專利名稱：一種以毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為基礎(chǔ)的毛囊重建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為基礎(chǔ)的毛
囊重建方法。
背景技術(shù)：
毛囊是哺乳動物皮膚的附屬物，具有調(diào)節(jié)體溫、感覺、分泌與排泄等生理功能。此外，通過偽裝，它能夠幫助哺乳動物逃避天敵；通過對體表裝飾，它能傳遞社會信息并在生殖行為中起作用；人類具有審美能力，毛囊的缺失如脫發(fā)等，會給患者帶來很大的精神痛苦。已有的知識表明，毛囊不僅對美容，而且在皮膚損傷(如燒傷或燙傷等)的傷口愈合和皮膚腫瘤發(fā)生中起重要作用。毛囊是哺乳動物體內(nèi)少數(shù)在成年后仍維持周期性形態(tài)變化的微型器官，近年來受到科學(xué)家們廣泛的關(guān)注和研究，但仍有很多問題需要闡明，如毛囊干細(xì)胞的來源、影響毛囊周期的因素等，而毛囊重建是其中的一個重點(diǎn)，也是一個難點(diǎn)。在哺乳動物的絕大多數(shù)毛囊中，存在著生長期、退行期和靜止期三個階段的周期性循環(huán)，毛囊重建模型對于闡明毛囊生物學(xué)的很多生理特征具有重要價值。由于毛囊是由多種細(xì)胞組成的微型器官，也使它成為研究藥物的藥理作用的理想模型。因此，綜合來看，建立一個穩(wěn)定的毛囊重建模型，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價值和科研價值。實(shí)際生活中，大面積皮膚損傷和脫發(fā)等疾病，對科研工作者們提出了皮膚和毛囊重建這一亟待解決的難題。較早用于皮膚重建的是表皮干細(xì)胞，Green(1991)從病人未被燒傷的皮膚培養(yǎng)出角質(zhì)細(xì)胞，然后移植到燒傷部位，形成了能夠自我更新的皮膚。然而，移植后生成的皮膚不能形成毛囊，所以不是真正意義上具有完整功能的皮膚。自從1990年Cotsarelis等證明毛囊干細(xì)胞位于隆突部以后，毛囊干細(xì)胞的研究獲得了長足的進(jìn)步。研究表明，毛囊干細(xì)胞在體內(nèi)能夠分化為表皮、皮脂腺和毛囊，所以毛囊干細(xì)胞是治療大面積皮膚損傷的重要種子細(xì)胞。我國對于毛囊干細(xì)胞的研究還處于起步階段，毛囊干細(xì)胞方面的研究人員很少，雖然有人做過毛囊重建的嘗試，如將毛囊隆突部細(xì)胞和真皮乳頭細(xì)胞注射到裸鼠皮下，或?qū)⒔琴|(zhì)細(xì)胞和真皮乳頭細(xì)胞用支架材料培養(yǎng)后移植到裸鼠皮膚等，都有可能獲得類似毛囊的結(jié)構(gòu)，但都存在這樣那樣的缺點(diǎn)，例如，將毛囊隆突部細(xì)胞和真皮乳頭細(xì)胞注射到皮下，雖然能夠形成毛囊類似物，但毛干不能長出皮膚表面，也不能形成表皮；而真皮乳頭細(xì)胞在體外生長非常緩慢，不易獲得足量細(xì)胞用于移植； 另外，真皮乳頭細(xì)胞在體外長時間培養(yǎng)易失去誘導(dǎo)毛囊形成的能力。這些都限制了表皮干細(xì)胞在皮膚和毛囊重建中的應(yīng)用?？梢?，還沒有建立可靠的毛囊重建方法，這一技術(shù)上的空白大大制約了毛囊干細(xì)胞研究的發(fā)展和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種毛囊重建的方法。本發(fā)明的目的是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明提供了一種毛囊重建的方
3法，其以毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為基礎(chǔ)進(jìn)行毛囊重建，具體包括以下步驟1)培養(yǎng)擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞；幻培養(yǎng)擴(kuò)增成纖維細(xì)胞；幻將步驟1)培養(yǎng)擴(kuò)增的毛囊干細(xì)胞與步驟2、培養(yǎng)擴(kuò)增的成纖維細(xì)胞混合，接種至需要毛囊重建的部位。優(yōu)選地，其中所述步驟1)中的毛囊干細(xì)胞來源于哺乳動物毛囊隆突部或背部毛囊，優(yōu)選為大鼠觸須。優(yōu)選地，所述毛囊干細(xì)胞是利用器官培養(yǎng)的方法，采用William's E完全培養(yǎng)基對毛囊進(jìn)行培養(yǎng)并分離純化而制備的。所述William’ s E完全培養(yǎng)基為在William’ s E基本培養(yǎng)基中添加以下成分10納克/毫升的表皮生長因子，5微克/毫升的胰島素，1微克 /毫升的氫化可的松，5. 8毫摩爾/升的L-谷氨酰胺，0. 115微克/毫升的維生素A，1微克 /毫升的維生素D2，1微克/毫升的轉(zhuǎn)鐵蛋白，100納克/毫升的亞油酸，20微克/毫升的牛血清白蛋白，200單位/毫升的青霉素鈉，200單位/毫升的硫酸鏈霉素，體積百分含量為 15%的胎牛血清。優(yōu)選地，其中所述步驟2、中的成纖維細(xì)胞來源于新生大鼠真皮成纖維細(xì)胞，其他來源的成纖維細(xì)胞只要狀態(tài)好，都可以使用。優(yōu)選地，所述成纖維細(xì)胞是通過37°C孵育皮膚組織塊2小時使之貼附到胎牛血清孵育過的培養(yǎng)皿后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)而制備的。優(yōu)選地，其中所述步驟幻中毛囊干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞按照2 1的細(xì)胞數(shù)量比混合，并用William’ s E完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液；更優(yōu)選地，其中所述的 William' s E完全培養(yǎng)基不含胎牛血清。優(yōu)選地，其中所述步驟幻中毛囊干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合后用硅室接種至需要毛囊重建的部位；優(yōu)選地，所述細(xì)胞的接種量為1. IXlO7個毛囊干細(xì)胞和6 X IO6個成纖維細(xì)胞。優(yōu)選地，所述方法還包括用綠色熒光蛋白標(biāo)記毛囊干細(xì)胞的步驟；優(yōu)選地，所述綠色熒光蛋白標(biāo)記毛囊干細(xì)胞是通過慢病毒感染法。此外，本發(fā)明提供了上述方法在皮膚損傷治療中用于重建皮膚和毛囊的用途；優(yōu)選地，所述皮膚損傷包括燒傷或燙傷。本發(fā)明還提供了上述方法重建的表皮和毛囊。由此可見，本發(fā)明涉及一種新的毛囊重建技術(shù)。本發(fā)明克服了表皮干細(xì)胞移植不易形成毛囊的缺點(diǎn)，以毛囊干細(xì)胞在體內(nèi)具有分化為皮膚和毛囊的能力為依據(jù)，用經(jīng)過培養(yǎng)鑒定的毛囊隆突部干細(xì)胞為種子細(xì)胞，添加適量的真皮成纖維細(xì)胞(由于毛囊干細(xì)胞屬于表皮的細(xì)胞，能重新形成表皮、毛囊和皮脂腺，但不能形成真皮，所以需要添加成纖維細(xì)胞以形成真皮一起移植)，兩者混合后，用無血清的William’ s E完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用硅室移植到裸小鼠背部。裸鼠無免疫能力，接種的細(xì)胞能繼續(xù)增殖和分化，7周后形成皮膚和毛囊。由于毛囊干細(xì)胞能長期大量傳代，真皮成纖維細(xì)胞取材和培養(yǎng)方便，細(xì)胞移植方法簡單并且易于操作，故本發(fā)明有很強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用前景和科研潛力，是大面積皮膚損傷(如燒傷和燙傷等)治療中重建皮膚和毛囊的重要方法，也是科學(xué)研究中證明是否為毛囊干細(xì)胞的首選方法。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，涉及的主要技術(shù)路線包括(1)培養(yǎng)擴(kuò)增毛囊隆突部干細(xì)胞；
(2)培養(yǎng)擴(kuò)增真皮成纖維細(xì)胞；(3)用慢病毒感染法將毛囊干細(xì)胞標(biāo)記為表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞；(4)將裸鼠背部皮膚剪掉合適大??；(5)將毛囊干細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞混合，用硅室接種到裸鼠背部；(6)適時冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡下觀察和照相。本發(fā)明所具有的主要特點(diǎn)及所能達(dá)到的有益效果為將裸鼠原來皮膚剪掉，用單細(xì)胞懸液重建皮膚和毛囊，是真正意義上的皮膚和毛囊重建；毛囊干細(xì)胞用綠色熒光蛋白標(biāo)記，便于追蹤干細(xì)胞的去向；真皮成纖維細(xì)胞取材方便；用硅室接種細(xì)胞，避免細(xì)菌污染，重建效率高。綜上所述，本發(fā)明以毛囊隆突部干細(xì)胞為種子細(xì)胞，添加適量的真皮成纖維細(xì)胞， 兩者混合后，用硅室(silicon chamber)移植到裸鼠背部，形成了皮膚和毛囊。由于毛囊干細(xì)胞能長期大量傳代，真皮成纖維細(xì)胞取材方便，細(xì)胞移植方法簡單并且易于操作，故本發(fā)明有很強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用前景和科研潛力。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖1綠色熒光蛋白標(biāo)記的成年大鼠觸須毛囊干細(xì)胞的照片；其中A是綠色熒光蛋白標(biāo)記成年大鼠觸須毛囊干細(xì)胞的一個克隆在明視場下的照片；B是該克隆表達(dá)的綠色熒光蛋白在激發(fā)光下顯示出綠色。圖2是將毛囊干細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞混合，用硅室接種到裸鼠背部。圖3是手術(shù)7周后形成的毛囊之一在高倍鏡下的照片；其中A為明視場下的照片， 毛囊形態(tài)清晰可見，已經(jīng)形成明顯的毛干；B為激光共聚焦顯微鏡照片，顯示該毛囊中的細(xì)胞高表達(dá)綠色熒光蛋白，證明該毛囊是由接種的成年大鼠觸須毛囊干細(xì)胞分化形成。 圖4是手術(shù)10周后傷口愈合處皮膚冰凍切片在低倍鏡下的照片，表示新形成的表皮和毛囊；A為激光共聚焦顯微鏡照片，顯示用綠色熒光蛋白標(biāo)記的成年大鼠觸須毛囊干細(xì)胞分化為表皮和毛囊，而傷口愈合處的裸鼠皮膚不表達(dá)綠色熒光蛋白，為陰性對照；B是該組織切片的明視場照片，可以看到毛干已經(jīng)伸長到表皮外側(cè)；C是前兩者的疊加照片。圖5是手術(shù)10周后傷口愈合處皮膚冰凍切片在低倍鏡下的照片，表示新形成的皮膚中皮脂腺的位置；A為激光共聚焦顯微鏡照片，顯示用綠色熒光蛋白標(biāo)記的成年大鼠觸須毛囊干細(xì)胞分化為皮脂腺，而傷口愈合處的裸鼠皮膚不表達(dá)綠色熒光蛋白，為陰性對照； B是明視場照片，可以看到新形成的皮膚長出很多毛囊，毛干已經(jīng)伸長到表皮外側(cè)；C是前兩者的疊加照片。
具體實(shí)施例方式以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中使用的磷酸鹽緩沖液除非特別指出，均為pH值為7. 3的磷酸鹽緩沖液，其配方如下(IL) 0. 2g KCl,0. 24g KH2P04，8g NaCl，1. 44g 無水 Na2HPO4。實(shí)施例1成年大鼠毛囊干細(xì)胞的制備
本實(shí)施例以成年大鼠觸須毛囊干細(xì)胞為例，詳細(xì)說明制備作為本發(fā)明毛囊重建的種子細(xì)胞的方法，具體如下。實(shí)驗(yàn)動物的飼養(yǎng)和使用按照中國科學(xué)院動物研究所動物與醫(yī)學(xué)倫理委員會的規(guī)定執(zhí)行。一.大鼠觸須毛囊的顯微剝離取一小塊成年Wistar大鼠(中國科學(xué)院動物研究所)觸須部皮膚，用75%酒精消毒3-5分鐘；在體視鏡下，用鑷子夾住觸須毛囊靠近表皮的峽部，向真皮方向用力撕出毛囊；用29G針頭固定住毛囊，用解剖刀小心劃破真皮鞘，并將毛囊剝離出來，切斷真皮乳頭和真皮鞘間的連接。圖2示出了毛囊照片，其中A為剝離前(帶真皮鞘)，B為剝離后。二 .用William，s E完全培養(yǎng)基培養(yǎng)毛囊1.配制William，s E完全培養(yǎng)基。向William，s E基本培養(yǎng)基(購自Gibco公司)中添加以下因子，各種因子的最終濃度為10納克/毫升的表皮生長因子，5微克/毫升的胰島素，1微克/毫升的氫化可的松，5. 8毫摩爾/升的L-谷氨酰胺，0. 115微克/毫升的維生素A，1微克/毫升的維生素D2，1微克/毫升的轉(zhuǎn)鐵蛋白，100納克/毫升的亞油酸，20微克/毫升的牛血清白蛋白，200單位/毫升的青霉素鈉，200單位/毫升的硫酸鏈霉素。向添加因子后的William’ s E培養(yǎng)基中加體積百分含量為15%的胎牛血清，即為 William' s E完全培養(yǎng)基。2.將毛囊轉(zhuǎn)入6孔培養(yǎng)板，加William’ s E完全培養(yǎng)基，37°C、5% C02、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。毛囊一般在第3-7天貼壁，然后毛囊干細(xì)胞會從隆突部爬出，細(xì)胞邊緣明亮，緊密排列，為典型角質(zhì)細(xì)胞特征。三.毛囊干細(xì)胞的純化毛囊干細(xì)胞具有貼壁緊的特點(diǎn)，利用這一特點(diǎn)，在室溫25°C左右，用消化液(含有質(zhì)量百分含量為0. 的胰蛋白酶和0. 008%的EDTA的磷酸鹽緩沖液)消化時，成纖維細(xì)胞會被消化下來，而干細(xì)胞克隆仍貼在培養(yǎng)板上。用磷酸鹽緩沖液小心將消化下來的成纖維細(xì)胞收集起來，離心后可以傳代或凍存，以備用于與毛囊干細(xì)胞的共培養(yǎng)，為干細(xì)胞提供與體內(nèi)相似的模擬環(huán)境，有利于干細(xì)胞的生長。再向培養(yǎng)板中加消化液，轉(zhuǎn)到37°C培養(yǎng)箱繼續(xù)消化3-5分鐘，用磷酸鹽緩沖液收集消化下來的毛囊干細(xì)胞，離心后可以傳代或凍存。四.毛囊干細(xì)胞的傳代和增殖將單根毛囊生長出的毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞按照1 1的比例接種到IOcm培養(yǎng)皿中，加William's E完全培養(yǎng)基，37°C、5% C02、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2_3天更換培養(yǎng)液，大約2周后細(xì)胞長滿，可繼續(xù)傳代或在液氮中凍存?zhèn)溆?。?shí)施例2以成年大鼠毛囊干細(xì)胞和新生大鼠成纖維細(xì)胞為基礎(chǔ)的毛囊重建一 .成纖維細(xì)胞的制備用胎牛血清將細(xì)胞培養(yǎng)皿在37°C培養(yǎng)箱中預(yù)先孵育2小時；將新生大鼠(中國科學(xué)院動物研究所實(shí)驗(yàn)動物中心)處死，用75%酒精消毒3-5分鐘，然后用生理鹽水沖洗3遍以上；在超凈工作臺中，用消毒過的剪刀將背部皮膚剪下；用解剖刀刮除皮下脂肪；將皮膚剪成0. 5cmX0. 5cm的小塊；吸干培養(yǎng)皿中的血清，將皮膚小塊均勻地鋪在皿內(nèi)，表皮朝上， 在37°C培養(yǎng)箱中孵育2小時后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；每2天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)到需要的細(xì)胞量備用。二.毛囊干細(xì)胞的標(biāo)記
1.毛囊干細(xì)胞的準(zhǔn)備復(fù)蘇實(shí)施例1中制備并凍存的成年大鼠觸須毛囊干細(xì)胞， 按照建立的毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)體系，接種少量成纖維細(xì)胞做滋養(yǎng)層細(xì)胞，用William's E完全培養(yǎng)基在37°C、5% C02、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.毛囊干細(xì)胞用綠色熒光蛋白標(biāo)記恢復(fù)性生長M小時后，細(xì)胞生長狀態(tài)良好； 加入帶有綠色熒光蛋白基因的慢病毒儲存液(購自hvitrogen公司)，感染M小時后，換為新鮮William’s E完全培養(yǎng)基，48小時可以觀察到綠色細(xì)胞，如圖1所示，其中A是綠色熒光蛋白標(biāo)記成年大鼠觸須毛囊干細(xì)胞的一個克隆在明視場下的照片；B是該克隆表達(dá)的綠色熒光蛋白在激發(fā)光下顯示出綠色。3.綠色熒光蛋白標(biāo)記的毛囊干細(xì)胞的純化和擴(kuò)增首先利用毛囊干細(xì)胞貼壁緊的特點(diǎn)，用消化液(質(zhì)量百分含量為0. 的胰蛋白酶+0. 008%的EDTA的磷酸鹽緩沖液) 在室溫下消化，顯微鏡下觀察，待成纖維細(xì)胞脫落后，用磷酸鹽緩沖液(PH為7. 3左右)將成纖維細(xì)胞洗掉，剩余仍然貼壁的都是毛囊干細(xì)胞；然后加消化液在37°C繼續(xù)消化，收集毛囊干細(xì)胞；用適量磷酸鹽緩沖液重懸，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，只保留綠色熒光較強(qiáng)的細(xì)胞；將分選出的高表達(dá)綠色熒光蛋白的毛囊干細(xì)胞接種到IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿中擴(kuò)增，加少量成纖維細(xì)胞做共培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為William’ s E完全培養(yǎng)基在37°C、5% C02、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天更換一次培養(yǎng)液，將綠色熒光蛋白標(biāo)記的毛囊干細(xì)胞增殖到需要的細(xì)胞量備用。三.準(zhǔn)備硅室1.預(yù)先從德國購買直徑大小合適的硅室(silicon chamber，購自德國Renner GmbH公司，上蓋直徑1. 2cm，下蓋直徑1. 1cm)，清洗并且消毒。清洗消毒方法為首先在超聲波清洗儀中加雙蒸水和少量洗滌靈，洗15分鐘；然后用自來水沖洗1-2小時，雙蒸水洗2 遍，再用雙蒸水泡過夜；雙蒸水再洗1遍后，56°C烤箱內(nèi)烘干。2.將洗滌干凈的硅室用過氧乙酸消毒，密封備用。四.毛囊重建1.制備毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞混合懸液將培養(yǎng)的綠色熒光蛋白標(biāo)記的毛囊干細(xì)胞用消化液在室溫下消化，顯微鏡下觀察，待成纖維細(xì)胞脫落后，用磷酸鹽緩沖液將洗掉滋養(yǎng)層成纖維細(xì)胞，然后加消化液在37°C繼續(xù)消化至干細(xì)胞全部脫落，收集綠色熒光蛋白標(biāo)記的毛囊干細(xì)胞；將制備的新生大鼠成纖維細(xì)胞用消化液消化至細(xì)胞全部脫落，用磷酸鹽緩沖液收集，分別計數(shù)，將毛囊干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞以2 1的比例(細(xì)胞數(shù)量比)混合在一起；1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，倒掉磷酸鹽緩沖液，用不含胎牛血清的William’ s E 完全培養(yǎng)基在流式管中重懸細(xì)胞，吹勻，即為毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞懸液。2.實(shí)驗(yàn)臺提前用紫外線消毒，手術(shù)器械用75%酒精消毒，裸鼠(大于7周齡，雌雄不限，購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)腹部皮膚消毒，腹腔注射經(jīng)過過濾除菌的麻醉劑；待裸鼠麻醉后，整個背部皮膚用碘酒和75%酒精擦拭消毒，用剪刀剪掉一小塊皮膚，直徑大約1cm，與硅室的內(nèi)徑接近，小心用鑷子拉住皮膚邊緣，將硅室的下蓋塞入皮下，加入細(xì)胞懸液，每只裸鼠接種1. 1 X IO7個毛囊干細(xì)胞和6 X IO6個真皮成纖維細(xì)胞，然后蓋上上蓋。整個過程要求無菌操作，具體如圖2所示。3. 1周后，將裸鼠麻醉，去掉上蓋，使傷口慢慢干燥；2周后，去掉下蓋，使傷口愈合；定期觀察裸鼠狀態(tài)和傷口愈合情況。
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五·形態(tài)學(xué)觀察1. 7周后，用頸椎脫臼法處死裸鼠，取背部疤痕部位皮膚，立即轉(zhuǎn)到-80°C保存；用冰凍切片包埋劑(OCT，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)包埋皮膚組織，冰凍切片，切片厚度60微米。2.用4%的中性多聚甲醛溶液室溫固定切片10分鐘，磷酸鹽緩沖液洗3遍，用防淬滅劑DABCO(購自Sigma公司)封片，-20°C保存，直到用激光共聚焦顯微鏡觀察。觀察結(jié)果如圖3所示，其中A為顯微鏡明視場下的照片，毛囊形態(tài)清晰可見，表明已經(jīng)形成明顯的毛干；B為激光共聚焦顯微鏡照片，顯示該毛囊中的細(xì)胞高表達(dá)綠色熒光蛋白，證明該毛囊是由接種的成年大鼠觸須毛囊干細(xì)胞分化形成，也即綠色的組織即為綠色熒光蛋白標(biāo)記的毛囊干細(xì)胞分化形成的組織，可以發(fā)現(xiàn)毛囊干細(xì)胞已經(jīng)成功分化為表皮和毛囊(7周后)， 具體參見見圖4和圖5。
權(quán)利要求
1.一種毛囊重建方法，其以毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為基礎(chǔ)進(jìn)行毛囊重建，包括以下步驟1)培養(yǎng)擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞；2)培養(yǎng)擴(kuò)增成纖維細(xì)胞；3)將步驟1)培養(yǎng)擴(kuò)增的毛囊干細(xì)胞與步驟幻培養(yǎng)擴(kuò)增的成纖維細(xì)胞混合，接種至需要毛囊重建的部位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟1)中的毛囊干細(xì)胞來源于成年大鼠毛囊隆突部；優(yōu)選地，所述毛囊干細(xì)胞是利用器官培養(yǎng)的方法，采用William’ s E 完全培養(yǎng)基對毛囊進(jìn)行培養(yǎng)并分離純化而制備的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中所述步驟幻中的成纖維細(xì)胞來源于新生大鼠真皮成纖維細(xì)胞；優(yōu)選地，所述成纖維細(xì)胞是通過37°C孵育表皮2小時后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)而制備的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，其中所述步驟幻中毛囊干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞按照2 1的細(xì)胞數(shù)量比混合，并用William's E完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞， 制備成單細(xì)胞懸液；優(yōu)選地，其中所述的William’ s E完全培養(yǎng)基不含胎牛血清，含200單位/毫升的青霉素鈉，200單位/毫升的硫酸鏈霉素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，其中所述步驟幻中毛囊干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合后用硅室接種至需要毛囊重建的部位；優(yōu)選地，所述細(xì)胞的接種量為1. IX IO7個毛囊干細(xì)胞和6 X IO6個成纖維細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括用綠色熒光蛋白標(biāo)記毛囊干細(xì)胞的步驟；優(yōu)選地，所述綠色熒光蛋白標(biāo)記毛囊干細(xì)胞是通過慢病毒感染法。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法在皮膚損傷治療中用于重建皮膚和毛囊的用途；優(yōu)選地，所述皮膚損傷包括燒傷或燙傷。
8.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法重建的表皮和毛囊。
全文摘要
本發(fā)明提供一種以毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為基礎(chǔ)的毛囊重建方法。本發(fā)明提供的方法包括1)培養(yǎng)擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞；2)培養(yǎng)擴(kuò)增成纖維細(xì)胞；3)將步毛囊干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合，接種至需要毛囊重建的部位。由于毛囊干細(xì)胞能長期大量傳代，真皮成纖維細(xì)胞取材方便，故本發(fā)明有很強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用前景和科研潛力，是大面積皮膚損傷(如燒傷和燙傷等)治療中重建皮膚和毛囊的重要方法，也是科學(xué)研究中證明毛囊干細(xì)胞的首選方法。
文檔編號A61L27/60GK102335459SQ20101023507
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月21日
發(fā)明者劉爽, 張會閃, 張守兵, 段恩奎, 胡慧敏 申請人:中國科學(xué)院動物研究所