本發(fā)明微生物應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體公布的是一種解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在植物病害生防細(xì)菌中，應(yīng)用較多的是芽孢桿菌(Bacillusspp.)。它是一類重要的微生物資源，因其能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線、電磁輻射和有機(jī)溶劑的芽孢，可以耐受各種不良的環(huán)境條件。田間應(yīng)用已證實(shí)，芽孢桿菌的生防菌劑在穩(wěn)定性、與化學(xué)農(nóng)藥的相容性和在不同植物不同年份防效的一致性等方面明顯優(yōu)于非芽孢桿菌和真菌生防菌劑。并且可以將芽孢桿菌做成粉劑、液劑。粉劑容易儲(chǔ)存，便于運(yùn)輸，大規(guī)模生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本較低。因此，芽孢桿菌是目前一種較為理想的生防微生物。對(duì)于植物病害生防菌而言，大多數(shù)是從植物根際土壤中分離獲得的，但是由于土壤微生物在與土壤習(xí)居微生物的競(jìng)爭(zhēng)中不占優(yōu)勢(shì)，且不易長(zhǎng)期定殖生存，所以實(shí)際防病效果不太理想。植物內(nèi)生細(xì)菌由于其生活史的一定階段或者全部階段生活于健康植物各種組織和器官內(nèi)部，能經(jīng)受住植物自身的防衛(wèi)反應(yīng)，受外界環(huán)境影響小，能與病原菌直接相互作用，從而給植物提供全面有效的保護(hù)，是農(nóng)用有益微生物的重要來源之一，并且對(duì)寄主植物具有促生、防病、內(nèi)生固氮、攜帶外源基因等多方面的生物學(xué)作用。內(nèi)生的芽孢桿菌由于其在植物體內(nèi)能夠穩(wěn)定定殖，并在與寄主植物的長(zhǎng)期進(jìn)化中建立了和諧聯(lián)合關(guān)系，因此更有利于其生防作用的發(fā)揮。目前還未見有利用內(nèi)生的解淀粉芽孢桿菌防治香蕉真菌性病害的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于上述內(nèi)容，有必要提供一種解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種解淀粉芽孢桿菌，該菌命名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)GKT04，CCTCCNO：M2016784；保藏地點(diǎn)為：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)；中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時(shí)間為2016年12月26日。在本發(fā)明中，進(jìn)一步說明，所述該菌株在LA培養(yǎng)基或NA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落呈淡黃色，邊緣不規(guī)則，不光滑，表面呈皺褶狀凸起，鏡檢呈桿狀，具鞭毛，有芽孢；在pH5.0-9.0、20℃-50℃的環(huán)境下都能夠生長(zhǎng)；革蘭氏染色呈陽性；氧化酶、接觸酶測(cè)定為陽性；甲基紅(M.R)測(cè)定呈陰性；在pH7.0時(shí)V-P測(cè)定生成紅色化合物；3-酮基乳糖檢測(cè)呈陰性；七葉靈水解檢測(cè)呈陽性；纖維素水解、淀粉水解檢測(cè)呈陰性；牛奶水解、糖醇類發(fā)酵檢測(cè)呈陽性；明膠液化試驗(yàn)呈陽性；脲酶反應(yīng)呈陽性；酯酶反應(yīng)、精氨酸雙水解酶檢測(cè)呈陰性；在含有2％-5％的NaCl的LA培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。如上所述一種解淀粉芽孢桿菌在防治植物枯萎病中的應(yīng)用，或在制備防治植物枯萎病的微生物制劑中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，進(jìn)一步說明，所述植物為香蕉。一種微生物制劑，含有如權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌的全培養(yǎng)液培養(yǎng)物和如權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌的芽孢。一種微生物制劑，其是通過以下方法制備而得的：(1)活化：將解淀粉芽孢桿菌GKT04接種于LA培養(yǎng)基或者NA培養(yǎng)基中，于28-30℃下培養(yǎng)20-24h；其中，LA培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，瓊脂粉12.5g，pH7.0，121℃滅菌20min；NA培養(yǎng)基配方為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，葡萄糖4g，瓊脂粉12.5g，pH7.0，121℃滅菌20min；(2)種子培養(yǎng)：將經(jīng)活化后的解淀粉芽孢桿菌GKT04菌株接種于NA液體培養(yǎng)基中，于28-30℃、150-180r/min下振蕩，培養(yǎng)4-8h，得到種子培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵：將種子培養(yǎng)液以5％的接種比例接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，于30-34℃、150-180r/min下培養(yǎng)，通入氖氣進(jìn)行培養(yǎng)，氖氣的通入量為發(fā)酵罐體積的1/20，直至發(fā)酵液中95％以上的菌體產(chǎn)生芽孢，且芽孢的數(shù)量超過10億個(gè)/mL，即可得到解淀粉芽孢桿菌GKT04發(fā)酵液；(4)將發(fā)酵液通過聚酰胺微孔濾膜進(jìn)行過濾分離取發(fā)酵濾液，與右旋糖、聚丙烯酰胺、二酮哌嗪類化合物、碳酸氫鈣混合均勻，即可得到一種微生物制劑；其中，按照百分質(zhì)量比計(jì)，發(fā)酵濾液45％-60％、右旋糖10％-21％、聚丙烯酰胺8％-15％、二酮哌嗪類化合物13％-20％、碳酸氫鈣3％-5％。在本發(fā)明中，進(jìn)一步說明，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分制成：淀粉10-20g/L、豆粕粉15-20g/L、葡萄糖5-10g/L、酵母膏1-2g/L、L-谷氨酸鈉3-6g/L、硝酸鈉1-2g/L、磷酸氫二鉀1-2g/L、硫酸鎂1-3g/L、氯化鈉1-2g/L、吐溫-201-2g/L，pH6.8。在本發(fā)明中，進(jìn)一步說明，所述微生物菌劑是在質(zhì)量濃度為15％-25％氯化銨溶液活化至解淀粉芽孢桿菌GKT04菌的有效成分含量1×1010CFU/mL-5×1010CFU/mL后使用。如上所述一種解淀粉芽孢桿菌的篩選方法，所述篩選具體包括以下步驟：A：取香蕉表面消毒后的根部組織在研缽中，加入為香蕉根部組織10倍的無菌水進(jìn)行研磨，取濾液，稀釋至10-1000倍后，取稀釋液100μL涂布于LA培養(yǎng)基平板上，于28℃條件下倒置培養(yǎng)3-5天，挑取菌落呈淡黃色，邊緣不規(guī)則，不光滑，表面呈皺褶狀凸起，鏡檢呈桿狀，具鞭毛，有芽孢的菌落；B：用平板對(duì)峙法從步驟A挑取的菌落中篩選出對(duì)香蕉枯萎病菌有抑菌作用的菌株。在本發(fā)明中，進(jìn)一步說明，在步驟A中，消毒的具體操作是用質(zhì)量濃度為75％的酒精漂洗1min30S，無菌水沖洗1次；再放入質(zhì)量濃度為3.25％的NaClO溶液中浸泡10min，用無菌水沖洗3次；最后放入質(zhì)量濃度為75％的酒精漂洗30S，無菌水沖洗4次；在步驟B中，所述平板對(duì)峙法具體步驟為：將直徑為10mm的香蕉枯萎病致病菌FOC4的菌餅，接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，用滅菌的接種環(huán)挑取分離的菌落在距菌餅兩側(cè)2.5cm處劃線，倒置，28℃下培養(yǎng)得到有抑菌作用菌株，轉(zhuǎn)入LA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)保存。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有如下有益效果：1、本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌GKT04是香蕉內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)人、畜、農(nóng)作物安全，對(duì)環(huán)境友好。現(xiàn)有的生防菌大多數(shù)是從土壤中分離得來，由于土壤生防菌在與土壤習(xí)居病原微生物的競(jìng)爭(zhēng)中不占優(yōu)勢(shì)，且不易長(zhǎng)期定殖生存，所以實(shí)際防病效果不太理想。本申請(qǐng)得到的解淀粉芽孢桿菌GKT04是香蕉內(nèi)生菌株在植物病害防控上的應(yīng)用，與其他土壤生防菌相比，該菌能夠在香蕉植株體內(nèi)穩(wěn)定定殖，受外界環(huán)境影響小，能與病原菌直接相互作用，從而給植物提供全面有效的保護(hù)。申請(qǐng)人還經(jīng)過試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)該菌還能夠明顯的促進(jìn)香蕉植株的生長(zhǎng)。2、本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌GKT04制備得到的一種生物菌劑對(duì)香蕉枯萎病菌具有顯著的防治效果，盆栽試驗(yàn)可使香蕉枯萎病病情指數(shù)降低49.23％；對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種菌絲生長(zhǎng)有明顯抑制作用，抑菌率達(dá)到85.7％，能夠使菌絲生長(zhǎng)緩慢，出現(xiàn)末端細(xì)小，膨大、扭曲，崩潰等畸形癥狀，具有比化學(xué)殺菌劑50％施保功更好的防治效果；且生產(chǎn)周期短，工藝簡(jiǎn)單，在植物病害的生物防治中具有十分廣闊的應(yīng)用前景。3、本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌GKT04制備得到的一種生物菌劑在稀釋之后直接施加到土壤中對(duì)植物進(jìn)行灌根處理即可發(fā)揮其防控作用，并且該菌劑還能夠明顯的促進(jìn)香蕉植株的生長(zhǎng)。能顯著改善香蕉根系環(huán)境中微生物群落的合理結(jié)構(gòu)，形成一個(gè)生物多樣化的香蕉根系土壤微生態(tài)環(huán)境，從而有效地、持久地控制香蕉枯萎病菌引起的病害?！靖綀D說明】圖1是本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌GKT04菌株對(duì)香蕉枯萎病菌FOC4菌落生長(zhǎng)平板抑制作用對(duì)比圖；其中，圖1在左邊的平板是內(nèi)生菌GKT04與香蕉枯萎病致病菌FOC4平板對(duì)峙圖片，右邊的平板是只接香蕉枯萎病致病菌FOC4的菌落形態(tài)圖；圖2是與本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌GKT04菌株平板對(duì)峙培養(yǎng)7天后抑菌帶邊緣FOC4菌絲顯微鏡下觀察菌絲膨大、凸起的形態(tài)圖；圖3是本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌GKT04菌株16SrDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹；圖4是菌株GKT04對(duì)香蕉枯萎病的盆栽防控效果；圖5是經(jīng)菌株GKT04處理的香蕉組培幼苗(GKT04)與對(duì)照組(CK淋空白NA液體培養(yǎng)基)植株對(duì)照?qǐng)D；圖6是經(jīng)菌株GKT04處理的香蕉幼苗與對(duì)照組幼苗分別在15d、30d、45d、60d的植株高度的差異數(shù)據(jù)對(duì)比圖；圖7是經(jīng)菌株GKT04處理的香蕉幼苗與對(duì)照組幼苗分別在15d、30d、45d、60d的植株假莖圍的差異數(shù)據(jù)對(duì)比圖；圖8是經(jīng)菌株GKT04處理的香蕉幼苗與對(duì)照組幼苗分別在15d、30d、45d、60d的植株完全展開最大葉面積的差異數(shù)據(jù)對(duì)比圖?！揪唧w實(shí)施方式】為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施的限制。實(shí)施例1：解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)GKT04，CCTCCNO：M2016784；保藏地點(diǎn)為：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)；中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時(shí)間為2016年12月26日。1材料與方法1.1材料1.1.1植物材料香蕉，品種：桂蕉1號(hào)，廣西香蕉常規(guī)主栽品種。1.1.2供試病原菌香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種(Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace4，F(xiàn)OC4)由本實(shí)驗(yàn)室自行分離篩選。1.1.3供試培養(yǎng)基LA培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，瓊脂粉12.5gLB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10gNA培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，葡萄糖4g，瓊脂粉12.5gPDA培養(yǎng)金：去皮的馬鈴薯塊200g，用刀切成小塊，加1L水煮沸20min，用3-4層紗布過濾，取其濾液，加入葡萄糖20g，瓊脂18g，定容到1L1.2方法1.2.1香蕉內(nèi)生細(xì)菌分離、純化取自發(fā)病蕉園健康香蕉植株的根，采用研磨法分離香蕉內(nèi)生菌。采用三步消毒法：用質(zhì)量濃度為75％的酒精漂洗1min30S，無菌水沖洗1次；再放入質(zhì)量濃度為3.25％的NaClO溶液中浸泡10min，用無菌水沖洗3次；最后放入質(zhì)量濃度為75％的酒精漂洗30S，無菌水沖洗4次。取消毒后的香蕉根部1g置于滅菌研缽中，加入10ml無菌水研磨均勻，取其濾液按10-1～10-5進(jìn)行稀釋，取稀釋液100μL涂布于LA培養(yǎng)基平板上，同時(shí)取香蕉根部表面消毒時(shí)最后一次沖洗的無菌水100μL，涂布于LA培養(yǎng)基平板上作為對(duì)照，28℃，倒置培養(yǎng)3-5天，挑取菌落呈淡黃色，邊緣不規(guī)則，不光滑，表面呈皺褶狀凸起，鏡檢呈桿狀，具鞭毛，有芽孢的菌落，在LA培養(yǎng)基平板上劃線、純化、保存。1.2.2平板對(duì)峙試驗(yàn)用滅菌的打孔器打取直徑為10mm的香蕉枯萎病致病菌FOC4的菌餅，接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，用滅菌的接種環(huán)挑取分離的內(nèi)生菌在距菌餅兩側(cè)2.5cm處劃線，倒置，28℃，培養(yǎng)7天，同時(shí)以只接FOC4的菌餅作為對(duì)照，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，觀察抑菌效果。抑制率(％)＝(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對(duì)照組菌落直徑×100％1.2.3內(nèi)生性測(cè)定利用抗性誘導(dǎo)的方法獲得抗利福平標(biāo)記的菌株GKT04-Rif，接種香蕉幼苗后分別于第3天、5天參照1.2.1的方法在平板上進(jìn)行菌落回收。1.2.4菌株穩(wěn)定性檢測(cè)將菌株在LA培養(yǎng)基28℃，傳代培養(yǎng)10次，測(cè)定菌株對(duì)FOC4的抑制率的變化。1.2.5菌株鑒定：1.2.5.1形態(tài)及生理生化鑒定：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》。1.2.5.216SrDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹。1.2.6盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)：選取5～6片長(zhǎng)勢(shì)一致的香蕉砂培幼苗種植于9cm×11cm營(yíng)養(yǎng)缽中，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)4個(gè)處理：處理1：只接20mL空白NA液體培養(yǎng)基的對(duì)照；處理2：采用灌根法接種濃度為1×108CFU/mL的菌株GKT04懸浮液20mL；處理3：先用灌根法接種濃度為1×108CFU/mL的菌株GKT04懸浮液20mL，7d后傷根，淋孢子懸浮液濃度為8.12×106CFU/mL的香蕉枯萎病致病菌FOC4菌液20mL；處理4：接20mL空白NA液體培養(yǎng)基，7d后傷根，淋孢子懸浮液濃度為8.12×106CFU/mL的香蕉枯萎病致病菌FOC4菌液20mL。每處理10株，重復(fù)3次。20天后調(diào)查植株發(fā)病情況，計(jì)算各處理的病情指數(shù)和防效。2結(jié)果與分析2.1內(nèi)生細(xì)菌的分離及平板拮抗效果從不同區(qū)域的香蕉根部組織中篩選到的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行劃線純化，其中對(duì)FOC4生理小種拮抗效果最好的為菌株GKT04，平板拮抗抑制率達(dá)到85.7％(圖1)。和菌株GKT04平板對(duì)峙培養(yǎng)7天后，抑菌帶上FOC4生理小種菌絲發(fā)生膨大、凸起變形(圖2)。選取抑菌帶邊緣菌絲轉(zhuǎn)接到新鮮的PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，沒有菌絲生長(zhǎng)。2.2菌株GKT04的內(nèi)生性對(duì)菌株GKT04進(jìn)行抗Rif抗性誘導(dǎo)，經(jīng)由低濃度到高濃度的逐步誘導(dǎo)篩選，獲得一株菌落形態(tài)與原始菌株相似的、平板拮抗效果相近的抗Rif的GKT04-Rif突變菌株。將該突變菌株GKT04-Rif重新接種到香蕉幼苗上再進(jìn)行分離，接種3d后，從香蕉幼苗根部檢測(cè)到目標(biāo)菌株的數(shù)量為1.6×103CFU/ml，假莖內(nèi)部也檢測(cè)到了該目標(biāo)菌株，數(shù)量為2×102CFU/ml。接種5d后，香蕉幼苗根部和假莖內(nèi)部該目標(biāo)菌株的數(shù)量為5.3×103CFU/ml和1.07×104CFU/ml。表明該菌株GKT04-Rif已在植株體內(nèi)進(jìn)行繁殖和轉(zhuǎn)移。2.3菌株GKT04的穩(wěn)定性菌株GKT04傳代10次后對(duì)對(duì)FOC4生理小種的平板拮抗抑制效果基本保持不變，抑菌率仍穩(wěn)定在85.7％左右。2.4菌株GKT04的鑒定2.4.1菌株GKT04形態(tài)學(xué)及生理生化特征菌株GKT04在LA培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落呈淡黃色，邊緣不規(guī)則，不光滑，表面呈皺褶狀凸起。生理生化特征見表表1菌株GKT04的生理生化特征Table1PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofstrainGKT04鑒別特征菌株GKT04鑒別特征菌株GKT04革蘭氏染色+明膠液化+氧化酶+酯酶-接觸酶+牛奶水解+甲基紅(M.R)-精氨酸雙水解酶-V-P測(cè)定+脲酶+3-酮基乳糖-PH＜5.6生長(zhǎng)+纖維素水解-5％NaCl生長(zhǎng)+七葉靈水解+4℃生長(zhǎng)-淀粉水解-50℃生長(zhǎng)+糖醇類發(fā)酵+注：+：陽性反應(yīng)；-：陰性反應(yīng)。Note:+：Positivereaction；-：Negativereaction.2.5菌株GKT04的16SrDNA序列分析：PCR擴(kuò)增菌株GKT04的16SrDNA序列后送華大測(cè)序，得到1445bp的序列，其DNA序列表：SEQIDNO.1(見說明書的序列表)。將該序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株，用MEGA4.0軟件，利用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。菌株GKT04與Bacillusamyloliquefaciens處在同一分支，NCBI比對(duì)相似性為99％。3、菌株GKT04對(duì)香蕉枯萎病的盆栽防控效果CK為處理4，接空白NA液體培養(yǎng)基，7d后傷根，淋孢子懸浮液濃度為8.12×106CFU/mL的香蕉枯萎病致病菌FOC4菌液20mL；GKT04為處理3，先接內(nèi)生菌劑GKT04，7d傷根，淋孢子懸浮液濃度為8.12×106CFU/mL的香蕉枯萎病致病菌FOC4菌液20mL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20天后，CK和經(jīng)菌株GKT04處理的部分植株都開始出現(xiàn)程度不同的發(fā)病癥狀。并且隨著時(shí)間的推移，病情指數(shù)逐漸升高。到48天后，CK病情指數(shù)達(dá)到66.67，而處理的病情指數(shù)為33.85；與對(duì)照相比，病情指數(shù)降低了49.23％(圖4)。4.菌株GKT04的促進(jìn)香蕉植株的生長(zhǎng)的研究分析4.1同一生育階段(外界種植的條件均相同)，經(jīng)菌株GKT04處理的香蕉組培幼苗(GKT04)，與對(duì)照組(CK淋空白NA液體培養(yǎng)基處理)相比較，無論是從株高、假莖圍還是完全展開的最大葉面積均與對(duì)照之間存在著極顯著性差異(見圖5，經(jīng)菌株GKT04處理的香蕉幼苗植株高度與對(duì)照相比，15d、30d、45d、60d時(shí)的增加量分別為32.32％，31.84％，16.6％，18.69％(見圖6)。假莖圍與對(duì)照相比，15d、30d、45d、60d時(shí)的增加量分別為16.26％，20.37％，24.33％，24.26％(見圖7)。與對(duì)照相比，經(jīng)菌株GKT04處理的香蕉幼苗完全展開最大葉面積在15d、30d、45d、60d時(shí)的增加量分別為47.62％，51.43％，39.21％，39.51％(見圖8)。4.2當(dāng)育苗在60天收獲時(shí)，經(jīng)菌株GKT04處理的香蕉幼苗地上部分鮮重比對(duì)照組(CK清水處理)增加了34.05％；地上部分干重比對(duì)照組(CK淋空白NA液體培養(yǎng)基處理)增加了40.39％；地下部分鮮重比對(duì)照組(CK淋空白NA液體培養(yǎng)基處理)增加了61.54％；地下部分干重比對(duì)照組(CK淋空白NA液體培養(yǎng)基處理)增加了62.5％；新增根數(shù)比對(duì)照增加了66.04％；新增葉片數(shù)比對(duì)照組(CK淋空白NA液體培養(yǎng)基處理)增加了10.77％；最長(zhǎng)根的長(zhǎng)度比對(duì)照組(CK淋空白NA液體培養(yǎng)基處理)增加了39.12％；葉片葉綠素含量比對(duì)照組(CK淋空白NA液體培養(yǎng)基處理)增加了36.39％(見表2)。表2實(shí)施例2：一種微生物制劑，其是通過以下方法制備而得的：(1)活化：將解淀粉芽孢桿菌GKT04接種于LA培養(yǎng)基中，于28℃下培養(yǎng)20h；其中，LA培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，瓊脂粉12.5g，pH7.0，121℃滅菌20min；NA培養(yǎng)基配方為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，葡萄糖4g，瓊脂粉12.5g，pH7.0，121℃滅菌20min；(2)種子培養(yǎng)：將經(jīng)活化后的解淀粉芽孢桿菌GKT04菌株接種于NA液體培養(yǎng)基中，于29℃、170r/min下振蕩，培養(yǎng)4h，得到種子培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵：將種子培養(yǎng)液以5％的接種比例接種于裝有由淀粉15g/L、豆粕粉16g/L、葡萄糖7g/L、酵母膏1.5g/L、L-谷氨酸鈉5g/L、硝酸鈉1.5g/L、磷酸氫二鉀1.5g/L、硫酸鎂2g/L、氯化鈉1.5g/L、吐溫-201.5g/L，pH6.8制成的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，于32℃、165r/min下培養(yǎng)，通入氖氣進(jìn)行培養(yǎng)，氖氣的通入量為發(fā)酵罐體積的1/20，直至發(fā)酵液中95％以上的菌體產(chǎn)生芽孢，且芽孢的數(shù)量超過10億個(gè)/mL，即可得到解淀粉芽孢桿菌GKT04發(fā)酵液；(4)將發(fā)酵液通過聚酰胺微孔濾膜進(jìn)行過濾分離取發(fā)酵濾液，與右旋糖、聚丙烯酰胺、二酮哌嗪類化合物、碳酸氫鈣混合均勻，即可得到一種微生物制劑；其中，按照百分質(zhì)量比計(jì)，發(fā)酵濾液50％、右旋糖16％、聚丙烯酰胺12％、二酮哌嗪類化合物18％、碳酸氫鈣4％。微生物菌劑是在質(zhì)量濃度為20％氯化銨溶液活化至解淀粉芽孢桿菌GKT04菌的有效成分含量1×1010CFU/mL后使用。實(shí)施例3：一種微生物制劑，其是通過以下方法制備而得的：(1)活化：將解淀粉芽孢桿菌GKT04接種于NA培養(yǎng)基中，于29℃下培養(yǎng)23h；其中，LA培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，瓊脂粉12.5g，pH7.0，121℃滅菌20min；NA培養(yǎng)基配方為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，葡萄糖4g，瓊脂粉12.5g，pH7.0，121℃滅菌20min；(2)種子培養(yǎng)：將經(jīng)活化后的解淀粉芽孢桿菌GKT04菌株接種于NA液體培養(yǎng)基中，于28℃、150r/min下振蕩，培養(yǎng)8h，得到種子培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵：將種子培養(yǎng)液以5％的接種比例接種于裝有由淀粉10g/L、豆粕粉15g/L、葡萄糖5g/L、酵母膏1g/L、L-谷氨酸鈉3g/L、硝酸鈉1g/L、磷酸氫二鉀1g/L、硫酸鎂1g/L、氯化鈉1g/L、吐溫-201g/L，pH6.8制成的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，于30℃、150r/min下培養(yǎng)，通入氖氣進(jìn)行培養(yǎng)，氖氣的通入量為發(fā)酵罐體積的1/20，直至發(fā)酵液中95％以上的菌體產(chǎn)生芽孢，且芽孢的數(shù)量超過10億個(gè)/mL，即可得到解淀粉芽孢桿菌GKT04發(fā)酵液；(4)將發(fā)酵液通過聚酰胺微孔濾膜進(jìn)行過濾分離取發(fā)酵濾液，與右旋糖、聚丙烯酰胺、二酮哌嗪類化合物、碳酸氫鈣混合均勻，即可得到一種微生物制劑；其中，按照百分質(zhì)量比計(jì)，發(fā)酵濾液45％、右旋糖21％、聚丙烯酰胺15％、二酮哌嗪類化合物14％、碳酸氫鈣5％。微生物菌劑是在質(zhì)量濃度為15％氯化銨溶液活化至解淀粉芽孢桿菌GKT04菌的有效成分含量3×1010CFU/mL后使用。實(shí)施例4：一種微生物制劑，其是通過以下方法制備而得的：(1)活化：將解淀粉芽孢桿菌GKT04接種于LA培養(yǎng)基或者NA培養(yǎng)基中，于30℃下培養(yǎng)24h；其中，LA培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，瓊脂粉12.5g，pH7.0，121℃滅菌20min；NA培養(yǎng)基配方為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，葡萄糖4g，瓊脂粉12.5g，pH7.0，121℃滅菌20min；(2)種子培養(yǎng)：將經(jīng)活化后的解淀粉芽孢桿菌GKT04菌株接種于NA液體培養(yǎng)基中，于30℃、180r/min下振蕩，培養(yǎng)6h，得到種子培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵：將種子培養(yǎng)液以5％的接種比例接種于裝有由淀粉20g/L、豆粕粉20g/L、葡萄糖10g/L、酵母膏2g/L、L-谷氨酸鈉6g/L、硝酸鈉2g/L、磷酸氫二鉀2g/L、硫酸鎂3g/L、氯化鈉2g/L、吐溫-202g/L，pH6.8制成的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，于34℃、180r/min下培養(yǎng)，通入氖氣進(jìn)行培養(yǎng)，氖氣的通入量為發(fā)酵罐體積的1/20，直至發(fā)酵液中95％以上的菌體產(chǎn)生芽孢，且芽孢的數(shù)量超過10億個(gè)/mL，即可得到解淀粉芽孢桿菌GKT04發(fā)酵液；(4)將發(fā)酵液通過聚酰胺微孔濾膜進(jìn)行過濾分離取發(fā)酵濾液，與右旋糖、聚丙烯酰胺、二酮哌嗪類化合物、碳酸氫鈣混合均勻，即可得到一種微生物制劑；其中，按照百分質(zhì)量比計(jì)，發(fā)酵濾液60％、右旋糖10％、聚丙烯酰胺10％、二酮哌嗪類化合物17％、碳酸氫鈣3％。微生物菌劑是在質(zhì)量濃度為25％氯化銨溶液活化至解淀粉芽孢桿菌GKT04菌的有效成分含量5×1010CFU/mL后使用。實(shí)施例5：解淀粉芽孢桿菌GKT04菌株得到的生物菌劑對(duì)植物枯萎病病害的田間防治試驗(yàn)對(duì)引起香蕉枯萎病的防治試驗(yàn)于2015年安排在南寧武鳴縣培桂基地實(shí)驗(yàn)用地進(jìn)行，試驗(yàn)用地為緩坡地塊，土壤為林地土壤。香蕉于3月1日前移栽，分5個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)種有香蕉50株，且5次重復(fù)；分別于4月12日和5月26日噴施兩次，每小區(qū)種的一組實(shí)驗(yàn)里每10株香蕉各噴施實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4制備得到解淀粉芽孢桿菌GKT04生物制劑(活化至相應(yīng)的有效成分的菌量的狀態(tài))，以50％施保功1500倍無菌水稀釋液為藥劑對(duì)照，以無菌水為空白對(duì)照，至8月16日和9月3日各調(diào)查一次病情指數(shù)，病情指數(shù)＝[∑(病級(jí)株數(shù)×代表值)/(總株數(shù)×最高病級(jí)代表值)]×100。表3防治效果試驗(yàn)情況表由上表可知，采用本申請(qǐng)的解淀粉芽孢桿菌GKT04菌株得到的生物菌劑對(duì)香蕉枯萎病有較好的防效，且防治效果與上述病害主用對(duì)照藥劑擁有更好的防治效果。本發(fā)明中使用了右旋糖能提供糖份作為能源物質(zhì)，也能改善土壤的結(jié)構(gòu)，防止土壤板結(jié)，使得土壤疏松，增加土壤的透氣性，降低植株本體產(chǎn)生溫度過高或者過濕，能有效的降低引起發(fā)病的因子；聚丙烯酰胺作為保水劑，能使得酸不溶物的土壤顆粒與高分子化合物的極性集團(tuán)或帶電基團(tuán)作用，顆粒與高分子化合物結(jié)合，形成體積龐大的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，因?yàn)楦叻肿踊衔锏臉O性或帶電荷的基團(tuán)很多，能夠在短時(shí)間內(nèi)使土壤形成團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，使土壤疏松，增加土壤的透氣性，兩者結(jié)合是從根部解決植株內(nèi)部溫度來調(diào)控發(fā)病的影響因子。二酮哌嗪類化合物能夠降低解淀粉芽孢桿菌GKT04菌株的活性，從而將解淀粉芽孢桿菌GKT04菌株在一定時(shí)間段降低活性，防止解淀粉芽孢桿菌GKT04菌株不斷進(jìn)行分裂到達(dá)對(duì)數(shù)期后走向衰亡期，產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素，從而降低活性和有效成分；在得到的解淀粉芽孢桿菌GKT04菌株的發(fā)酵液通過聚酰胺微孔濾膜進(jìn)行過濾分離取發(fā)酵濾液，也是為了能清除內(nèi)毒素，從而減少菌劑本身還有的內(nèi)毒素的量；碳酸氫鈣作為條件菌種的生長(zhǎng)環(huán)境的酸堿度的調(diào)節(jié)劑，能保證菌株具有一定的活性，在使用的時(shí)候，能快速的激活其活性。綜上所述，兩種物質(zhì)的調(diào)控使得菌種具有適當(dāng)?shù)幕钚?，既不積極的不斷進(jìn)行分裂之后產(chǎn)生大量?jī)?nèi)毒素，也不失活性，能快速被調(diào)控激活活性，在噴施作物時(shí)發(fā)揮菌株的最佳活性，從而大大的提高防治病菌的效率。這四種物質(zhì)從植株體本身和菌株發(fā)揮活性的調(diào)控相結(jié)合來調(diào)控防病的作用，效果顯著，具有極大的推廣性和可行性。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。SEQUENCELISTING<110>廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120>一種解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用<130>2017<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1445<212>DNA<213>解淀粉酶芽孢桿菌<400>1cggggggggtgctataatgcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagc60ggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaa120ccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcg180gctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcacca240aggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggc300ccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacgga360gcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaac420aagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaact480acgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgta540aagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggaggg600tcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggt660gaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactg720acgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccg780taaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcatt840aagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcc900cgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtct960tgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtgg102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