本發(fā)明屬生物工程技術領域，具體涉及一株具有分泌生產高酶活中性蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌菌株及其應用。

背景技術：

解淀粉芽孢桿菌在自然界中分布廣泛，一般為好氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，胞內可產生圓形、橢圓形或柱狀的內生芽孢。芽孢壁中有皮質層，對熱、紫外線和離子輻射及抗菌素具有很高的抗性，可以耐受飼料加工、儲藏、耐酸、高溫、耐擠壓等優(yōu)點。

中性蛋白酶是能催化蛋白質肽鍵水解, 最適作用pH 值在7.0 左右的蛋白酶。中性蛋白酶由于具有催化反應速度快、無工業(yè)污染、催化反應條件適應性較寬等性質和優(yōu)點，被應用于食品、制藥、化妝品、洗滌劑、絲紡、毛皮軟化等行業(yè)。

酶的應用已有千年以上的歷史，雖然中性蛋白酶是最早為人類所發(fā)現(xiàn)并應用于工業(yè)化生產的蛋白酶制劑之一，但是廣泛應用還是最近幾十年的事。隨著科學技術的發(fā)展，隨著酶的制備、酶和細胞固定化、酶分子改造等酶技術的發(fā)展，中性蛋白酶的應用范圍也不斷擴大。自上世紀以來，世界各國科研工作者一直都致力于中性蛋白酶產生菌的篩選、酶提取、純化以及酶學性質的研究和應用研究工作，取得了一定的成績。

國內目前從事中性蛋白酶生產與銷售的酶制劑企業(yè)很少，主要是由于所采用生產菌種大多為上世紀八十年代所開發(fā)的誘變菌株，產酶能力下降、不太穩(wěn)定、部分優(yōu)良性狀出現(xiàn)部分退化或喪失，且易受到酵母及噬菌體的污染，對生產造成一定程度的損失，加之，目前我國中性蛋白酶發(fā)酵單位相對較低，濃縮成本高，不便保存與運輸。國外對中性蛋白酶的研究比較早，一些產品化的中性蛋白酶類，都已經研究得比較透徹，且都申請了專利，所以要篩選新的中性蛋白酶生產菌株將成為一個發(fā)展方向。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株高產中性蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌菌株及其應用。本發(fā)明是從天津濱海新區(qū)大港水庫的土壤中分離篩選出一株中性性蛋白酶高產菌株，該高產菌株能高效分泌表達中性蛋白酶，酶活力較高，為低成本、規(guī)?；a中性蛋白酶奠定了基礎。

本發(fā)明的優(yōu)勢是：（1）解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1 是從天津濱海新區(qū)大港水庫的土壤中分離出來的，在發(fā)酵過程中能產生高活性的蛋白酶。（2）解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1生長迅速，具有較強分解蛋白的能力。

本發(fā)明通過分離篩選的方法獲得了一株高產中性蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌。所述菌株能顯著提高中性蛋白酶的產量，搖瓶發(fā)酵酶活高達8000U/ml，且該菌株株表達的中性蛋白酶的酶學性質穩(wěn)定，具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1菌落在脫脂牛奶培養(yǎng)基平板上水解圈圖；

圖2： 解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1 16SrDNA電泳圖；

圖3：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1生長曲線圖；

圖4：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1發(fā)酵生產中性蛋白酶酶活圖；

圖5：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1在不同的發(fā)酵條件下，生產中性蛋白酶酶活圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。

下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。

實施例1 解淀粉芽孢桿菌的篩選

（1）蛋白酶菌株初篩。將采集的土樣稱取10 g，加入裝有90ml無菌水并放有玻璃珠的250 ml三角瓶中，80℃水浴30 min，再充分振蕩30 min，制成10^-5g/ml，10^-6g/ml，10^-7 g/ml的土壤懸液，分別涂布于用于初篩的加有脫脂牛奶的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)2-4天，觀察透明圈的有無。如果產生透明圈，分別測量透明圈和菌落的直徑并計算其比值，選擇比值較大的菌株進行復篩。附圖1中1和2為篩選到的解淀粉芽孢桿菌在脫脂牛奶平板中形成的透明圈，3和4為不分泌蛋白酶的枯草芽孢桿菌1A751對照組。

（2）蛋白酶菌株復篩。取初篩獲得的中性蛋白酶菌株分別接種到30ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，220rpm培養(yǎng)48h，用福林（Folin）法測定（參照《中華人民共和國專業(yè)標準》SB/T 10317-1999蛋白酶活力測定法），其原理是蛋白質或多肽分子中有帶酚基酪氨酸或色氨酸，在堿性條件下，可使酚試劑中的磷鉬酸化合物還原成藍色（生成鉬藍和鎢藍化合物）。藍色的深淺與蛋白質的含量成正比，可用比色法測定。從中選擇出酶活力最高的菌株作為目的菌株，進行革蘭氏染色和生理生化鑒定。

（3）菌種的確認

采用常規(guī)生理生化反應與分子16S rRNA技術對從土壤中篩選出來的菌株進行鑒定。根據(jù)解淀粉芽孢桿菌在Genebank中的16S rRNA進行分子鑒定，電泳結果如附圖2所示；所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，革蘭氏染色呈陽性，鏡檢為長桿狀，有芽孢，可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P 實 驗、氧化酶與過氧化氫酶均為陽性，且具運動性，進一步采用法國生物梅里埃細菌鑒定儀(參照《常見細菌鑒定手冊》)，最終確定BAP-1為解淀粉芽孢桿菌。

(4)生長曲線的測定

從-80℃甘油管保存的解淀粉芽孢桿菌BAP-1用三區(qū)劃線法接種于固體LB平板上在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，接種在LB固體平板上活化的單菌落至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后，以1%的接種量接種到30mL的LB培養(yǎng)基中，每隔30min取樣測定其OD₆₀₀得到其生長曲線，結果附圖3所示。

實施例2 解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵生產中性蛋白酶

從-80℃甘油管保存的解淀粉芽孢桿菌BAP-1用三區(qū)劃線法接種于固體LB平板上在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，接種在LB固體平板上活化的單菌落至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后，以1%的接種量接種到30mL發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃，220 rpm培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，每間隔12h后，將發(fā)酵液離心，以福林酚法測定粗酶液活力，結果附圖4所示。

實施例3 產中性蛋白酶出發(fā)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

在原來發(fā)酵培養(yǎng)基2×SR的基礎上添加不同濃度的不同的碳源或氮源，發(fā)酵生產堿性蛋白酶，具體方法同上。這些碳源或氮源的終濃度分別為1%的棉籽粉，1%的淀粉，0.3%的牛肉膏，0.5%的蛋白胨，0.5%的酵母膏和0.5%的葡萄糖，標記為BAP-1-a，BAP-1-b，BAP-1-c，BAP-1-d，BAP-1-e, BAP-1-f。終濃度分別為4%的棉籽粉，4%的淀粉，0.8%的牛肉膏，1.5%的蛋白胨，2%的酵母膏和2%的葡萄糖，標記為BAP-1-g，BAP-1-h，BAP-1-i，BAP-1-j，BAP-1-k, BAP-1-l。其中添加終濃度為0.5%的葡萄糖和終濃度為1%的淀粉時發(fā)酵生產的中性蛋白酶酶活最高。結果附圖5所示。

堿性蛋白酶活力的測定

采用《中華人民共和國專業(yè)標準》SB/T 10317-1999蛋白酶活力測定方法即福林（Folin）法。

其中各培養(yǎng)基的配方如下：

(1) LB固體培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，脫脂牛奶10 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然，121℃滅菌 20min。

(2)LB種子培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L， pH自然，121℃滅菌 20min。

(3)2×SR發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸粉50 g/L，蛋白胨30 g/L，K₂HPO₄ 6 g/L，pH 7.2. 121℃滅菌 20min。