本發(fā)明涉及一株降解氨基甲酸乙酯和尿素的解淀粉芽孢桿菌，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一種致癌物質(zhì)，被人體持續(xù)過量攝入可能會引發(fā)肺癌、肝癌等嚴重腫瘤疾病，并且對人體的免疫系統(tǒng)造成傷害。釀造酒中氨基甲酸乙酯的主要前體物質(zhì)是尿素與乙醇。因此可通過生物干擾降低酒中氨基甲酸乙酯和尿素的含量是我們降低酒中氨基甲酸乙酯有效措施。但目前報道的微生物均只有單一降低某一種氨基甲酸乙酯前體物或僅能夠降解氨基甲酸乙酯的特性。因此，篩選一種同時降解氨基甲酸乙酯前體及氨基甲酸乙酯的微生物有助于從源頭上消除EC的產(chǎn)生并能直接減少發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的含量。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一株降解氨基甲酸乙酯和尿素的解淀粉芽孢桿菌JP21，已于2016年9月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No:M 2016499，保藏地址為中國武漢，武漢大學。
本發(fā)明的第二個目的是提供所述解淀粉芽孢桿菌JP21的培養(yǎng)方法，所述方法是將解淀粉芽孢桿菌JP21接種至MRS培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)12～30h。
在本發(fā)明的一種具體實施方式中，所述方法是于37℃培養(yǎng)24h。
本發(fā)明的第三個目的是一種制備脲酶和氨基甲酸乙酯水解酶的方法，是將權(quán)利要求1所述解淀粉芽孢桿菌JP21接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～30h，將發(fā)酵液離心、收集菌體，破碎細胞，獲得脲酶和氨基甲酸乙酯水解酶。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法將菌體用pH 4.0-5.5的檸檬酸緩沖液重懸浮，再進行破碎細胞。
本發(fā)明的第四個目的是提供所述解淀粉芽孢桿菌JP21的應用。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述解淀粉芽孢桿菌JP21在制備發(fā)酵食品中的應用。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述解淀粉芽孢桿菌JP21在制備調(diào)味品中的應用。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應用包括：降解發(fā)酵食品中存在的氨基甲酸乙酯和其前體物質(zhì)。
本發(fā)明還提供一種降低氨基甲酸乙酯的方法，是將所述解淀粉芽孢桿菌JP21接種至含有氨基甲酸乙酯的液體，或半固體，或固體中。
本發(fā)明還提供一種降低尿素的方法，是將所述解淀粉芽孢桿菌JP21接種至含有尿素液體，或半固體，或固體中。
有益效果：本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌JP21，具有產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶且產(chǎn)酸性脲酶的特性，脲酶的產(chǎn)量為0.46U/mL，降解尿素能力13％；EC水解酶的產(chǎn)量為0.28U/mL,降解EC能力為8％，能夠有效降解氨基甲酸乙酯的前體，減少氨基甲酸乙酯的生成；并可直接降解發(fā)酵食品中的氨基甲酸乙酯。
附圖說明
圖1為氨濃度和OD578的標準曲線。
生物材料保藏
一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)JP21，已于2016年9月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No:M 2016499，保藏地址為中國武漢，武漢大學。
具體實施方式
脲酶的測定：
(1)標準曲線的繪制：以水為空白對照，分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL濃度為4g/L的氯化銨，蒸餾水補至2mL。加入1mL 10％三氯乙酸終止反應。終止反應后加入1mL顯色劑I和1mL顯色劑II,混勻后在37℃保溫20min,反應結(jié)束后用超純水定容10mL，測定578nm吸收度。
(2)發(fā)酵液檢測：取1mL酶液加入1mL 3％的尿素于37℃反應15min后，加入1mL 10％三氯乙酸終止反應。終止反應后加入1mL顯色劑I和1mL顯色劑II,混勻后在37℃保溫20min,反應結(jié)束后用超純水定容至10mL，紫外分光光度計測定578nm吸收值，并通過標準曲線計算菌株的酶活。
顯色劑I：苯酚15g和15g亞硝基鐵氰化鈉15g，超純水定容至250mL，4℃?zhèn)溆谩?/p>
顯色劑II：NaOH 13.125g和7.5mL次氯酸鈉，超純水定容至250mL.，4℃?zhèn)溆谩?/p>
氨基甲酸乙酯水解酶的測定：
取1mL酶液加入1mL 3％的尿素于37℃反應15min后，加入1mL 10％三氯乙酸終止反應。終止反應后加入1mL顯色劑I和1mL顯色劑II,混勻后在37℃保溫20min,反應結(jié)束后用超純水定容至10mL，紫外分光光度計測定578nm吸收值，并通過標準曲線計算菌株的酶活。
酶活計算方法：
A：紫外分光光度值；n：稀釋倍數(shù)；k：標準曲線斜率
實施例1解淀粉芽孢桿菌JP21的篩選
(1)高通量培養(yǎng)和顯色篩選
酒醅中微生物的分離：將新鮮的酒醅與0.85％的生理鹽水以1:1.6的比例混合，混合液梯度稀釋并涂布于MRS平板及YPD平板上。MRS平板置于37℃，YPD平板培養(yǎng)置于30℃培養(yǎng)24h直至有單菌落出現(xiàn)；
尿素或氨基甲酸乙酯利用菌株的分離：將MRS平板及YPD平板上所分離得到的菌株，分別均勻的轉(zhuǎn)接點種到尿素或氨基甲酸乙酯利用平板上，MRS平板分離的微生物在37℃培養(yǎng)24h，YPD平板中分離的微生物置于30℃培養(yǎng)24h直至得到單菌落。
尿素或氨基甲酸乙酯利用菌株的高通量培養(yǎng)：預先在每個孔板中加入250μLMRS培養(yǎng)基，使用Qpix420自動挑菌儀挑取有紫圈的菌落轉(zhuǎn)接至96孔板，每個菌落轉(zhuǎn)接三個平行；分別在最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h后，于4℃6000r/min離心10min，菌泥用生理鹽水重懸浮，1％接種量接于尿素或氨基甲酸乙酯顯色培養(yǎng)中，分別在最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h后顯色，培養(yǎng)基顏色由黃色變?yōu)樽仙臑槟康木辍?/p>
(2)鑒定
將初篩菌株劃線得單菌，在MRS液體培養(yǎng)基中于37℃靜置培養(yǎng)24h，收集菌體，提取基因組，采用通用引物進行16s rDNA擴增，其序列如SEQ ID NO.1所示，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行序列比對，結(jié)果顯示，與解淀粉芽孢桿菌同源性較高，將菌株命名為解淀粉芽孢桿菌JP21。
實施例2解淀粉芽孢桿菌JP21的產(chǎn)酶能力分析
將初篩菌株進行液體培養(yǎng)37℃，靜止培養(yǎng)24h，取50mL菌液4000r/min離心10min，棄上清，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液清洗兩遍，最后用50mL緩沖液重懸浮，冰浴30min，機械破壁120s，得粗酶液。
對粗酶液中的脲酶酶活和氨基甲酸乙酯水解酶的酶活進行測定，繪制的脲酶標準曲線如圖1所示。結(jié)果顯示，脲酶酶活為0.46U/mL，氨基甲酸乙酯降解酶活為0.28U/mL。
實施例3解淀粉芽孢桿菌JP21降解尿素
將初篩菌株進行液體培養(yǎng)37℃，靜置培養(yǎng)24h，取50mL菌液4000rpm/min,10min.用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液清洗兩遍，最后用50mL緩沖液重懸浮，種子液備用。
將種子液(菌濃為6×107CFU/mL)按1％體積比的接種量接種于含終濃度10g/L的尿素及5g/L葡萄糖的培養(yǎng)基中，37℃，靜置培養(yǎng)24h，高效液相色譜法測定尿素含量。結(jié)果為8.7g/L，降解效果為13％。
實施例4解淀粉芽孢桿菌JP21的降解氨基甲酸乙酯
按實施例3的方法，將解淀粉芽孢桿菌JP21接種至含10g/L的EC及5g/L葡萄糖培養(yǎng)基中，37℃，靜置培養(yǎng)24h，測定EC含量，結(jié)果顯示為9.2g/L，降解效果為8％。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大學
<120> 一株降解氨基甲酸乙酯和尿素的解淀粉芽孢桿菌
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1460
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaatcgggtc caccttcggc ggctggctcc ataaaggtta cctcaccgac ttcgggtgtt 60
acaaactctc gtggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc 120
atgctgatcc gcgattacta gcgattccag cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc 180
cgaactgaga acagatttgt gggattggct taacctcgcg gtttcgctgc cctttgttct 240
gtccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc 300
caccttcctc cggtttgtca ccggcagtca ccttagaggt gcccaactga atgctggcaa 360
ctaagatcaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga 420
cgacrrccat gcaccacctg tcactctgcc cccgaagsgg acgtcctatc tctaggattg 480
tcagaggatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc 540
caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca gtcttgcgac cgtactcccc 600
aggcggagtg cttaatgcgt tagctgcagc actaaggggc ggaaaccccc taacacttag 660
cactcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt 720
cgctcctcag cgtcagttac agaccagaga gtcgccttcg ccactggtgt tcctccacat 780
ctctacgcat ttcaccgcta cacgtggaat tccactctcc tcttctgcac tcaagttccc 840
cagtttccaa tgaccctccc cggttgagcc gggggctttc acatcagact taagaaaccg 900
ccygcgagcc ctttacgccc aataattccg gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg 960
gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc tggttaggta ccgtcaaggt gccgccctat 1020
ttgaacggca cttgttcttc cctaacaaca gagctttacg atccgaaaay cttcatcact 1080
cacgcggcgt tgctccgtcr gactttcgty caattggcgg aagattccct actgctgcct 1140
cccgtaggag tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggcc gatcaccctc tcaggtcggc 1200
tacgcatcgt cgccttggtg agccgttacc tcaccaacta gctaatgcgc cgcgggtcca 1260
tctgtaagtg gtagccgaag ccacctttta tgtctgaacc atgcggttca gacaaccatc 1320
cggtattagc cccggtttcc cggagttatc ccagtcttac aggcaggtta cccacgtgtt 1380
actcacccgt ccgccgctaa catcagggag caagctccca tctgtccgct cgacttgcat 1440
gtatagcacg ccgccacttc 1460
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgaaggaatc gtggtcggtg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaactgggtc aagaagcgga 20