驟6，將第二次上清液、第三次上清液和細(xì)胞混合物混合均勻，并用吸管吹打，然后過濾掉心肌組織沉淀物，收集慮液，并將收集的濾液經(jīng)10000r/min，4℃，離心10min，得到分離后的心肌細(xì)胞沉淀。步驟3中采用高濃度的緩沖液、步驟5中采用低濃度的緩沖液，使細(xì)胞外鉀離子濃度下降，對心肌細(xì)胞產(chǎn)生刺激，提高心肌細(xì)胞的活性，避免長時(shí)間的消化引起的心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化、細(xì)胞存活率降低的問題。需要說明的是，步驟6還包括：用吸管吹打后，加入胎牛血清，胎牛血清與所述細(xì)胞混合物的質(zhì)量比例為5～10:100。胎牛血清的添加一方面抑制了胰蛋白酶的活性，防止胰蛋白酶對后續(xù)操作的影響，另一方面，心肌細(xì)胞在一定濃度的血清中可以維持生理活性。優(yōu)選的，本發(fā)明提供的心肌細(xì)胞分離方法，包括以下實(shí)施例：實(shí)施例1一種成年大鼠的心肌細(xì)胞分離方法，包括以下步驟：步驟1，將新鮮離體的心臟放入4℃預(yù)冷的保護(hù)液中，剪取心室肌組織，并用沖洗液洗凈，再用眼科剪將心室肌組織剪成1mm×1mm×1mm的小塊，然后于沖洗液中浸泡3min，用紗布過濾，得到心肌組織樣品，備用；每升所述保護(hù)液含有以下組分：8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3，溶劑為雙蒸水；每升沖洗液中含有以下組分：9g的NaCl、0.3g的KCl，溶劑為雙蒸水。步驟2，將心肌組織樣品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化8min，棄去上清液，得到第一次沉淀物。步驟3，將第一次沉淀物置于高濃度緩沖液中浸泡5min，用紗布過濾，收集第二次上清液和第二次沉淀物；每升高濃度緩沖液中含有以下組分：8.5g的NaCl、0.25g的KCl，溶劑為雙蒸水。步驟4，將第二次沉淀物置于消化液中，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，37℃消化8min，用紗布過濾，收集第三次上清液和第三次沉淀物；步驟5，用0.01mol/L的HCl調(diào)節(jié)低濃度緩沖液的pH至6.0-6.5，將第三次沉淀物置于低濃度緩沖液中浸泡5min，使心肌細(xì)胞分散于低濃度緩沖液中，得到細(xì)胞混合物；每升低濃度緩沖液中含有以下組分：6g的NaCl、0.2g的KCl，2mg的L-谷氨酸、2mg的甘氨酸、2g的葡萄糖，溶劑為雙蒸水。步驟6，將第二次上清液、第三次上清液和細(xì)胞混合物混合均勻，并用吸管吹打，然后用紗布過濾掉心肌組織沉淀物，收集慮液，并將收集的濾液經(jīng)10000r/min，4℃，離心10min，得到分離后的心肌細(xì)胞沉淀。實(shí)施例2一種新生大鼠的心肌細(xì)胞分離方法，包括以下步驟：步驟1，將新鮮離體的心臟放入4℃預(yù)冷的保護(hù)液中，剪取心室肌組織，并用沖洗液洗凈，再用眼科剪將心室肌組織剪成1mm×1mm×1mm的小塊，然后于沖洗液中浸泡5min，用紗布過濾，得到心肌組織樣品，備用；每升所述保護(hù)液含有以下組分：8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3，溶劑為雙蒸水；每升沖洗液中含有以下組分：9g的NaCl、0.3g的KCl，溶劑為雙蒸水。步驟2，將心肌組織樣品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化5min，棄去上清液，得到第一次沉淀物。步驟3，將第一次沉淀物置于高濃度緩沖液中浸泡3min，過濾，收集第二次上清液和第二次沉淀物；每升高濃度緩沖液中含有以下組分：8.5g的NaCl、0.25g的KCl，溶劑為雙蒸水。步驟4，將第二次沉淀物置于消化液中，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，37℃消化5min，過濾，收集第三次上清液和第三次沉淀物；步驟5，將第三次沉淀物置于低濃度緩沖液中浸泡3min，使心肌細(xì)胞分散于低濃度緩沖液中，得到細(xì)胞混合物；每升低濃度緩沖液中含有以下組分：6g的NaCl、0.2g的KCl，4mg的L-谷氨酸、4mg的甘氨酸、1g的葡萄糖，溶劑為雙蒸水。步驟6，將第二次上清液、第三次上清液和細(xì)胞混合物混合均勻，并用吸管吹打，加入胎牛血清，胎牛血清與所述細(xì)胞混合物的質(zhì)量比例為5～10:100，靜置2min，然后過濾掉心肌組織沉淀物，收集慮液，并將收集的濾液經(jīng)10000r/min，4℃，離心10min，得到分離后的心肌細(xì)胞沉淀。為了驗(yàn)證本發(fā)明的方法可以減緩長時(shí)間的消化作用引起的心肌細(xì)胞變形缺陷，我們對實(shí)施例1的方法獲得的心肌細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果如圖1所示，分離得到的心肌細(xì)胞呈邊緣規(guī)則的圓形或者桿狀，細(xì)胞形態(tài)良好。進(jìn)一步的，我們分別對實(shí)施例1的方法、對照組1的方法、對照組2的方法分離得到的成年大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行存活率進(jìn)行測定。其中，對照組1的方法為：除將步驟5的低濃度緩沖液分別替換為步驟3中使用的高濃度緩沖液之外，其他操作步驟均同實(shí)施例1。對照組2的方法為：步驟(1)，將新鮮離體的心臟放入4℃預(yù)冷的保護(hù)液中，剪取心室肌組織，并用沖洗液洗凈，再用眼科剪將心室肌組織剪成1mm×1mm×1mm的小塊，用紗布過濾，得到心肌組織樣品，備用；每升所述保護(hù)液含有以下組分：8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3,溶劑為雙蒸水。步驟(2)，將心肌組織樣品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化8min，棄去上清液，得到初始沉淀物。步驟(3)，將初始沉淀物置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化8min，并用吸管吹打，然后過濾掉心肌組織沉淀物，收集慮液，并將收集的濾液經(jīng)10000r/min，4℃，離心10min，得到分離后的心肌細(xì)胞沉淀。實(shí)施例1的方法、對照組1的方法、對照組2的方法分離得到的成年大鼠心肌細(xì)胞存活率(采用常規(guī)方法測定心肌細(xì)胞存活率)如表1所示，結(jié)果表明實(shí)施例1的方法中，心肌細(xì)胞存活率最高，為89.3％，且細(xì)胞分離程度良好，說明長時(shí)間的消化作用對心肌細(xì)胞的存活率影響較低。對照組1的方法中，由于步驟3和步驟5均采用的是高濃度緩沖液，不存在鉀離子濃度的降低，缺少了對心肌細(xì)胞產(chǎn)生的刺激，故心肌細(xì)胞活性稍低。對照組2的方法中，既沒有鉀離子濃度的變化，也沒有調(diào)節(jié)溶液的pH，在心肌組織消化過程中，基本上沒有采用保護(hù)措施，細(xì)胞分離程度一般，細(xì)胞存活率最低，不利于后續(xù)傳代培養(yǎng)。表1不同處理方法的新生大鼠心肌細(xì)胞存活率實(shí)施例1對照組1對照組2百分比(％)89.375.658.0細(xì)胞分離程度良好良好一般能否傳代能能傳代細(xì)胞存活率不高細(xì)胞存活時(shí)間4天4天3天盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3