本發(fā)明涉及微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說是涉及一種類芽孢桿菌及其應用。
背景技術(shù)：
：楊柳科中楊屬和柳屬木本由于樹形美觀、適應性強、易成活等優(yōu)點，成為常見的防護林及綠化樹種，亦可作用材樹種。隨著組織快繁技術(shù)的不斷成熟和大范圍應用，這些樹種通過組培快繁技術(shù)可加快樹苗的形成過程，提高植樹造林的效率。但是，在楊屬和柳屬木本植物快繁和生長過程中，由于外界環(huán)境的影響，容易造成植株生長狀態(tài)較差的現(xiàn)象，如根長短、根數(shù)少、苗高低、成活率低、生物量低等，這樣一來就限制了楊屬和柳屬木本植物組織快繁的效率。植物內(nèi)生細菌(endophyticbacteria)區(qū)別于生長在植物表面的細菌，分布于健康植物體內(nèi)，具豐富的種群多樣性，不會使宿主植物表現(xiàn)出明顯的感染癥狀。作為植物微生態(tài)系統(tǒng)的組成部分，它們可能促進了宿主植物的適應性。隨著人們對于自然環(huán)境保護意識的逐漸增強，它們的研究和應用對于降低病蟲害或惡劣環(huán)境對植物的危害以及在促進植物生長和固氮作用等方面具有重要意義和應用價值，為人們利用植物內(nèi)生細菌提供了新的思考方向，展現(xiàn)了廣闊的發(fā)展前景。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種類芽孢桿菌，使得所述類芽孢桿菌能夠顯著提高楊屬和柳屬木本植物的生長狀態(tài)，如增加根長、根數(shù)、苗高和生物量，提高成活率，使其可以應用在楊屬和柳屬木本植物的生長繁殖過程中。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種類芽孢桿菌，其分類命名為類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)，于2016年7月06日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCCNo.12738。其中所述類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)革蘭氏染色陰性，有芽孢，菌落呈圓形，表面光滑圓潤，邊緣整齊，呈乳白色。本發(fā)明所述類芽孢桿菌分離自河北省保定市楊樹根際土壤中，命名為P26。經(jīng)測序菌株P(guān)26的16SrDNA核苷酸序列大小約為1501bp。經(jīng)與Genebank中的相似序列相比較，菌株P(guān)26的核苷酸序列與PaenibacillusLa1(登記號為AM906090)、P.sp.Ma-2(登記號為AM906089)和P.humicus(登記號分別為AM411529、EU867348)的16SrDNA核苷酸序列同源性最高相似性最高達到99％；與P.sepulcri(登記號為DQ291142)、P.castaneae(登記號為EU099594)、P.mendelii(登記號為AF537343)、P.favisporus(登記號為NR_029071)、P.borealis(登記號為AJ011327)的16SrDNA核苷酸序列同源性相似性達到96％。對菌株P(guān)26進一步形態(tài)和生理生化鑒定，結(jié)果顯示，P26革蘭氏染色陰性，有芽孢，菌落呈圓形，表面光滑圓潤，邊緣整齊，呈乳白色。生理生化特性見表1：表1根據(jù)菌株P(guān)26的形態(tài)特征和16SrDNA核苷酸序列對比結(jié)果，選取類芽孢桿菌屬的幾種菌株的16SrDNA核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)，結(jié)果表明，菌株P(guān)26與菌株P(guān).sp.La1(AM906090)和P.sp.Ma-2(AM906089)位于同一族群，親緣關(guān)系最近。根據(jù)菌株P(guān)26的形態(tài)特征、生理生化特性和16SrDNA核苷酸序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育分析，參照《Bergey'sManualofSystematicBacteriology》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》將菌株P(guān)26鑒定為類芽孢桿菌Paenibacillus.。本發(fā)明采用菌株P(guān)26對三倍體毛白楊組培苗接菌在低氮培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并對柳樹和歐美楊107的室外扦插插穗接菌處理，檢測菌株P(guān)26對促進近緣種植物生根及生長的能力。試驗結(jié)果表明：菌株P(guān)26對三倍體毛白楊組培苗生根和生長促進作用顯著；對歐美楊107和旱柳硬枝插條的生根及生長也有顯著的促進作用?；谏鲜黾夹g(shù)效果，本發(fā)明提出了所述類芽孢桿菌在促進楊屬和柳屬木本植物生長中、在楊屬和柳屬木本植物組織快繁中，以及在制備楊屬和柳屬木本植物微生物促生劑中的應用。其中，所述楊屬木本植物優(yōu)選為白毛楊或歐美楊；所述柳屬木本植物優(yōu)選為旱柳。同時，本發(fā)明還提供了一種楊屬和柳屬木本植物的組織快繁方法，包括：A、將保藏編號為CGMCCNo.12738的類芽孢桿菌在TSA肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)活化；B、將楊屬或柳屬木本植物的插條或組培苗在步驟A中的培養(yǎng)中浸沾10s-10min，然后在培養(yǎng)基質(zhì)中進行繁育。所述培養(yǎng)基質(zhì)既可以是大田土壤，也可以是蛭石、珍珠巖、河沙等組織快繁常用的基質(zhì)。作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)基質(zhì)包括含有2.5mM硝酸銨的低氮BEMB200培養(yǎng)基，進一步地該培養(yǎng)基包含IBA，IBA濃度可以為0.15-0.3mg/L。作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)基質(zhì)包含IBA，更為優(yōu)選地，所述IBA濃度為0.15-0.3mg/L。生物材料保藏信息說明：P26，分類命名：類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)，于2016年7月06日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo.12738。有益效果：本發(fā)明的類芽孢桿菌，其能夠增加楊屬和柳屬木本植物根長、根數(shù)、苗高和生物量，提高成活率，具有顯著的促生作用，可應用在促進楊屬和柳屬木本植物生長中、楊屬和柳屬木本植物組織快繁中，以及制備楊屬和柳屬木本植物微生物促生劑中。附圖說明圖1所示為菌株P(guān)26的16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹。具體實施方式本發(fā)明實施例公開了一種類芽孢桿菌及其應用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明所述菌株和應用已通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品、方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。以下就本發(fā)明所提供的一種類芽孢桿菌做進一步說明。一、菌株P(guān)26的16SrDNA序列測定與系統(tǒng)發(fā)生分析PCR擴增菌株P(guān)26的16SrDNA，然后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序鑒定。將所得菌株的序列提交到Genbank中利用Blast程序進行相似序列對比，從中選擇相似性較高的序列，利用ClaustalX進行序列對比分析，然后用MEGA軟件構(gòu)件系統(tǒng)進化樹，并進行Bootstrap分析，重復次數(shù)為1000次。經(jīng)測序菌株P(guān)26的16SrDNA核苷酸序列大小約為1501bp。經(jīng)與Genbank中的相似序列相比較，菌株P(guān)26的核苷酸序列與PaenibacillusLa1(登記號為AM906090)和P.sp.Ma-2(登記號為AM906089)的16SrDNA核苷酸序列同源性最高相似性最高達到99％。根據(jù)菌株P(guān)26的形態(tài)特征和16SrDNA核苷酸序列對比結(jié)果，選取類芽孢桿菌屬的幾種菌株的16SrDNA核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)，結(jié)果表明，菌株P(guān)26與菌株P(guān).sp.La1(AM906090)和P.sp.Ma-2(AM906089)位于同一族群，親緣關(guān)系最近。根據(jù)菌株P(guān)26的形態(tài)特征、生理生化特性和16SrDNA核苷酸序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育分析，參照《Bergey'sManualofSystematicBacteriology》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》將菌株P(guān)26鑒定為類芽孢桿菌Paenibacillussp.。二、三倍體白楊接菌培養(yǎng)試驗1、試驗菌株本發(fā)明所述類芽孢桿菌P26；與P26在相同時間、環(huán)境以及土壤中分離得到的經(jīng)鑒定同樣是類芽孢桿菌的P27(如P.humicus)；2、培養(yǎng)基試驗中所用培養(yǎng)基為低氮BEMB200培養(yǎng)基(含有2.5mM硝酸銨)。將配置好的培養(yǎng)基分裝入盛有40ml珍珠巖的100ml的三角瓶中(培養(yǎng)液為浸透珍珠巖為宜)，分裝完成后置于120℃高壓滅菌鍋中滅菌20min。3、接菌試驗方法及結(jié)果將培養(yǎng)好的三倍體毛白楊組培苗置于超凈工作臺上，按單莖切斷，每段為帶有2片小葉的1.5cm長的莖段。試驗設(shè)置3個處理，CK(不接菌)、P26(接菌P26)、P27(接菌P27)。將切好的莖段在分別含有P26和P27培養(yǎng)過夜的TSA肉湯培養(yǎng)基中浸泡10s，對照(CK)則不接菌。將處理好的莖段分別接入盛有低氮珍珠巖培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)。每個處理24瓶，每瓶接2個莖段。培養(yǎng)開始后每10d從各處理中隨機抽取8個組培苗進行調(diào)查，測量記錄組培苗的主根數(shù)量、根長和苗高，并觀察其生長狀況。培養(yǎng)30d時，將組培苗取出，在35℃烘箱中恒量后，測定苗的干質(zhì)量。結(jié)果見表2。表2菌株對三倍體毛白楊組培苗生根和生長的影響注：同一列同一培養(yǎng)時間相同字母表示無顯著差異(p<0.05)由表2可見，在接種P26菌株的低氮珍珠巖培養(yǎng)基上，三倍體毛白楊莖段根系生長、苗高生長和生物量均有明顯提高趨勢，各培養(yǎng)時間菌株處理的各項指標均與對照菌株P(guān)27和CK達到顯著差異，而P27組和CK組并未有顯著差異。培養(yǎng)10d時，P26處理組的平均根數(shù)3.24條、平均根長1.96cm、平均苗高2.31cm，對照組平均根數(shù)1.21條、平均根長0.93cm、平均苗高1.92cm；P26處理組的平均根數(shù)、平均根長和平均苗高分別比未接菌的CK高167.77％、110.75％、20.31％，比P27高126.57％、56.8％、5.96％。隨著培養(yǎng)時間的延長，P26菌株促進生根和生長的作用仍然明顯：到30d時，P26處理組的平均根數(shù)5.71、平均根長4.14cm、平均苗高5.26cm；P26處理組的平均根長、平均根數(shù)和平均苗高分別比未接菌的CK提高191.32％、80.0％和20.92％，比P27高65.02％、34.41％和29.56％。在試驗中也觀察到，接種10d時，未接菌處理的CK組部分組培苗并未生根，且在生長過程中伴有輕微的玻璃化現(xiàn)象，而P26組的組培苗則生長旺盛，苗木更加健壯。4、菌株與IBA聯(lián)合處理試驗將培養(yǎng)好的三倍體毛白楊組培材料按3中方法蘸取P26菌液后，分別接入含有0.15mg/L、0.30mg/LIBA濃度的BEMB200珍珠巖培養(yǎng)基的三角瓶中。每個處理16瓶，每瓶接2個莖段。培養(yǎng)開始后30d時進行統(tǒng)計調(diào)查，其他調(diào)查方法同3。結(jié)果見表3。表3不同IBA濃度與不同菌株處理對三倍體毛白楊組培苗生根生長的影響處理平均根數(shù)平均根長(cm)平均苗高(cm)P265.65±2.68ab4.09±2.65bc5.20±1.37abP26+0.15mg/LIBA4.74±2.42b4.91±2.59ab4.87±1.50bP26+0.30mg/LIBA6.35±3.05a5.43±3.02a5.81±2.47aCK2.11±1.72c2.43±0.49d4.55±1.35c注：同一列相同字母表示無顯著差異(p<0.05)表3結(jié)果表明，P26菌株處理及菌株與IBA聯(lián)合處理，對三倍體毛白楊生根和生長均有明顯的促進作用，均顯著優(yōu)于對照處理。菌株與IBA聯(lián)合處理效果與僅用菌株處理相比有一定的提高效果，特別是與0.3mg/L濃度下的IBA聯(lián)合。以上所述的實施例僅是對本發(fā)明的優(yōu)選方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案做出的各種變形和改進，均應落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>河北農(nóng)業(yè)大學<120>一種類芽孢桿菌及其應用<130>2016<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1258<212>DNA<213>Paenibacillus<400>1gacgaacgctggcgtcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggatcttgtccttcgggaca60aggttagcggcggacgggtgactaacacgtaggcaagctgccctcacgactgggataacc120tccgtaaacggatgctaataccggatatgcggtctctcctcctggagggatcgggaaaga180cggagcaatctgtcgcttggggatgggcctgcggcgcattagctagttggtgrggtaacg240gctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactga300gagacggcccagactcctactggaggcagcagtagggcatcttccgcaatggacgcgagt360ctgactgagcaacgccgcgtgagtgaggaaggccttctggtcgtaaagctctgttgccag420ggaagaacgggtggaagagtaactgcttccgccatgacggtacctgagaagaaagccccg480gctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattatt540gggcgtacagcgcgcgcaggcggctttgtaagtccggtgtttaatcttggggctcaaccc600caagtcgcacgggaaactgcaaggcttgaggaagaacgggtgcaagagtaactgcttccg660ccatgacggtacctgagaagaaagccccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatac720gtagggggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcagcggctttgtaag780tccggtgtttaatcttggggctcaaccccaagtcgcacgggaaactgcaaggcttgagtg840cagaagaggaaagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaaca900ccagtggcgaaggcgactttctgggctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggag960caaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgctaggtgttaggg1020gtttcgatacccttggtgccgaagttaacacaataagcattccgcctggggagtacgctc1080gcaagagtgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcagtggagtatgtggttt1140aattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatccccctgaatcacctagaga1200taggtgcggccttcgggacaggggagacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgt1258當前第1頁1 2 3