本發(fā)明涉及一種微生物芽孢制備領(lǐng)域，具體涉及一種抵抗力可控型芽孢桿菌芽孢的制備方法。

背景技術(shù)：

芽胞是細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)形成的含水量極低抗逆性極強(qiáng)的休眠體。芽孢對(duì)不良環(huán)境如高溫、低溫、干燥、光線和化學(xué)藥物等有很強(qiáng)的抵抗力。由于芽孢極強(qiáng)的抗逆性，且抗力強(qiáng)于大多數(shù)微生物，因此芽孢作為指示微生物被廣泛應(yīng)用于消毒滅菌效果的監(jiān)測(cè)。比如，嗜熱脂肪芽孢桿菌(ATCC 7953)芽孢被用于監(jiān)測(cè)壓力蒸汽滅菌、過(guò)氧化氫低溫等離子體滅菌等，枯草芽胞桿菌黑色變種(ATCC 9372)芽胞被用于監(jiān)測(cè)環(huán)氧乙烷滅菌、干熱滅菌等。芽孢抗力的穩(wěn)定性是準(zhǔn)確評(píng)價(jià)各種因子對(duì)醫(yī)療器械消毒與滅菌效果的前提。

作為指示菌株，依據(jù)中國(guó)藥典要求，其芽孢的抵抗力，必需在一定范圍內(nèi)才能較好的反映滅菌效果，抵抗力大小通常以D值(就是在一定的處理環(huán)境中和在一定的熱力致死溫度條件下某細(xì)菌數(shù)群中每殺死90％原有殘存活菌數(shù)時(shí)所需要的時(shí)間)。如壓力蒸汽滅菌中，嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢D值為1.5-3min；環(huán)氧乙烷滅菌中，枯草芽胞桿菌黑色變種芽孢在一定的滅菌條件下D值需大于2.5min。

目前，芽孢生產(chǎn)制備的方案較多，主要集中在提高產(chǎn)孢數(shù)量和芽孢產(chǎn)率方面。在現(xiàn)有研究中，利用菌株制備芽孢的同時(shí)，對(duì)芽孢抵抗力實(shí)現(xiàn)可控調(diào)節(jié)均未涉及。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提出一種抵抗力可控型芽孢桿菌芽孢的制備方法，其通過(guò)調(diào)節(jié)芽孢制備中的營(yíng)養(yǎng)成分、及變換培養(yǎng)條件，在保證芽孢的產(chǎn)量和產(chǎn)率的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了制備不同抵抗力芽孢的培養(yǎng)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種抵抗力可控型芽孢桿菌芽孢的制備方法，其包括以下步驟：

1)低抵抗力菌株篩選：

向基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中添加瓊脂，制成固體培養(yǎng)平板；將嗜熱脂肪芽孢桿菌接種于所述固體培養(yǎng)平板，50℃培養(yǎng)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)菌落形態(tài)，挑選最先轉(zhuǎn)化成芽孢的菌落，再次接種于基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，在50℃、150-250rpm下培養(yǎng)12h后，收集菌株，得到低抵抗力菌株；為后續(xù)高D值調(diào)節(jié)提供種子，因?yàn)橛傻拖蚋哒{(diào)節(jié)比較容易。

2)菌株培養(yǎng)條件適應(yīng)性調(diào)節(jié)：

將所述低抵抗力菌株以1:5-20的比例，接種于液體抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，在50℃-60℃、150-250rpm下培養(yǎng)12h后，得到菌株懸液；這一步的目的是使菌株逐步適應(yīng)培養(yǎng)條件及營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的變化，防止?fàn)I養(yǎng)的突變，導(dǎo)致菌體死亡，優(yōu)勝劣汰，達(dá)到優(yōu)選目的同時(shí)擴(kuò)大菌體數(shù)量。

3)不同抵抗力的芽孢的誘導(dǎo)制備：

向抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中添加瓊脂，制成抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基平板；將所述菌株懸液涂布接種于抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基平板表面，50-60℃培養(yǎng)48-60h，收集平板表面的菌苔，根據(jù)抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的不同成分，即可獲得具有不同抵抗力的芽孢桿菌芽孢。本案發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)溫度越高，生成芽孢抗力越大；鈣離子濃度越高，抗力越大；蛋白胨等營(yíng)養(yǎng)越多，抗力越大；Mn²⁺、Mg²⁺離子，是超氧化物歧化酶、L-阿拉伯糖異構(gòu)酶等許多酶的輔助因子或者酶的激活劑，參與多種酶促反應(yīng)，是微生物生長(zhǎng)和芽孢形成所需的一種微量元素，主要與芽孢數(shù)量與芽孢率有關(guān)。

優(yōu)選的是，所述的抵抗力可控型芽孢桿菌芽孢的制備方法，其中，所述基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括：8重量份的胰蛋白胨、5重量份酵母提取物、5重量份的氯化鈉和1000重量份的蒸餾水。

優(yōu)選的是，所述的抵抗力可控型芽孢桿菌芽孢的制備方法，其中，所述基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的pH為7.2-7.5。

優(yōu)選的是，所述的抵抗力可控型芽孢桿菌芽孢的制備方法，其中，所述抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基包括：8重量份的胰蛋白胨、5重量份酵母提取物、5重量份的氯化鈉、1-10重量份的大豆蛋白胨、0.05-0.5重量份的MnSO₄·H₂O、0.05-0.5重量份的MgSO₄·2H₂O、0.001-0.1重量份的CaCl₂·2H₂O和1000重量份的蒸餾水。

優(yōu)選的是，所述的抵抗力可控型芽孢桿菌芽孢的制備方法，其中，所述抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為7.2-7.5。

優(yōu)選的是，所述的抵抗力可控型芽孢桿菌芽孢的制備方法，其中，所述抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中還包括有0.1-0.2重量份的CoCl₂。

優(yōu)選的是，所述的抵抗力可控型芽孢桿菌芽孢的制備方法，其中，所述抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中還包括有0.1-0.2重量份的AlCl₃。

本發(fā)明的有益效果是：

1、本案在保證制備的芽孢數(shù)量和芽孢率的同時(shí)，通過(guò)培養(yǎng)條件及營(yíng)養(yǎng)的改變，可有效控制調(diào)節(jié)芽孢的抵抗力，實(shí)現(xiàn)芽孢抗力可控調(diào)節(jié)；

2、通過(guò)本案工藝可簡(jiǎn)單有效控制芽孢抗力，制備適用于滅菌效果監(jiān)測(cè)的指示微生物芽孢；如嗜熱脂肪芽孢桿菌，運(yùn)用本方法，可實(shí)現(xiàn)D值1-7min可控調(diào)節(jié)；

3、本案操作簡(jiǎn)單，簡(jiǎn)化程序，工藝易于放大，易于重復(fù)，易于工業(yè)化生產(chǎn)；可實(shí)現(xiàn)芽孢產(chǎn)量：10⁹個(gè)/平板；芽孢產(chǎn)率99％；抗力范圍：D值1-7min可控。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書(shū)文字能夠據(jù)以實(shí)施。

實(shí)施例1

1.低抵抗力菌株篩選：

每升基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，添加15重量份瓊脂，壓力蒸汽滅菌，制備為固體培養(yǎng)平板。將嗜熱脂肪芽孢桿菌(ATCC 7953)劃線接種于固體培養(yǎng)平板，培養(yǎng)皿用保鮮膜包裹密封，50℃培養(yǎng)倒置培養(yǎng)，通過(guò)顯微鏡，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)菌落及菌體形態(tài)，挑取最先轉(zhuǎn)化成芽孢的菌落。

再次接種于液體基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，50℃，250rpm/min條件下培養(yǎng)12h后，收集菌株。即為低抵抗力菌株。

2.菌株培養(yǎng)條件適應(yīng)性調(diào)節(jié)：

取上述菌株懸液2ml，以1:5比例，接種于液體抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(不加瓊脂)，50℃，250rpm/min條件下培養(yǎng)12h后，收集菌株。

3.不同抗力芽孢誘導(dǎo)制備：

取上述菌株懸液，約1ml，涂布接種于抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基平板表面50℃-60℃培養(yǎng)48-60h，收獲平板表面菌苔，依據(jù)抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分不同，即可獲得具有不同抗力的芽孢。

3.1抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基

每升抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中，固定Mn²⁺、Mg²⁺離子濃度為0.25wt％，培養(yǎng)溫度為55℃條件下，通過(guò)改變大豆蛋白胨及Ca²⁺添加濃度，實(shí)現(xiàn)的芽孢抗力的調(diào)節(jié)結(jié)果，如下表1?？沽Y(jié)果以D值(min)表示。

其中，基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括：8重量份的胰蛋白胨、5重量份酵母提取物、5重量份的氯化鈉和1000重量份的蒸餾水。

抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基包括：8重量份的胰蛋白胨、5重量份的酵母提取物、5重量份的氯化鈉、1-10重量份的大豆蛋白胨、0.05-0.5重量份的MnSO₄·H₂O、0.05-0.5重量份的MgSO₄·2H₂O、0.001-0.1重量份的CaCl₂·2H₂O和1000重量份的蒸餾水。

表1

實(shí)施例2

抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中還包括有0.1-0.2重量份的CoCl₂，其余與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例3

抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中還包括有0.1-0.2重量份的AlCl₃，其余與實(shí)施例2相同。

表2列出實(shí)施例2的抗力結(jié)果。(每升抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中，固定Mn²⁺、Mg²⁺離子濃度為0.25wt％，Ca²⁺離子濃度為0.01％，培養(yǎng)溫度為55℃)

表2

表3列出實(shí)施例3的抗力結(jié)果。(每升抗力調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中，固定Mn²⁺、Mg²⁺離子濃度為0.25wt％，Ca²⁺離子濃度為0.01％，Co²⁺離子濃度為0.01％，培養(yǎng)溫度為55℃)

表3

需要說(shuō)明的是，雖然上述數(shù)據(jù)中對(duì)各離子進(jìn)行了濃度限定，但本案的方案絕不僅限于上述限定的濃度，上述數(shù)據(jù)只是給出了一些具體的例子來(lái)反應(yīng)由不同離子的引入所給抗力結(jié)果(D值)帶來(lái)的影響變化趨勢(shì)。并且，這種變化曲線是(或接近)線性的。這給對(duì)抗力結(jié)果進(jìn)行可控性設(shè)計(jì)帶來(lái)了可能。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開(kāi)如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書(shū)和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)。