本發(fā)明涉及干細(xì)胞的研究領(lǐng)域，特別是涉及一種新型、高效的適用于間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法。
背景技術(shù)：
：糖尿病已成為21世紀(jì)世界范圍內(nèi)的一種流行病，是繼腫瘤、血管病變之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性非傳染性疾病，具有高致死率、高致殘率和高醫(yī)療花費(fèi)的特征。目前中國糖尿病患者人數(shù)已達(dá)1.14億，數(shù)量達(dá)到世界第一，約占全球糖尿病人總數(shù)的三分之一。因此，糖尿病已成為當(dāng)前世界各國、特別是中國面對(duì)的嚴(yán)峻的公共健康問題。20世紀(jì)中葉以后，隨著人體器官移植技術(shù)的興起與發(fā)展，胰腺移植作為糖尿病的一種治療方法被引進(jìn)醫(yī)療領(lǐng)域。但是，能供移植的器官畢竟數(shù)量有限，且器官移植所需的費(fèi)用也常常讓人望而卻步，而且器官移植往往會(huì)引起較強(qiáng)的免疫排斥，這些問題都一直困擾著醫(yī)生和患者。近年來，干細(xì)胞理論和技術(shù)的快速發(fā)展給糖尿病患者的治療帶來了新的希望。尤其是成體干細(xì)胞的橫向分化能力(即成體干細(xì)胞在一定的微環(huán)境作用下，可以橫向分化為特定的細(xì)胞和組織)的證實(shí)，為細(xì)胞移植治療糖尿病提供了另一可供選擇的細(xì)胞來源。有研究表明，骨髓間充質(zhì)細(xì)胞、成人脂肪細(xì)胞、臍血干細(xì)胞在特定的條件下可分化為胰島樣細(xì)胞，這些細(xì)胞在體外可分泌胰島素，可望成為糖尿病細(xì)胞移植治療的另一細(xì)胞來源。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞起源于中胚層，具有亞全能分化潛能，在特定的體內(nèi)外微環(huán)境條件下，可以向三個(gè)胚層的組織細(xì)胞分化。與其他成體干細(xì)胞相比，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞取材方便，來源豐富，采用的是通常被視為醫(yī)療廢棄物的臍帶組織，沒有道德倫理問題。此外，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖速度快，免疫源性相對(duì)較低，外源性污染少，因而更具有研究價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的發(fā)明人研究得到一種新型、高效的適用于間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的無血清培養(yǎng)基，利用此培養(yǎng)基可以將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在體外無血清環(huán)境下，經(jīng)過6-7天誘導(dǎo)分化為胰島素分泌樣細(xì)胞。本發(fā)明目的是提供一種采用無血清培養(yǎng)基將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌樣細(xì)胞的方法，利用該方法可以將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在6天之內(nèi)快速誘導(dǎo)為胰島素分泌樣細(xì)胞。本發(fā)明的技術(shù)方案如下。本發(fā)明提供一種用于誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)向胰島素分泌樣細(xì)胞分化的方法，所述方法包括采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述無血清培養(yǎng)基包含：高糖DMEM、血清替代物(SR)、B27無血清添加劑、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒復(fù)合物(ITS)、非必需氨基酸(NEAA)、N-2無血清添加劑，以及肝素(Heparin)、長春花堿Ⅲ(Conophylline)、尼古酰胺(Nicotinamide)和重組人堿性成纖維生長因子(b-FGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)和五肽胃泌素(Pentagastrin)。優(yōu)選地，以100體積份計(jì)，所述無血清培養(yǎng)基包含：85-95體積份的葡萄糖含量為4.5g/L的高糖DMEM、5-8體積份的血清替代物(SR)、1-4體積份的B27無血清添加劑(50×)、1-1.5體積份的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒復(fù)合物(ITS)、0.5-2體積份的非必需氨基酸(NEAA)水溶液、0.5-2體積份的N-2無血清添加劑(100×)，以及在所述無血清培養(yǎng)基中終濃度為0.5-2ug/ml的肝素(Heparin)、終濃度為50-200ng/ml的長春花堿Ⅲ(Conophylline)、終濃度為5-20mmol/L的尼古酰胺(Nicotinamide)和終濃度各自為5-20ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子(b-FGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)和五肽胃泌素(Pentagastrin)。更優(yōu)選地，以100體積份計(jì)，所述無血清培養(yǎng)基包含：89體積份的葡萄糖含量為4.5g/L的高糖DMEM、5體積份的血清替代物(SR)、2體積份的B27無血清添加劑(50×)、1體積份的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒復(fù)合物(ITS)、1體積份的非必需氨基酸(NEAA)水溶液、1體積份的N-2無血清添加劑(100×)，以及在所述無血清培養(yǎng)基中終濃度為1ug/ml的肝素(Heparin)、終濃度為100ng/ml的長春花堿Ⅲ(Conophylline)、終濃度為10mmol/L的尼古酰胺(Nicotinamide)和終濃度各自為10ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子(b-FGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)和五肽胃泌素(Pentagastrin)。其中，所述非必需氨基酸水溶液包含濃度各自為8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天門酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸。根據(jù)本申請(qǐng)的具體實(shí)施方式，所述非必需氨基酸水溶液可以采用Gibco公司貨號(hào)為11140的產(chǎn)品。根據(jù)本申請(qǐng)的具體實(shí)施方式，所述血清替代物可以采用KnockOutTMSerumReplacement(Gibco公司產(chǎn)品，貨號(hào)10828-010)。根據(jù)本申請(qǐng)的具體實(shí)施方式，所述B27無血清添加劑(50×)可以采用Gibco公司貨號(hào)為17504044的產(chǎn)品。根據(jù)本申請(qǐng)的具體實(shí)施方式，所述胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒復(fù)合物(ITS)可以采用Sigma公司貨號(hào)為I3146的產(chǎn)品。根據(jù)本申請(qǐng)的具體實(shí)施方式，所述N-2無血清添加劑(100×)可以采用Gibco公司貨號(hào)為17502048的產(chǎn)品。以所述無血清培養(yǎng)基的總量為100mL計(jì)，其組成可以為下表1所示情況。表1優(yōu)選地，所述無血清培養(yǎng)基的組成可以為下表2所示情況。表2成分用量高糖DMEM培養(yǎng)基(葡萄糖含量4.5g/L)89mlSR5mlB27(50X)2mlITS1mlN-2(100X)1mlNEAA1mlHeparin100ugConophylline(100μg/ml)10μgNicotinamide1mmolb-FGF(1μg/ml)1μgEGF1μgHGF1μgPentagastrin1μg本發(fā)明提供的上述無血清培養(yǎng)基通過包括以下步驟的方法制得：將各個(gè)成分混合均勻。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)為人來源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)，更優(yōu)選為從自然分娩或剖宮產(chǎn)的健康新生兒新鮮臍帶組織分離出的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的用于誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌樣細(xì)胞分化的方法包括以下步驟：(1)將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以2-6×104個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于所述無血清培養(yǎng)基中，然后在CO25％、37℃下培養(yǎng)，例如在CO2濃度為5％的37℃恒溫培養(yǎng)箱中；(2)每2-3天將步驟(1)的細(xì)胞培養(yǎng)物于300-800rpm下離心4min，吸棄舊培養(yǎng)基，更換為新鮮的所述無血清培養(yǎng)基；例如，用移液管緩慢吸取舊培養(yǎng)基細(xì)胞懸液于離心管中，在300-800rpm下低速離心4min，然后吸棄舊培養(yǎng)基，更換為新鮮本發(fā)明誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每2-3天換液一次；(3)培養(yǎng)6-7天，收獲細(xì)胞；(4)檢測步驟(3)的所收獲細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效果。其中，所述步驟(4)包括檢測以下項(xiàng)目中的一項(xiàng)或多項(xiàng)(優(yōu)選全部項(xiàng))：單位細(xì)胞胰島素釋放量；胰島素釋放相關(guān)基因PDX-1、INSULIN和NGN-3的表達(dá)；細(xì)胞核蛋白PDX-1和胞漿蛋白Insulin的存在；胰島素分泌樣細(xì)胞特異性標(biāo)志PDX-1、NKX6.1、Insulin的陽性表達(dá)率。更優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：(1)將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于超低吸附六孔培養(yǎng)板中的所述無血清培養(yǎng)基中，然后在CO25％、37℃下培養(yǎng)，例如在CO2濃度為5％的37℃恒溫培養(yǎng)箱中；(2)每2天將步驟(1)的細(xì)胞培養(yǎng)物于500rpm下離心4min，吸棄舊培養(yǎng)基，更換為新鮮的所述無血清培養(yǎng)基；例如，用移液管緩慢吸取舊培養(yǎng)基細(xì)胞懸液于離心管中，在500rpm下低速離心4min，然后吸棄舊培養(yǎng)基，更換為新鮮本發(fā)明誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每2天換液一次；(3)培養(yǎng)6-7天，收獲細(xì)胞；(4)檢測步驟(3)的所收獲細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效果。步驟(1)中，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)為人來源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)，更優(yōu)選為從自然分娩或剖宮產(chǎn)的健康新生兒新鮮臍帶組織分離出的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的新型間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的無血清培養(yǎng)基不含血清成分，避免了在細(xì)胞培養(yǎng)過程中因血清批次差異導(dǎo)致細(xì)胞生長過程不穩(wěn)定的情況，也排除了傳播異種病原體危險(xiǎn)的可能；并且，該無血清培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)了快速將間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌樣干細(xì)胞(僅需6天時(shí)間)，為動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)提供了一種高效的解決方案。附圖說明以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：圖1是在培養(yǎng)基組成篩選過程中的細(xì)胞團(tuán)數(shù)量(直徑＞50μm)隨培養(yǎng)時(shí)間變化趨勢圖。圖2是在不同濃度五肽胃泌素的培養(yǎng)基中單位細(xì)胞胰島素釋放量的比較。圖3是不同濃度ITS的培養(yǎng)基中細(xì)胞形態(tài)的比較，其中圖3A為0.5體積ITS誘導(dǎo)6天的細(xì)胞形態(tài)，圖3B為1.0體積ITS誘導(dǎo)6天的細(xì)胞形態(tài)，圖3C為2.0體積ITS誘導(dǎo)6天的細(xì)胞形態(tài)。圖4是使用本發(fā)明的培養(yǎng)基誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌樣細(xì)胞分化過程中(10天內(nèi))的細(xì)胞團(tuán)數(shù)量(直徑＞100μm)隨培養(yǎng)時(shí)間變化趨勢圖。圖5是使用本發(fā)明的培養(yǎng)基誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌樣細(xì)胞分化過程中(6天內(nèi))的細(xì)胞團(tuán)形態(tài)變化。圖6為流式細(xì)胞儀分析經(jīng)本發(fā)明培養(yǎng)基誘導(dǎo)得到的胰島素分泌樣細(xì)胞特異性細(xì)胞表面分子結(jié)果，圖6A為誘導(dǎo)前后PDX-1變化，圖6B為誘導(dǎo)前后NKx6.1變化，圖6C為誘導(dǎo)前后insulin變化，左圖為誘導(dǎo)前，右圖為誘導(dǎo)6天后。圖7為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)本發(fā)明培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化得到的胰島素分泌樣細(xì)胞特異性基因在轉(zhuǎn)錄水平的RT-PCR分析，圖7A為誘導(dǎo)前，圖7B為誘導(dǎo)6天后；其中M為核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為內(nèi)參基因GAPDH，2為PDX-1，3為INSULIN，4為NGN-3。圖8為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)本發(fā)明培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化得到的胰島素分泌樣細(xì)胞特異性基因在蛋白水平的分析，其中圖8A為核蛋白PDX-1染色，圖8B為胞漿蛋白INSULIN染色，圖8C為合并疊圖。圖9為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過本發(fā)明培養(yǎng)基誘導(dǎo)得到的胰島素分泌樣干細(xì)胞在低糖和高糖每104細(xì)胞釋放胰島素量檢測，其中陰性組為誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)組為誘導(dǎo)6天后，陽性對(duì)照組為胰島素瘤細(xì)胞。具體實(shí)施方式以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。實(shí)施例中采用的NEAA為非必需氨基酸水溶液，其包含濃度均為10mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天門酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸。實(shí)施例1培養(yǎng)基組成的篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM(葡萄糖含量4.5g/L)+5％SR+1％NEAA+2％B27(50X)+1％N-2(100X)+10ng/mlHGF+10ng/mlEGF+10ng/mlb-FGF+10mmol/LNicotinamide；篩選成分：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加100ng/ml長春花堿Ⅲ(Conophylline)、1體積份的ITS、終濃度為1ug/ml肝素(Heparin)、以及終濃度均為10ng/mlβ細(xì)胞調(diào)節(jié)素(betacellulin)、唾液素4(Exendi-4)、胰島素樣生長因子(IGF-1)和五肽胃泌素。各分組情況如下表3所示。表3在生物安全柜內(nèi)，取分離于自然分娩新生兒臍帶華通式膠組織的第3代的hUC-MSCs，以5×104個(gè)細(xì)胞/cm2密度接種于超低吸附六孔板中，每孔加2ml表3中所示各組受試培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情況，觀察細(xì)胞成團(tuán)數(shù)量。結(jié)果：第一組培養(yǎng)基中，細(xì)胞團(tuán)數(shù)量少；第二、三、四組培養(yǎng)基中依次添加了長春花堿Ⅲ、五肽胃泌素以及肝素，細(xì)胞團(tuán)數(shù)量有所增加，但細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)不緊湊；第五組細(xì)胞團(tuán)數(shù)量最多，同時(shí)細(xì)胞團(tuán)成熟度最好；第六、七、八組依次添加β細(xì)胞調(diào)節(jié)素、唾液素4、胰島素樣生長因子，但這三種因子在細(xì)胞團(tuán)數(shù)增加影響不大。結(jié)果參見圖1。實(shí)施例2培養(yǎng)基成分(長春花堿Ⅲ)含量的篩選受試培養(yǎng)基：89體積份的高糖DMEM(葡萄糖含量4.5g/L)、5體積份的血清替代物(SR)、2體積份的B27(50X)、1體積份的ITS、1體積份的非必需氨基酸(NEAA)、1體積份的N-2(100X)、終濃度為1ug/ml的肝素(Heparin)、10mmol/L的尼古酰胺、終濃度均為10ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子(b-FGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、五肽胃泌素以及濃度梯度為1、10、50、100、200、300ng/ml的長春花堿Ⅲ(Conophylline)。采用上述不同濃度長春花堿Ⅲ(Conophylline)的培養(yǎng)基進(jìn)行人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。結(jié)果：在濃度為1和10ng/ml長春花堿Ⅲ的兩組受試培養(yǎng)基中，細(xì)胞團(tuán)邊緣出現(xiàn)游離細(xì)胞附著，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞團(tuán)松散，表明細(xì)胞團(tuán)成熟度不夠；在濃度為50、100和200ng/ml長春花堿Ⅲ的三組受試培養(yǎng)基中，細(xì)胞團(tuán)緊湊，且細(xì)胞團(tuán)逐漸增大，表明細(xì)胞團(tuán)增殖狀況良好；在濃度為300ng/ml長春花堿Ⅲ受試組中，細(xì)胞團(tuán)顏色加深，但細(xì)胞團(tuán)邊緣細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，表明已分化細(xì)胞發(fā)生了不定向分化。實(shí)施例3培養(yǎng)基成分(五肽胃泌素)含量的篩選受試培養(yǎng)基：89體積份的高糖DMEM(葡萄糖含量4.5g/L)、5體積份的血清替代物(SR)、2體積份的B27(50X)、1體積份的ITS、1體積份的非必需氨基酸(NEAA)、終濃度為1ug/ml肝素(Heparin)、1體積份的N-2(100X)、100ng/ml的長春花堿Ⅲ(Conophylline)、10mmol/L的尼古酰胺、終濃度均為10ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子(b-FGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)以及濃度梯度為1、2、5、10、20、30、50ng/ml的五肽胃泌素。采用上述不同濃度五肽胃泌素的培養(yǎng)基進(jìn)行人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，然后采用糖刺激實(shí)驗(yàn)，測定單位細(xì)胞(1×104個(gè))各組胰島素釋放量，進(jìn)行了各組細(xì)胞的比較。其中糖刺激實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行：收集培養(yǎng)6天的細(xì)胞團(tuán)，分別加入2ml25mM/L葡萄糖DMEM刺激液，輕輕吹散混勻細(xì)胞團(tuán)，37℃，刺激2小時(shí)后收集上清，以胰島素ELISA試劑盒測收集上清，最終讀取OD450值。結(jié)果：在五肽胃泌素濃度為5、10、20ng/ml的培養(yǎng)基中分化的細(xì)胞具有較高的單位細(xì)胞胰島素釋放量效果。結(jié)果參見圖2。實(shí)施例4培養(yǎng)基成分(ITS)含量的篩選受試培養(yǎng)基：89體積份的高糖DMEM(葡萄糖含量4.5g/L)、5體積份的血清替代物(SR)、2體積份的B27(50X)、1體積份的ITS、1體積份的非必需氨基酸(NEAA)、終濃度為1ug/ml的肝素(Heparin)、1體積份的N-2(100X)、100ng/ml的長春花堿Ⅲ(Conophylline)、10mmol/L的尼古酰胺、終濃度均為10ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子(b-FGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、五肽胃泌素以及濃度梯度為0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0ng/ml的ITS。采用上述不同濃度ITS的培養(yǎng)基進(jìn)行人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。結(jié)果：在ITS濃度為0.2、0.5、0.8ng/ml的培養(yǎng)基中，細(xì)胞出現(xiàn)松散死亡，細(xì)胞團(tuán)直徑較小，且不均勻，培養(yǎng)皿底部死細(xì)胞較多；在ITS濃度為1.0、1.2、1.5ng/ml的培養(yǎng)基中，細(xì)胞成團(tuán)緊密；在ITS濃度為2.0ng/ml的培養(yǎng)基中，細(xì)胞團(tuán)雖然緊密，但死細(xì)胞數(shù)量又出現(xiàn)，開始增加。結(jié)果參見圖3。實(shí)施例5誘導(dǎo)時(shí)間篩選無血清誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基制備：配方：89體積份的高糖DMEM(葡萄糖含量4.5g/L)、5體積份的血清替代物(SR)、2體積份的B27(50X)、1體積份的ITS、1體積份的非必需氨基酸(NEAA)、1體積份的N-2(100X)、終濃度為1ug/ml肝素(Heparin)、100ng/ml長春花堿Ⅲ(Conophylline)、10mmol/L尼古酰胺、以及終濃度均為10ng/ml重組人堿性成纖維生長因子(b-FGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、五肽胃泌素。各成分混合均勻后制成培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)：在生物安全柜內(nèi)，取分離于自然分娩新生兒臍帶華通式膠組織的第3代的hUC-MSCs，將hUC-MSC以5×104個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于超低吸附六孔培養(yǎng)板，每孔加本發(fā)明誘導(dǎo)培養(yǎng)基2ml，移入CO2濃度為5％的37℃恒溫培養(yǎng)箱中；用移液管緩慢吸取舊培養(yǎng)基細(xì)胞懸液于離心管中500rpm低速離心4min吸棄舊培養(yǎng)基，更換為新鮮本發(fā)明誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每2天換液一次；持續(xù)誘導(dǎo)10天，觀察細(xì)胞團(tuán)數(shù)量變化，并計(jì)數(shù)，結(jié)果：細(xì)胞自誘導(dǎo)后細(xì)胞團(tuán)數(shù)量在前六天逐漸增加，在第6天達(dá)到最大值(223個(gè))，6天后，細(xì)胞團(tuán)數(shù)量逐漸減少。結(jié)果參見圖4。實(shí)施例6無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備及應(yīng)用無血清誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基制備：配方：89體積份的高糖DMEM(葡萄糖含量4.5g/L)、5體積份的血清替代物(SR)、2體積份的B27(50X)、1體積份的ITS、1體積份的非必需氨基酸(NEAA)、1體積份的N-2(100X)、終濃度為1ug/ml肝素(Heparin)、100ng/ml長春花堿Ⅲ(Conophylline)、10mmol/L尼古酰胺、以及終濃度均為10ng/ml重組人堿性成纖維生長因子(b-FGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、五肽胃泌素(Pentagastrin)。各成分混合均勻后制成培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)參照實(shí)施例5方法，連續(xù)六天，觀察細(xì)胞團(tuán)形態(tài)變化。結(jié)果：誘導(dǎo)第1天后，細(xì)胞團(tuán)聚，形成小細(xì)胞團(tuán)，數(shù)量多且透光性好，隨培養(yǎng)時(shí)間的延伸，小細(xì)胞團(tuán)逐漸匯集成大細(xì)胞團(tuán)，小細(xì)胞團(tuán)數(shù)量減少，大細(xì)胞團(tuán)數(shù)量逐漸增加，隨細(xì)胞團(tuán)直徑變大，細(xì)胞團(tuán)的透光性逐漸減小；在培養(yǎng)6天后，大細(xì)胞團(tuán)(成熟細(xì)胞團(tuán))占據(jù)大部分視野。結(jié)果參見圖5。實(shí)施例7流式細(xì)胞儀分析胰島素分泌樣細(xì)胞特異性表面標(biāo)志收集實(shí)施例6誘導(dǎo)分化6天的細(xì)胞團(tuán)于離心管中，然后在4℃條件下500rpm離心4min，棄上清收集細(xì)胞團(tuán)，加0.25％胰酶同時(shí)輕輕吹打混勻20min，待細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)松散，無肉眼可見細(xì)胞團(tuán)懸浮，加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，然后1200rpm離心6分鐘，棄上清收集細(xì)胞，PBS清洗兩次，將細(xì)胞每管1×105個(gè)轉(zhuǎn)移至流式管，加入500μl4％多聚甲醛，室溫固定30min，再1200rpm離心6分鐘，棄上清收集細(xì)胞，每管加入5μlPDX-1、NKX6.1、Insulin、IgG1-PE(同型對(duì)照)抗體混勻4℃下避光孵育30分鐘，PBS清洗一次，離心去上清，加500μLPBS緩沖液重懸混勻，上機(jī)檢測(流式細(xì)胞儀XL，Beckman公司)，每個(gè)樣本收集1×104個(gè)細(xì)胞。結(jié)果：間充質(zhì)干細(xì)胞在誘導(dǎo)六天后表達(dá)胰島素分泌細(xì)胞特異性標(biāo)志，流式檢測PDX-1-陽性表達(dá)率51.4％，NKx6.1陽性表達(dá)率15.36％，insulin陽性表達(dá)率24.03％。誘導(dǎo)前細(xì)胞不表達(dá)此標(biāo)志。結(jié)果參見圖6。實(shí)施例8RT-PCR分析胰島素分泌樣細(xì)胞特異性基因收集實(shí)施例6誘導(dǎo)分化6天的細(xì)胞團(tuán)于離心管中，按總RNA提取試劑盒(R6834-01，OMRGA公司產(chǎn)品)抽提RNA，將抽提的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR014A，TAKARA產(chǎn)品)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA樣本，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后移至凝膠成像儀觀察。結(jié)果：誘導(dǎo)后表達(dá)胰島素分泌樣細(xì)胞標(biāo)志基因，PDX-1、INSULIN以及NGN-3有明亮程度不同的條帶。結(jié)果參見圖7。實(shí)施例9免疫熒光染色分析hUC-MSCs特異性蛋白收集實(shí)施例6誘導(dǎo)分化6天的細(xì)胞團(tuán)于離心管中，以4％多聚甲醛固定15分鐘后用0.25％TritonX-100打孔處理20分鐘，山羊血清封閉后加稀釋好的紅色鼠抗人(抗-Insulin抗體)，在4℃下過夜避光孵育；之后然后以染PDX-1核蛋白，在4℃下過夜避光孵育，熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果：以本發(fā)明方法誘導(dǎo)分化得到胰島素分泌樣細(xì)胞在蛋白水平表達(dá)INSULIN和PDX-1特異性蛋白。結(jié)果參見圖8。實(shí)施例10單位細(xì)胞胰島素分泌量檢測收集實(shí)施例6誘導(dǎo)分化6天的細(xì)胞團(tuán)于離心管中，棄上清，PBS重懸細(xì)胞團(tuán)，輕緩吹吸，500rpm離心3分鐘；棄PBS后分別加入5.5mM/L葡萄糖DMEM刺激液(低糖組)和25mM/L葡萄糖DMEM刺激液(高糖組)，輕輕吹散混勻細(xì)胞團(tuán)，37℃，5％CO2條件下，刺激2小時(shí)；500rpm離心3分鐘，收集上清備測；ELISA檢測胰島素分泌量；陽性對(duì)照組為胰島細(xì)胞瘤。結(jié)果：經(jīng)過本發(fā)明培養(yǎng)基誘導(dǎo)得到的胰島素分泌樣干細(xì)胞在高糖刺激下每104細(xì)胞釋放胰島素4.393uIU/ml，陽性對(duì)照組在高糖刺激下每104細(xì)胞釋放胰島素6.9828uIU/ml。誘導(dǎo)組＝62.91％陽性組。結(jié)果參見圖9。以上對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3