本發(fā)明皮膚及毛囊再生技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種皮膚及毛囊再生的氣液界面三維培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：
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毛囊周圍具有皮膚，皮膚作為機(jī)體最大的器官，包裹著整個(gè)機(jī)體，同時(shí)也是內(nèi)環(huán)境與自然環(huán)境間的第一道重要保護(hù)屏障，保護(hù)機(jī)體免受環(huán)境中各種因素的侵襲，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。其中毛囊作為皮膚的主要附屬器官在胚胎時(shí)期已經(jīng)開始發(fā)育，毛囊是包圍在毛發(fā)根部的囊狀組織，內(nèi)層是上皮組織性毛囊與表皮相連，外層是結(jié)締組織性毛囊與真皮相連。成熟毛囊由上皮部分的外根鞘和內(nèi)根鞘以及真皮部分的毛乳頭和真皮鞘組成。毛囊的發(fā)育經(jīng)過表皮和真皮之間一系列復(fù)雜的相互作用而形成，具有自我更新和周期性生長(zhǎng)的特點(diǎn)。另外毛囊的生長(zhǎng)周期可分為生長(zhǎng)期、衰退期及休眠期，在三個(gè)周期內(nèi)毛囊的形態(tài)特征各異。

最近國(guó)內(nèi)外已經(jīng)成功研制出含有真皮和表皮的人工皮膚，但是這些皮膚并不含有毛囊，其保護(hù)屏障作用的能力大大縮小，眾所周知，毛囊在皮膚損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，不含毛囊的人工皮膚移植患處后，如果發(fā)生二次損害，將會(huì)對(duì)患者的創(chuàng)面形成難以愈合的瘢痕。另外，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)毛囊細(xì)胞生物學(xué)及毛囊干細(xì)胞修復(fù)創(chuàng)面的機(jī)制研究主要集中在活體皮膚上，同時(shí)對(duì)毛囊再生機(jī)制的研究方面也主要以體內(nèi)的毛囊生長(zhǎng)情況為主。這些研究材料的來源以活體為主，而活體受到環(huán)境的各種因素影響，因此最終的研究結(jié)果并不一定可以反映出毛囊細(xì)胞安靜狀態(tài)下的生物學(xué)特征，同時(shí)活體的可移動(dòng)性也為實(shí)驗(yàn)研究帶來不便。所以，到目前為止，對(duì)毛囊再生機(jī)制以及毛囊干細(xì)胞修復(fù)創(chuàng)面機(jī)制的研究依舊不甚明了。

一些研究學(xué)者使用毛囊真皮乳頭細(xì)胞，毛囊外根鞘細(xì)胞進(jìn)行不同比例的混合，然后注射無毛小鼠背部，嘗試誘導(dǎo)出毛囊組織，雖然結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)一些生長(zhǎng)的毛囊樣組織，但毛囊的形態(tài)觀察并不清晰，所觀察的毛囊樣組織為成團(tuán)樣，并不能區(qū)分出毛囊結(jié)構(gòu)，因此也就不能成為研究毛囊再生機(jī)制的模型。另外也有一些研究學(xué)者采用小鼠觸須毛囊進(jìn)行同體和異體移植來進(jìn)行研究毛囊生物學(xué)，雖然發(fā)現(xiàn)毛囊細(xì)胞具有一定的免疫豁免性，但是移植后的毛囊其生長(zhǎng)狀態(tài)和豁免機(jī)制的研究并沒有深入進(jìn)行，同時(shí)又有研究學(xué)者對(duì)小鼠觸須毛囊進(jìn)行不同橫切面的離斷，然后進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)狀態(tài)，但是最終的結(jié)果并不理想，離斷的毛囊組織生長(zhǎng)率太低，同時(shí)和培養(yǎng)皿發(fā)生粘連，而且毛囊組織完全侵入培養(yǎng)基中，細(xì)胞新陳代謝所釋放的有害物質(zhì)極易殺死毛囊細(xì)胞，因此所培養(yǎng)的毛囊組織再生情況并不如意，也不能清晰觀察毛囊再生狀態(tài)。

另外，在皮膚無瘢痕愈合機(jī)制方面的研究中，到目前為止，皮膚無瘢痕愈合的機(jī)制依舊沒有明確，創(chuàng)面無疤痕愈合的現(xiàn)象從目前的研究結(jié)果來看，創(chuàng)面無瘢痕這一現(xiàn)象僅僅發(fā)生在組織胚胎前中期，到胚胎后期卻無法達(dá)到創(chuàng)面的無瘢痕愈合結(jié)局。而且研究胚胎創(chuàng)面無瘢痕愈合機(jī)制所需要的孕鼠量大，而且跟蹤大量小鼠發(fā)情期，以及為小鼠受孕，并記錄小鼠胚胎天數(shù)，工作量大，且極易出現(xiàn)混亂。同時(shí)對(duì)活體孕鼠子宮進(jìn)行外科造創(chuàng)，然而造創(chuàng)后且縫合子宮的孕鼠后期生存率極低，手術(shù)操作不當(dāng)會(huì)造成孕鼠傷口感染，導(dǎo)致孕鼠大量死亡，因此最終得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不是預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

目前，毛囊和皮膚是細(xì)胞生物學(xué)和皮膚創(chuàng)面修復(fù)及皮膚病學(xué)等學(xué)科研究的熱點(diǎn)，它涉及毛囊干細(xì)胞的定位、毛囊的形態(tài)學(xué)分析、毛囊信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和真皮和表皮之間的相互作用等多個(gè)方面的生物學(xué)功能研究。而且現(xiàn)在已經(jīng)初步闡明和定位毛囊干細(xì)胞的所在位置，即毛囊外根鞘的隆突部。因此，如何利用毛囊干細(xì)胞研究毛囊再生機(jī)制以及研究毛囊干細(xì)胞對(duì)創(chuàng)面修復(fù)的機(jī)制已成為當(dāng)前研究的發(fā)展趨勢(shì)。

現(xiàn)有技術(shù)中沒有在體外成功建立毛囊再生模型及胚胎皮膚無瘢痕愈合模型；目前的培養(yǎng)方法模擬機(jī)體生理環(huán)境，不穩(wěn)定，容易受外界環(huán)境影響；不能在體外快速建立所需再生模型和無瘢痕愈合模型，在試驗(yàn)前期建模中，浪費(fèi)大量時(shí)間和物力。

由上述可知，研制出一種體外重建毛囊組織形態(tài)和建立皮膚無瘢痕愈合模型，且具有一定生理功能的模型方法，將對(duì)研究毛囊再生機(jī)制及創(chuàng)面無瘢痕愈合機(jī)制具有重要現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種皮膚及毛囊再生的氣液界面三維培養(yǎng)方法，所述方法通過培養(yǎng)觸須毛囊外根鞘使毛囊再生，并重建毛囊的三維形態(tài)，利用新生毛囊存活時(shí)間較長(zhǎng)，新生形態(tài)規(guī)整，毛囊不易塌陷的特點(diǎn)，培養(yǎng)小室模擬機(jī)體環(huán)境，培養(yǎng)具有一定的生理功能的再生毛囊或無瘢痕愈合的胚胎皮膚；

進(jìn)一步地，所述方法包括：

S1：制作氣液界面支架

使用40μL鼠尾I型膠原蛋白混合等量PBS，無菌條件下均勻涂抹在一次性的90mm直徑的培養(yǎng)皿內(nèi)壁上，無菌眼科鑷夾取Nuclepore聚碳酸酯膜，平鋪在涂滿鼠尾膠原的培養(yǎng)皿中，封口膜封住培養(yǎng)皿，紫外線照射30min,待其鼠尾I型膠原蛋白和Nuclepore聚碳酸酯膜自然干燥后，放入4℃冰箱備用；

S2：制備培養(yǎng)液

使用低糖MEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，加入胎牛血清FCS，制作成5％FCS+MEM的培養(yǎng)液，2mL的5％FCS+MEM培養(yǎng)液中加入青鏈霉素100mg，培養(yǎng)毛囊外根鞘時(shí)加入BFGF(成纖維細(xì)胞堿性生長(zhǎng)因子)10ng/mL，培養(yǎng)胚胎皮膚時(shí)加入EGF(表皮生長(zhǎng)因子)8ng/mL；

S3：獲取觸須毛囊外根鞘并培養(yǎng)

斷頸法處死新生1-5d的乳鼠，整個(gè)乳鼠放入75％酒精中消毒,然后轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)，在解剖顯微鏡下用眼科剪沿乳鼠嘴角剪下雙側(cè)觸須部皮膚組織，把皮膚組織放入無菌MEM培養(yǎng)液中，在無菌液體三維環(huán)境下利用眼科鑷，分離出完整的觸須毛囊，利用眼科顯微外科刀切除毛囊毛球部部分，拔出毛囊內(nèi)根鞘，不損傷毛囊外根鞘的中上部，獲得的形態(tài)完整的毛囊外根鞘中上部，保留毛囊隆突部的完整性；

S4：獲取并培養(yǎng)胚胎皮膚

30mm培養(yǎng)皿中加入2mL配比好的培養(yǎng)液，將處理好的Nuclepore聚碳酸酯膜漂浮在培養(yǎng)液之上，利用無菌眼科鑷把毛囊外根鞘轉(zhuǎn)移到漂浮的Nuclepore聚碳酸酯膜上，放在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；

進(jìn)一步地，S1中所述氣液界面的材料采用Nuclepore聚碳酸酯微孔膜，皮重輕，可漂浮，不污染培養(yǎng)液，所述的Nuclepore聚碳酸酯膜，由高質(zhì)量聚碳酸酯薄膜制成，每張Nuclepore聚碳酸酯膜成圓形，規(guī)格不同，孔徑不同；

進(jìn)一步地，S1中所述支架由Nuclepore聚碳酸酯微孔膜經(jīng)過I型鼠尾膠原蛋白處理制得；

進(jìn)一步地，S2中所述培養(yǎng)添加物為干細(xì)胞增殖標(biāo)記物EdU，激素，抗生素或細(xì)胞因子；

進(jìn)一步地，S2中所述氣液界面培養(yǎng)中的培養(yǎng)基為DMEM、MEM或RPMI-1640培養(yǎng)液；

進(jìn)一步地，S2中所述胎牛血清選用滅活支原體的進(jìn)口胎牛血清；

進(jìn)一步地，S3中所述小鼠觸須毛囊的獲取時(shí)間選取小鼠剛出生的1-5d，用于獲取小鼠觸須毛囊外根鞘，所述小鼠觸須毛囊外根鞘培養(yǎng)選取時(shí)間是1-6d；

進(jìn)一步地，S4中所述胎鼠皮膚獲取時(shí)間是E14-E17d，所述胎鼠皮膚培養(yǎng)選取時(shí)間是1-7d；

本發(fā)明的有益效果如下：

1)模擬機(jī)體環(huán)境在氣液界面上培養(yǎng)動(dòng)物組織(毛囊、胎鼠皮膚)，所培養(yǎng)的動(dòng)物毛囊、胚胎皮膚具有一定的生理功能，且胚胎皮膚人工微創(chuàng)后胚胎皮膚可以實(shí)現(xiàn)無疤痕愈合；

2)皮膚及毛囊再生的氣液界面三維培養(yǎng)方法為培養(yǎng)干細(xì)胞及快速建立醫(yī)學(xué)再生模型的方法，能夠從體外探索毛囊再生及皮膚無瘢痕愈合機(jī)制；

3)本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，操作簡(jiǎn)單，易在短時(shí)間內(nèi)建立體外組織再生及創(chuàng)傷愈合模；

4)在體外成功建立毛囊再生模型及胚胎皮膚無瘢痕愈合模型；

5)培養(yǎng)方法模擬機(jī)體生理環(huán)境，穩(wěn)定，不容易受外界環(huán)境影響；

6)能在體外快速建立所需再生模型和無瘢痕愈合模型，在試驗(yàn)前期建模中，節(jié)約大量時(shí)間和物力。

附圖說明：

圖1為皮膚及毛囊再生的氣液界面三維培養(yǎng)組裝實(shí)物圖；

圖2為毛囊外根鞘培養(yǎng)3d時(shí)，冰凍切片H.E染色觀察毛囊結(jié)構(gòu)；

圖3為毛囊外根鞘培養(yǎng)5d時(shí)，冰凍切片H.E染色觀察毛囊結(jié)構(gòu)；

圖4為蔡司倒置熒光顯微鏡在紫光通道下，毛囊再生結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列圖；

圖5為毛囊外根鞘培養(yǎng)5d時(shí)，α-SMA熒光染色觀察毛囊結(jié)構(gòu)(綠色)圖；

圖6為胚胎皮膚人工微創(chuàng)培養(yǎng)3d時(shí)，冰凍切片H.E染色觀察胚胎皮膚愈合形態(tài)圖；

圖7為胚胎皮膚人工微創(chuàng)培養(yǎng)7d時(shí)，冰凍切片H.E染色觀察胚胎皮膚愈合形態(tài)圖；

圖8為添加適量干細(xì)胞標(biāo)記物EdU，毛囊外根鞘培養(yǎng)12h，免疫熒光染色觀察毛囊新生細(xì)胞(綠色)，核復(fù)染(紅色)形態(tài)圖；

圖9為添加適量干細(xì)胞標(biāo)記物EdU，胚胎皮膚培養(yǎng)12h，免疫熒光染色觀察皮膚新生細(xì)胞(綠色)，核復(fù)染(紅色)形態(tài)。

具體實(shí)施方式：

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用于解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。相反，本發(fā)明涵蓋任何由權(quán)利要求定義的在本發(fā)明的精髓和范圍上做的替代、修改、等效方法以及方案。進(jìn)一步，為了使公眾對(duì)本發(fā)明有更好的了解，在下文對(duì)本發(fā)明的細(xì)節(jié)描述中，詳盡描述了一些特定的細(xì)節(jié)部分。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說沒有這些細(xì)節(jié)部分的描述也可以完全理解本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。下面為本發(fā)明的舉出最佳實(shí)施例：

如圖1-圖9所示，本發(fā)明的目的是提供一種胚胎皮膚及觸須毛囊體外培養(yǎng)的支架方法，模擬機(jī)體生理環(huán)境，使得胚胎皮膚和毛囊活性在體外的活性提高并延長(zhǎng)生長(zhǎng)時(shí)間，從而更方便的研究胚胎皮膚無疤痕愈合及毛囊再生機(jī)制。

皮膚毛囊再生的氣液界面三維培養(yǎng)方法，其包括以下步驟：

S1：氣液界面支架的制作

Nuclepore聚碳酸酯膜，由高質(zhì)量聚碳酸酯薄膜制成，每張Nuclepore聚碳酸酯膜成圓形，規(guī)格不同，孔徑不同，使用40μL鼠尾I型膠原蛋白混合等量PBS，無菌條件下均勻涂抹在一次性的90mm直徑的培養(yǎng)皿內(nèi)壁上，無菌眼科鑷夾取Nuclepore聚碳酸酯膜，平鋪在涂滿鼠尾膠原的培養(yǎng)皿中，封口膜封住培養(yǎng)皿，紫外線照射30min,待其鼠尾I型膠原蛋白和Nuclepore聚碳酸酯膜自然干燥后，放入4℃冰箱備用。

S2：培養(yǎng)液的制備

試驗(yàn)中使用低糖MEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，加入胎牛血清(FCS)，制作成5％FCS+MEM的培養(yǎng)液，2mL的5％FCS+MEM培養(yǎng)液中加入青鏈霉素100mg，培養(yǎng)毛囊外根鞘時(shí)加入BFGF(成纖維細(xì)胞堿性生長(zhǎng)因子)10ng/mL，培養(yǎng)胚胎皮膚時(shí)加入EGF(表皮生長(zhǎng)因子)8ng/mL。

S3:觸須毛囊外根鞘的獲取及培養(yǎng)

斷頸法處死新生1-5d的乳鼠，整個(gè)乳鼠放入75％酒精中消毒,然后轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)，在解剖顯微鏡下用眼科剪沿乳鼠嘴角剪下雙側(cè)觸須部皮膚組織，把皮膚組織放入無菌MEM培養(yǎng)液中，在無菌液體三維環(huán)境下利用眼科鑷，分離出完整的觸須毛囊，利用眼科顯微外科刀切除毛囊毛球部部分，小心拔出毛囊內(nèi)根鞘，不要損傷毛囊外根鞘的中上部，獲得的形態(tài)完整的毛囊外根鞘中上部，保留毛囊隆突部的完整性。

在30mm培養(yǎng)皿中加入2mL配比好的培養(yǎng)液，將處理好的Nuclepore聚碳酸酯膜漂浮在培養(yǎng)液之上，利用無菌眼科鑷把毛囊外根鞘轉(zhuǎn)移到漂浮的Nuclepore聚碳酸酯膜上，放在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

S4:胚胎皮膚的獲取及培養(yǎng)

取孕齡為14-17d(E14-E17)之間的孕鼠，斷頸法處死孕鼠，浸泡于75％酒精10min,無菌PBS中清洗3次,超凈臺(tái)內(nèi)無菌條件下，將子宮取出，在無菌PBS中清洗3次，清除表面殘留血液及粘液。剪開子宮后,取出帶有胎膜的胚胎,無菌PBS中清洗3次。用鑷子撕破胎膜,取出胎鼠。將胎鼠在無菌PBS中沖洗后用眼科剪剪去尾巴及四肢,并用眼科剪沿背部?jī)蓚?cè)剪開,用鑷子小心剝離胎鼠背部皮膚，使用顯微眼科手術(shù)刀把胚胎皮膚切成規(guī)則四邊形。并用打孔器在四邊形皮膚中心造創(chuàng)，測(cè)量并記錄造創(chuàng)口直徑。30mm培養(yǎng)皿中加入2mL配比好的培養(yǎng)液，將處理好的Nuclepore聚碳酸酯膜漂浮在培養(yǎng)液之上，利用無菌眼科鑷把毛囊外根鞘轉(zhuǎn)移到漂浮的Nuclepore聚碳酸酯膜上，放在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

實(shí)施例1：

(1)氣液界面支架的制作：

Nuclepore聚碳酸酯膜，由高質(zhì)量聚碳酸酯薄膜制成，每張Nucle-pore聚碳酸酯膜成圓形，規(guī)格不同，孔徑不同，使用40μL鼠尾I型膠原蛋白混合等量PBS，無菌條件下均勻涂抹在一次性的90mm直徑的培養(yǎng)皿內(nèi)壁上，無菌眼科鑷夾取Nuclepore聚碳酸酯膜，平鋪在涂滿鼠尾膠原的培養(yǎng)皿中，封口膜封住培養(yǎng)皿，紫外線照射30min,待其鼠尾I型膠原蛋白和Nuclepore聚碳酸酯膜自然干燥后，放入4℃冰箱備用。

(2)培養(yǎng)液的制備：

實(shí)驗(yàn)中使用低糖MEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，加入胎牛血清(FCS)，制作成5％FCS+MEM的培養(yǎng)液，2mL的5％FCS+MEM培養(yǎng)液中加入青鏈霉素50mg/mL，培養(yǎng)毛囊外根鞘時(shí)加入BFGF(成纖維細(xì)胞堿性生長(zhǎng)因子)10ng/mL，培養(yǎng)胚胎皮膚時(shí)加入EGF(表皮生長(zhǎng)因子)8ng/mL。

(3)觸須毛囊外根鞘的獲取及培養(yǎng)

斷頸法處死新生1-5d的乳鼠，整個(gè)乳鼠放入75％酒精中消毒,然后轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)，在解剖顯微鏡下用眼科剪沿乳鼠嘴角剪下雙側(cè)觸須部皮膚組織，把皮膚組織放入無菌MEM培養(yǎng)液中，在無菌液體三維環(huán)境下利用眼科鑷，分離出完整的觸須毛囊，利用眼科顯微外科刀切除毛囊毛球部部分，小心拔出毛囊內(nèi)根鞘，不要損傷毛囊外根鞘的中上部，獲得的形態(tài)完整的毛囊外根鞘中上部，保留毛囊隆突部的完整性。

35mm培養(yǎng)皿中加入2mL配比好的培養(yǎng)液，將處理好的Nuclepore聚碳酸酯膜漂浮在培養(yǎng)液之上(圖1)，利用無菌眼科鑷把毛囊外根鞘轉(zhuǎn)移到漂浮的Nuclepore聚碳酸酯膜上，放在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

毛囊外根鞘培養(yǎng)3d時(shí)，H.E染色，可以看到新生毛囊形態(tài)(圖2)。培養(yǎng)5d時(shí)，H.E染色，可以清晰看到新生毛囊形態(tài)較為飽滿(圖3)。蔡司倒置熒光顯微鏡在紫光通道下，觀察毛囊再生結(jié)構(gòu)，可見新生毛囊細(xì)胞有序排列(圖4)。毛囊外根鞘培養(yǎng)5d時(shí)，α-SMA熒光染色觀察毛囊新生骨架結(jié)構(gòu)(綠色)(圖5)。

實(shí)施例2：

取孕齡為14-17d(E14-E17)之間的孕鼠,斷頸法處死孕鼠，浸泡于75％酒精lOmin，無菌PBS中清洗3次,超凈臺(tái)內(nèi)無菌條件下，將子宮取出，在無菌PBS中清洗3次，清除表面殘留血液及粘液。剪開子宮后,取出帶有胎膜的胚胎,無菌PBS中清洗3次。用鑷子撕破胎膜,取出胎鼠。將胎鼠在無菌PBS中沖洗后用眼科剪沿背部?jī)蓚?cè)剪開,用鑷子小心剝離胎鼠背部皮膚，使用顯微眼科手術(shù)刀把胚胎皮膚切成規(guī)則四邊形。并用打孔器在四邊形皮膚中心造創(chuàng)，測(cè)量并記錄造創(chuàng)口直徑。

在30mm培養(yǎng)皿中加入2mL配比好的培養(yǎng)液，將處理好的Nucle-pore聚碳酸酯膜漂浮在培養(yǎng)液之上，利用無菌眼科鑷把毛囊外根鞘轉(zhuǎn)移到漂浮的Nuclepore聚碳酸酯膜上，放在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。胚胎皮膚人工造創(chuàng)后，培養(yǎng)3d時(shí)，H.E染色，觀察創(chuàng)面愈合情況(圖6)，胚胎皮膚人工造創(chuàng)后，培養(yǎng)7d時(shí)，H.E染色，觀察創(chuàng)面愈合情況(圖7)。

實(shí)施例3：

在Nuclepore聚碳酸酯膜上，滴加2μL干細(xì)胞增殖標(biāo)記物EdU，無菌眼科鑷把解剖獲得的毛囊外根鞘轉(zhuǎn)移到漂浮的Nuclepore聚碳酸酯膜上，并且毛囊外根鞘和干細(xì)胞增殖標(biāo)記物EdU充分接觸，放在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)12h,免疫熒光染色觀察毛囊干細(xì)胞增殖狀態(tài)(圖8)。

實(shí)施例4：

在Nuclepore聚碳酸酯膜上，滴加2μL干細(xì)胞增殖標(biāo)記物EdU，無菌眼科鑷把解剖獲得的胚胎皮膚轉(zhuǎn)移到漂浮的Nuclepore聚碳酸酯膜上，并且胚胎皮膚和干細(xì)胞增殖標(biāo)記物EdU充分接觸，放在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)12h,免疫熒光染色觀察胚胎皮膚干細(xì)胞增殖狀態(tài)(圖9)。

本發(fā)明中，Nuclepore聚碳酸酯膜：由高質(zhì)量聚碳酸酯薄膜制成，孔徑精確，有著極好的耐浸潤(rùn)和耐熱性，膜光滑平整，對(duì)樣品無污染。

鼠尾I型膠原蛋白：是一種天然培養(yǎng)基，具有促進(jìn)體外培養(yǎng)細(xì)胞(特別是上皮細(xì)胞)貼壁的作用，同時(shí)也是一種天然的黏附劑。

以上所述的實(shí)施例，只是本發(fā)明較優(yōu)選的具體實(shí)施方式的一種，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)進(jìn)行的通常變化和替換都應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。