本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種干酪乳桿菌菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

根結(jié)線蟲(Meloidogyne)是一種高度?；偷碾s食性植物病原線蟲。已知危害蔬菜的線蟲主要有花生根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲以及甜菜根結(jié)線蟲等。線蟲寄主范圍廣泛，常危害瓜類、茄果類、豆類及蘿卜、葫蘿卜、萵苣、白菜等30多種蔬菜，還能傳播一些真菌和細菌性病害。根結(jié)線蟲是一種重要的農(nóng)作物病原物，每年造成大約數(shù)十億的損失。根結(jié)線蟲主要侵染農(nóng)作物的根部，侵染后的根部膨大形成巨大的根結(jié)，可相互連接形成串珠狀，由于根部被破壞，影響正常的吸收機能，所以地上部生長發(fā)育受阻，被侵染后的植株地上部表現(xiàn)矮化，葉部黃化，結(jié)果小而且少。天氣干燥時易萎蔫或枯萎。長期連作的溫室中，特別是可以使西瓜、黃瓜、番茄等絕產(chǎn)。

由于抗根結(jié)線蟲病的種質(zhì)資源稀少，所以在生產(chǎn)中化學(xué)防治仍然是防治根結(jié)線蟲的重要措施，如棉隆、氯化苦和百畝威等，這些藥劑雖然殺蟲快，但是會嚴重降低蔬菜質(zhì)量，污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡，使用過程中對人、畜不安全，因此生物防治措施日益受到人們的關(guān)注。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)防治存在的污染環(huán)境、不安全的問題，提供一種干酪乳桿菌菌株及其應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種干酪乳桿菌菌株，所述菌株為干酪乳桿菌菌株Lac-1，建議的分類命名為干酪乳桿菌Lactobacillus casei；保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2016年4月18日，保藏編號為CGMCC 12363。

本發(fā)明還提供了一種利用干酪乳桿菌菌株制備的生防菌劑。

本發(fā)明還提供了干酪乳桿菌菌株制備的生防菌劑在防治根結(jié)線蟲中的應(yīng)用。

進一步的，所述根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲。

本發(fā)明還提供了干酪乳桿菌菌株制備生防菌劑的方法，該方法包括以下步驟：

(1)將干酪乳桿菌菌株Lac-1劃線接種在LB培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)后得到單株菌落；

(2)將干酪乳桿菌菌株Lac-1的單株菌落接種在種子培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)后得到種子液；

(3)將種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得濃度為10⁷-10¹⁰cfu/mL的發(fā)酵液；然后將發(fā)酵液直接分裝成液體劑型。

進一步的，步驟(1)中在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h，培養(yǎng)溫度為35-40℃。

進一步的，步驟(1)中LB培養(yǎng)基配方為：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，余量為水。

進一步的，步驟(2)中在恒溫搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm，溫度為35-40℃，振蕩培養(yǎng)24-36h。

進一步的，步驟(3)中將種子液以接種量1-2％接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度為35-40℃。

進一步的，步驟(2)中的種子培養(yǎng)基與步驟(3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基均為LB培養(yǎng)基。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明中的干酪乳桿菌分離自土壤，對于根結(jié)線蟲具有良好的防效，易于在土壤中定植，且利于早期防控根結(jié)線蟲危害，該菌株對于解決根結(jié)線蟲的防治具有巨大的應(yīng)用潛力，有助于實現(xiàn)蔬菜的高產(chǎn)、安全、無公害生產(chǎn)；干酪乳桿菌Lac-1菌株的發(fā)酵液對根結(jié)線蟲的致死率達到100％，在溫室中的防治效果達到88.7％，防治效果高且穩(wěn)定，適于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)需求。

附圖說明

圖1為本發(fā)明干酪乳桿菌菌株Lac-1的菌落形態(tài)圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明進行詳細地解釋說明。

實施例1

干酪乳桿菌的分離、純化及鑒定：

從順義番茄種植田塊中均勻取土壤樣品，10g土壤分別與100mL滅菌水進行混合制成懸浮液，然后依次進行梯度稀釋，取稀釋10000倍的土壤混液100μL涂布于LB培養(yǎng)基平板上，LB培養(yǎng)基溫度37℃，LB培養(yǎng)基的配方為：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，瓊脂粉1.3-1.5g/100mL，定容至1L。將培養(yǎng)基置于25℃培養(yǎng)，待組織塊長出菌落后，進行單孢分離，挑取單菌落在LB培養(yǎng)基上純化，用于分類鑒定。根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》對菌株進行形態(tài)學(xué)測定。

挑取菌落，放入盛有300μL細菌裂解液SDS的EP管中，65℃裂解2小時，然后用細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)提取細菌DNA，以DNA為模板，用引物27F和1492R分別進行16s rRNA序列擴增。PCR擴增反應(yīng)體系為50μL，含有5μL 10×Ex Taq Buffer，1μL Ex Taq酶，5μL dNTP(2.5mM each)，1μL正向引物，1μL反向引物，3μL DNA模板，無菌水34μL。擴增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，PCR產(chǎn)物直接進行雙向測序。

結(jié)果：

參見附圖1，獲得Lac-1菌株在LB培養(yǎng)基平板上，37℃，培養(yǎng)3天后，菌落大小為1.0-3.0mm，正面為圓形，邊緣整齊，側(cè)面低凸，表面濕潤光滑，乳白色，不透明，稍有酸味，經(jīng)革蘭氏染色在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菌株的形態(tài)呈短桿整齊長鏈狀排列。將其與《伯杰氏細菌鑒定手冊》以及其他著作中乳桿菌屬內(nèi)專性同型發(fā)酵的鑒別特征表相對比，并結(jié)合中的上述細胞形態(tài)，確定該菌株為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。

用引物27F和1492R分別進行16s rRNA序列擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳。經(jīng)測序分析菌株擴增的序列長為1400bp。將菌株的16s rRNA 序列進行BLAST分析后，結(jié)果顯示，Lac-1菌株與干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)相似度達到了100％，鑒定菌株為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。

實施例2

1、Lac-1菌株發(fā)酵液的制備方法，包括以下步驟：

(1)將干酪乳桿菌菌株Lac-1劃線接種在LB培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中平板培養(yǎng)60h，培養(yǎng)溫度設(shè)定為37℃，得到單株菌落。

(2)將干酪乳桿菌菌株Lac-1的單株菌落接種在種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)中，在恒溫搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm，溫度為37℃，振蕩培養(yǎng)30h；液體種子培養(yǎng)基配方為LB培養(yǎng)基，即酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，定容至1L。

(3)將種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為1％，溫度設(shè)定為37℃，獲得濃度為10⁷cfu/mL的發(fā)酵液(原液)；液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為LB培養(yǎng)基，即酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，定容至1L。

將發(fā)酵液及其10倍、100倍稀釋液分別處理根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)，測定干酪乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物對根結(jié)線蟲的殺死效果。

2、制備試驗用線蟲

采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所溫室。將培養(yǎng)根結(jié)線蟲的辣椒根系取出，用水輕輕沖洗，小心取下卵塊，放在1％的次氯酸鈉中消毒3min，再用無菌水沖洗3次，放在含有少量無菌水的培養(yǎng)皿中，在25℃恒溫箱中培養(yǎng)，每隔24h收集一次孵化的根結(jié)線蟲二齡幼蟲。

3、試驗方法

在無菌的細胞培養(yǎng)板上，分別向孔內(nèi)加入不同濃度的發(fā)酵液各1mL，并以無菌水作為對照，然后分別向處理和對照中加入100μL線蟲懸浮液(100條線蟲)，放在室溫下24h，觀察根結(jié)線蟲的死亡情況，計算校正死亡率，即為殺線蟲效果，每個處理24個孔(樣本)，每個試驗重復(fù)3次。

校正死亡率(％)＝(處理線蟲死亡率－對照線蟲死亡率)/(1－對照線蟲死亡率)×100％

4、試驗結(jié)果：

通過上述試驗，測定不同倍數(shù)發(fā)酵液處理24h對根結(jié)線蟲的毒力效果，結(jié)果表明不同發(fā)酵液倍數(shù)對線蟲的作用效果不同，發(fā)酵液原液的作用根結(jié)線蟲的校正死亡率為100％，發(fā)酵液稀釋后防治效果明顯降低在10倍稀釋液中殺線蟲過只有77.8％，而在100倍稀釋液中線蟲死亡率很低(<10％)，與對照的差異很小。試驗說明發(fā)酵液在高濃度下具有良好的防治根結(jié)線蟲效果。

表1不同濃度的Lac-1菌株發(fā)酵液殺線蟲效果

實施例3

1、Lac-1菌株發(fā)酵液的制備方法，包括以下步驟：

(1)將干酪乳桿菌菌株Lac-1劃線接種在LB培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中平板培養(yǎng)60h，培養(yǎng)溫度為37℃，得到單株菌落。

(2)將干酪乳桿菌菌株Lac-1的單株菌落接種在種子培養(yǎng)基中，在恒溫搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm，溫度為37℃，振蕩培養(yǎng)30h；液體種子培養(yǎng)基配方為LB培養(yǎng)基，即酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，定容至1L。

(3)將種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為1％，溫度設(shè)定為37℃，獲得濃度為10⁷cfu/mL的發(fā)酵液；液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為LB培養(yǎng)基，即酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，定容至1L。

在番茄幼苗上接種Lac-1菌株的發(fā)酵液1mL，2天后，接種南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲，每株接種1000條，并在5周后檢測根結(jié)數(shù)量，計算防治效果。每個處理30株番茄苗，每個處理重復(fù)3次。并以清水處理作為對照。

根結(jié)線蟲病情分級標準為：

表2番茄根結(jié)線蟲病病情級別劃分

根結(jié)指數(shù)計算：

調(diào)查每份鑒定材料根部發(fā)病情況，根據(jù)病害癥狀描述，逐份材料進行調(diào)查，記載病情級別，計算出根結(jié)指數(shù)(RKI)。

根結(jié)指數(shù)按下列公式計算：

根結(jié)指數(shù)(％)＝∑(s×n)/N×M×100％

式中：

∑--各病情級別代表數(shù)值與其相對應(yīng)病情級別病株數(shù)乘積的總和；

S--各病情級別代表數(shù)值；

n--各病情級別病株數(shù)；

N--調(diào)查總株數(shù)；

M--最高病情指數(shù)。

防治效果計算公式：

防治效果(％)＝(1－處理根結(jié)數(shù)/對照根結(jié)數(shù))×100％

2、試驗結(jié)果

處理結(jié)果見表2，通過試驗可以看出在發(fā)酵液處理后番茄植株上的根結(jié)數(shù)量顯著降低，在對照處理中根結(jié)數(shù)量平均為113.4個/株，而在菌株Lac-1處理的番茄中的根結(jié)數(shù)量平均為12.7個/株，Lac-1菌株對根結(jié)線蟲的防治效果達到了88.7％，說明生防菌劑可以有效的防治番茄根結(jié)線蟲。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，特別是設(shè)施番茄栽培中防治根結(jié)線蟲病具有重要價值。

表2不同處理根結(jié)數(shù)量及防治效果

實施例4

一種Lac-1菌株生防菌劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)將干酪乳桿菌菌株Lac-1劃線接種在LB培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中平板培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度設(shè)定為35℃，得到單株菌落。

(2)將干酪乳桿菌菌株Lac-1的單株菌落接種在種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)中，在恒溫搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm，溫度為35℃，振蕩培養(yǎng)24h；液體種子培養(yǎng)基配方為LB培養(yǎng)基，即酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，定容至1L。

(3)將種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為1％，溫度設(shè)定為35℃，獲得濃度為10⁷cfu/mL的發(fā)酵液(原液)，液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為LB培養(yǎng)基，即酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，定容至1L；然后將得到的發(fā)酵液直接分裝成液體劑型。

實施例5

一種Lac-1菌株生防菌劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)將干酪乳桿菌菌株Lac-1劃線接種在LB培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中平板培養(yǎng)72h，培養(yǎng)溫度為40℃，得到單株菌落。

(2)將干酪乳桿菌菌株Lac-1的單株菌落接種在種子培養(yǎng)基中，在恒溫搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm，溫度為40℃，振蕩培養(yǎng)36h；液體種子培養(yǎng)基配方為LB培養(yǎng)基，即酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，定容至1L。

(3)將種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為2％，溫度設(shè)定為40℃，獲得濃度為10¹⁰cfu/mL的發(fā)酵液；液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為LB培養(yǎng)基，即酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，定容至1L；然后將得到的發(fā)酵液直接分裝成液體劑型。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明實質(zhì)內(nèi)容上所作的任何修改、等同替換和簡單改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。