本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種灰平鏈霉菌及其應(yīng)用和微生物菌劑。

背景技術(shù)：

磷礦資源的日益枯竭已成為限制農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的世界性問題。磷是植物生長(zhǎng)的必要元素，在生產(chǎn)實(shí)踐中，為了提高作物產(chǎn)量，大量可溶性磷肥施入土壤中，但多被土壤固定，以難溶性無機(jī)磷的形式存在，無法被植物吸收和利用。因此，土壤無效磷素的活化成為資源學(xué)和肥料學(xué)急需解決的重要問題。

溶磷菌能夠?qū)㈦y溶性磷酸鹽溶解，活化磷素狀態(tài)。不僅可以“動(dòng)員”農(nóng)田土壤磷庫資源，促進(jìn)土壤肥力的提高，減少化學(xué)磷肥的使用量和高品位磷礦資源的消耗量，解決土壤無效磷素活化和磷礦資源日漸枯竭的問題；還可以有效開發(fā)利用我國大量的低品位磷礦及尾礦，提高磷肥利用率，解決磷礦開采和加工過程中產(chǎn)生的環(huán)境污染問題。因此，生物磷肥的開發(fā)和應(yīng)用是解決“磷”問題的最佳途徑。

目前，國內(nèi)外研究中有關(guān)溶磷菌的研究成果很多，但多集中在溶磷細(xì)菌和溶磷真菌的分類和溶磷機(jī)理的研究領(lǐng)域，如公開/公告號(hào)為CN103834584A的發(fā)明專利提供了一種溶磷菌，命名為DDC 95，可作為溶磷菌輔助植物生長(zhǎng)。該菌株分離自大豆根際，對(duì)促進(jìn)大豆對(duì)土壤中難溶的無機(jī)磷素吸收利用效果明顯。又如公開/公告號(hào)為CN102618449A的發(fā)明提供了一種溶磷菌，該溶磷菌分類命名為臭曲霉Aspergillus foetidus，其保藏登記號(hào)為CGMCC No.5857。該溶磷菌用于生產(chǎn)微生物肥料，并用于煙葉的栽培，通過溶磷、解鉀等功能微生物的直接作用，釋放土壤中的不易被吸收的養(yǎng)分，改良了土壤品質(zhì)，促進(jìn)土壤中有益微生物的繁殖，提高了土壤中有益微生物的數(shù)量，調(diào)節(jié)土壤中的營(yíng)養(yǎng)平衡，從而提高了煙株對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的平衡吸收，提高煙葉質(zhì)量和肥料利用率，并減少了環(huán)境污染。

放線菌因其耐貧瘠、極端環(huán)境生存能力強(qiáng)、產(chǎn)多種活性物質(zhì)和抗病促生等多重功效而備受關(guān)注，但國內(nèi)外對(duì)溶磷放線菌資源和溶磷機(jī)理的研究甚少，限制了溶磷放線菌的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種灰平鏈霉菌及其應(yīng)用和微生物菌劑。該放線菌具有較好的溶磷特性。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種灰平鏈霉菌，其保藏編號(hào)為CGMCC No.13249。

本發(fā)明從玉米根際土壤這種特定植物的根際環(huán)境中篩選具有植物抗病、促生潛能的灰平鏈霉菌，以獲得與植物親和性好，易于在植物根際定殖的溶磷植物促生放線菌菌株，為研究開發(fā)環(huán)境友好型的溶磷植物促生放線菌菌劑提供優(yōu)質(zhì)的材料。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，保藏編號(hào)為CGMCC No.13249的灰平鏈霉菌的篩選方法為：將采集的玉米根際的新鮮土樣采用水稀釋，將稀釋液涂布于NBRIP培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)、純化，得到灰平鏈霉菌。

在本發(fā)明中，NBRIP培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖10g、Ca₃(PO₄)₂ 5g、MgCl₂ 5g、MgSO₄0.25g、KCl 0.2g、(NH₄)₂SO₄ 0.1g，溶于1L去離子水中，調(diào)節(jié)pH7.2，滅菌。該培養(yǎng)基加入20g瓊脂即為固體NBRIP培養(yǎng)基。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，篩選時(shí)培養(yǎng)的溫度為28℃。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，篩選時(shí)培養(yǎng)的時(shí)間為48h。

作為優(yōu)選，該灰平鏈霉菌采用ISP4培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵種子的培養(yǎng)。

在本發(fā)明中，ISP4液體培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉10g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 1g，(NH₄)₂SO₄ 2g，CaCO₃ 2g，溶于1L水，調(diào)節(jié)pH7.2，滅菌。

作為優(yōu)選，灰平鏈霉菌發(fā)酵種子的培養(yǎng)方法為：將成熟菌株及孢子接種于ISP4液體培養(yǎng)基中120r/m，28℃培養(yǎng)5～7d。

在本發(fā)明中，該灰平鏈霉菌采用固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

在本發(fā)明中，固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：玉米碴550g，大米400g，小米50g，CaCO₃10g，用2倍濃縮的高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)含水率為60％，滅菌。

作為優(yōu)選，灰平鏈霉菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)方法為：將灰平鏈霉菌液體發(fā)酵菌株接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)5～7d。

作為優(yōu)選，該灰平鏈霉菌的貯存方法為：將該菌放置于陰涼干燥處保存或0～4℃條件下保存。

本發(fā)明還提供了該灰平鏈霉菌在溶解無效磷中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了該灰平鏈霉菌在合成鐵載體中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了該灰平鏈霉菌在抑制引起植物病害的病原真菌活性中的應(yīng)用。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，引起植物病害的病原真菌為禾谷鐮孢菌、黃瓜枯萎病菌、人參菌核病菌、人參根腐病菌和人參枯萎病菌。

本發(fā)明還提供了一種微生物菌劑，包括本發(fā)明的灰平鏈霉菌。

作為優(yōu)選，微生物菌劑中還包括農(nóng)藥學(xué)上可接受的輔料。

本發(fā)明提供了一種灰平鏈霉菌及其應(yīng)用和微生物菌劑。該灰平鏈霉菌的保藏編號(hào)為CGMCC No.13249。本發(fā)明至少具有如下優(yōu)勢(shì)之一：

1、本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)該灰平鏈霉菌具有較好的溶磷特性；

2、本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)該灰平鏈霉菌具有較強(qiáng)的合成鐵載體的能力；

3、本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)該灰平鏈霉菌可抑制多種引起植物病害的病原真菌活性。

4、本發(fā)明灰平鏈霉菌具有植物抗病、促生潛能，為研究開發(fā)環(huán)境友好型的溶磷植物促生放線菌菌劑提供優(yōu)質(zhì)的材料。

生物保藏說明

分類命名：灰平鏈霉菌(Streptomyces griseoplanus)，于2016年11月08日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No.13249。

附圖說明

圖1示菌株P(guān)SA1在NBRIP培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)；

圖2示菌株P(guān)SA1溶磷性能測(cè)定；

圖3示菌株P(guān)SA1在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征；

圖4示菌株P(guān)SA1系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建；

圖5示灰平鏈霉菌PSA1產(chǎn)鐵載體情況；

圖6示灰平鏈霉菌PSA1對(duì)禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)的抑制作用；其中6-1所示培養(yǎng)皿添加有灰平鏈霉菌PSA1，6-2為對(duì)照；

圖7示灰平鏈霉菌PSA1對(duì)黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp.cucumerinum)的抑制作用；其中7-1所示培養(yǎng)皿添加有灰平鏈霉菌PSA1，7-2為對(duì)照；

圖8示灰平鏈霉菌PSA1對(duì)人參菌核病菌(Sclerotinia libertiana Fuck.)的抑制作用；其中8-1所示培養(yǎng)皿添加有灰平鏈霉菌PSA1，8-2為對(duì)照；

圖9示灰平鏈霉菌PSA1對(duì)人參根腐病菌(Fusarium solani)的抑制作用；其中9-1所示培養(yǎng)皿添加有灰平鏈霉菌PSA1，9-2為對(duì)照；

圖10示灰平鏈霉菌PSA1對(duì)人參枯萎病菌(Fusarium oxysporum)的抑制作用；其中10-1所示培養(yǎng)皿添加有灰平鏈霉菌PSA1，10-2為對(duì)照。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種灰平鏈霉菌及其應(yīng)用和微生物菌劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明提供的灰平鏈霉菌及其應(yīng)用和微生物菌劑中所用培養(yǎng)基、試劑等均可由市場(chǎng)購得。

在本發(fā)明實(shí)施例中，NBRIP培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖10g、Ca₃(PO₄)₂ 5g、MgCl₂ 5g、MgSO₄ 0.25g、KCl 0.2g、(NH₄)₂SO₄ 0.1g，溶于1L去離子水中，調(diào)節(jié)pH7.2，121.3℃高壓蒸汽滅菌20min。該培養(yǎng)基加入20g瓊脂即為固體NBRIP培養(yǎng)基。

ISP4液體培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉10g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 1g，(NH₄)₂SO₄ 2g，CaCO₃ 2g，溶于1L水，調(diào)節(jié)pH7.2，121.3℃高壓蒸汽滅菌20min。將平皿中成熟菌株及孢子接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中120r/m，28℃培養(yǎng)5～7d。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米碴550g，加入大米400g，小米50g，CaCO310g，用2倍濃縮的高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)含水率為60％，110℃條件下高壓蒸汽滅菌2小時(shí)。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1溶磷放線菌的篩選

稱取10g從公主嶺采集的玉米根際新鮮土樣加到100mL無菌水中，采用平板稀釋法制備土壤稀釋液，涂布至NBRIP培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48h，挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落進(jìn)行純化。將純化后的菌株分別于4℃和-80℃保存?zhèn)溆?。溶磷放線菌的篩選結(jié)果如圖1所示。命名為PSA1菌株。

實(shí)施例2溶磷性能測(cè)定

將實(shí)施例1篩選純化后的玉米根際放線菌接種于液體高氏一號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)7d，8000rpm離心5min收集菌體，用去離子水重懸菌體沉淀后8000rpm離心5min，此操作重復(fù)3次，將菌體表面的高氏一號(hào)培養(yǎng)基成分洗凈，無菌操作稱取0.5g菌體(濕重)接種于100mL NBRIP液體培養(yǎng)基(NBRIP培養(yǎng)基：葡萄糖10g，磷酸鈣5g，氯化鎂5g，硫酸鎂0.25g，硫酸銨0.1g，氯化鉀0.2g，蒸餾水1000mL，pH 7.0～8.0)中，28℃搖床培養(yǎng)20d，采用鉬銻抗比色法測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵液上清中有效磷含量，對(duì)玉米根際溶磷放線菌進(jìn)行溶磷性能測(cè)定。以不接菌的培養(yǎng)基為對(duì)照。

將PSA1接種于液體NBRIP培養(yǎng)基中，測(cè)定發(fā)酵液上清中的有效磷含量，結(jié)果如圖2所示。

實(shí)施例3玉米根際溶磷放線菌的鑒定

1、玉米根際溶磷放線菌的培養(yǎng)特征和生理生化特性鑒定

采用插片法觀察實(shí)施例1玉米根際溶磷放線菌菌絲體形態(tài)，并參照范麗霞等的方法，采用國際鏈霉菌計(jì)劃培養(yǎng)基(ISP)，將溶磷放線菌菌株分別接種到酵母膏麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基(ISP2)、燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基(ISP3)、無機(jī)鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基(ISP4)、甘油天門冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基(ISP5)、蛋白胨酵母膏鐵鹽瓊脂培養(yǎng)基(ISP6)、酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基(ISP7)、察氏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5～10d，觀察并記錄菌株在7種不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征。參照徐麗華等的方法進(jìn)行玉米根際溶磷放線菌的生理生化特征鑒定。

生理生化鑒定結(jié)果如圖3所示：

PSA1在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛，菌落為乳脂色，氣絲豐茂呈絨粉狀，孢子絲直、柔曲，松敞螺旋形，基絲好，淺黃色至淺褐色；

PSA1在ISP系列培養(yǎng)基及察氏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上均不產(chǎn)生可溶性色素。ISP2培養(yǎng)基：氣生菌絲豐茂，灰色至暗灰色，基內(nèi)菌絲好，淺灰黃色至灰黃褐色。ISP3：氣生菌絲豐茂，灰色，基內(nèi)菌絲好，淺灰黃色。ISP4：氣生菌絲生長(zhǎng)一般，灰色至橄欖灰色，基內(nèi)菌絲好，淺灰黃色至橄欖灰色。ISP5：氣生菌絲生長(zhǎng)一般，灰色，基內(nèi)菌絲灰色。ISP6：氣生菌絲淺灰黃色，基內(nèi)菌絲淺灰黃色。ISP7：氣生菌絲橄欖灰色，基內(nèi)菌絲暗灰色。

察氏培養(yǎng)基：氣生菌絲豐茂，白色至淺灰色，基內(nèi)菌絲好，淺灰黃色至淺褐色。PSA1菌株明膠液化、淀粉水解、硝酸鹽還原、纖維素水解，但不產(chǎn)生硫化氫、黑色素。

PDA培養(yǎng)基：氣生菌絲豐茂，淺灰色，基內(nèi)菌絲好，淺灰黃色。

由上述試驗(yàn)結(jié)果可見，該菌株利用葡萄糖、蔗糖、甘油、檸檬酸鈉效果較好，對(duì)棉子糖、肌醇、乳糖效果一般，L-鼠李糖效果最差。

2、玉米根際溶磷放線菌的分子鑒定

將具有溶磷特性的玉米根際放線菌接種于高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)7d，離心收集菌體后抽真空冷凍干燥48小時(shí)。冷凍干燥后的菌體，提取基因組DNA。參照Hanane Hamdali et(2008)的方法進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，用Clustal W對(duì)測(cè)序結(jié)果與GenBank中相關(guān)的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)，通過MEGA6.0軟件對(duì)菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，用Bootstrap法(1000次重復(fù))檢驗(yàn)。

16S rDNA分子鑒定結(jié)果：以菌株P(guān)SA1總DNA為模板，對(duì)PSA1菌株的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交到NCBI GenBank(KX226414)。用Clustal W對(duì)測(cè)序結(jié)果與GenBank中相關(guān)的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)，通過MEGA6.0軟件對(duì)菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，用Bootstrap法(1000次重復(fù))檢驗(yàn)。結(jié)果如圖4表明，菌株P(guān)SA1與已報(bào)道的灰平鏈霉菌Streptomyces griseoplanus親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)99％，與Blast結(jié)果一致。因此，菌株P(guān)SA1在分類學(xué)地位上初步確定為灰平鏈霉菌Streptomyces griseoplanus strain PSA1。

實(shí)施例4產(chǎn)鐵載體活性的定性分析

將具有溶磷功能的玉米根際放線菌接種于CAS固體培養(yǎng)基(CAS檢測(cè)培養(yǎng)基(100mL)：20％葡萄糖1mL，10％酸水解酪素3mL，1mmol/L CaCl₂ 100μL，1mmol/L MgSO₄·7H₂O 2mL，瓊脂粉1.8g，115℃滅菌，冷卻至60℃時(shí)緩慢加入過濾除菌的10×磷酸鹽緩沖液和CAS檢測(cè)液各5mL混勻。CAS檢測(cè)液：2mL 1mmol/L FeCl₃加入含有0.012g鉻天青(CAS)溶于10mL去離子水中，充分混合后緩慢倒入含有0.015g十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的8mL去離子水中，過濾除菌，避光保存。10×磷酸鹽緩沖液(pH6.8)：每100mL緩沖液含Na₂HPO₄·2H₂O 2.427g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.5905g；KH₂PO₄·3H2O 0.075g；NHCl₄ 0.25g；NaCl 0.125g，調(diào)節(jié)pH6.8。用時(shí)稀釋10倍。將PSA1菌株接種于CAS固體培養(yǎng)基表面，28℃培養(yǎng)15d，觀察菌落周圍是否有透明圈。

結(jié)果如圖5所示：將玉米根際溶磷放線菌PSA1接種于CAS固體平板培養(yǎng)15d后，在其菌落周圍出現(xiàn)明顯的橙紅色顏色圈，說明玉米根際溶磷放線菌PSA1具有合成鐵載體的活性。

實(shí)施例5玉米根際土壤溶磷放線菌拮抗活性篩選

植物病原菌菌種及來源：人參立枯絲核病菌(Rhizoctonia solani Kuhn)、人參菌核病菌(Sclerotinia libertiana Fuck.)、人參枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、人參根腐病菌(Fusarium solani)、禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp.cucumerinum)、串珠鐮孢菌(Fusarium moniliforme)、玉米彎孢葉斑病菌(Curvularia lunata)、番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)。以上菌株均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

以上述9種引起植物病害的病原真菌為指示菌，采用對(duì)峙培養(yǎng)法，篩選具有拮抗活性的溶磷放線菌。在PDA培養(yǎng)基表面一端接種指示菌，另一端接種玉米根際溶磷放線菌，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，培養(yǎng)至病原菌長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，以抑菌帶寬度確定放線菌的拮抗活性。以不接放線菌的平板做對(duì)照。結(jié)果如圖6～10所示。

結(jié)果顯示，實(shí)施例1篩選得到的玉米根際溶磷放線菌可明顯抑制禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp.cucumerinum)、人參菌核病菌(Sclerotinia libertiana Fuck.)、人參根腐病菌(Fusarium solani)和人參枯萎病菌(Fusarium oxysporum)的生長(zhǎng)，顯示該菌具有拮抗植物病原菌的活性。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。