專利名稱：來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及β-半乳糖苷酶。具體而言，涉及從環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)中分離出的新型β _半乳糖苷酶及其基因以及其用途等。本發(fā)明的β _半乳糖苷酶例如可用作低乳糖牛奶的制造、作為腸內(nèi)雙歧桿菌生長因子的低聚半乳糖的制造、或者乳糖不耐受癥患者用的藥品或補充劑的有效成分。本申請基于2009年6月5日提出的日本國專利申請第2009-136735號要求優(yōu)先權，并將該專利申請的全部內(nèi)容通過參照而援引于此。
背景技術：
β -半乳糖苷酶(EC3. 2. 1. 23)是水解β _D_半乳糖苷鍵而使D-半乳糖游離的酶， 一般廣泛存在于微生物和動植物中。β -半乳糖苷酶的別名也稱為乳糖酶，作為用于制造來自制造乳糖不耐受癥用的低乳糖牛奶、奶酪時副產(chǎn)的乳清的乳清糖漿的酶，或者作為乳糖不耐受癥患者用的藥品、補充劑的有效成分而使用。另外，半乳糖苷酶還具有轉(zhuǎn)移半乳糖苷鍵的能力，已知有利用該能力制造低聚半乳糖(具有半乳糖殘基的寡糖)的方法。作為用于這些用途的β-半乳糖苷酶，已知米曲霉(Aspergillus oryzae)、乳酸克魯維酵母 (Kluyveromyces lactis)、馬克斯克魯維酵母(K. marxinus)、細菌環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)等。其中，對于環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶，由Mozaffer等(非專利文獻1)、 Vetere等(非專利文獻2、、Ito等(非專利文獻3、4)進行了研究。根據(jù)非專利文獻1，報告了分子量為240kDa和160kDa的2種酶的純化。并且報告了，前者的分解活性高，后者的半乳糖轉(zhuǎn)移活性高，另外前者對于合成底物對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)的分解活性比對于乳糖的分解活性高。另一方面，根據(jù)非專利文獻2，報告了分子量212kDa、 145kDa和86kDa的3種酶的純化。但是，不清楚這些多種酶的相互的蛋白質(zhì)化學相關性、分子生物學(基因的)特性。另外，在非專利文獻3、4中報告了 67kDa的酶的基因克隆和重組蛋白質(zhì)的性質(zhì)，但該酶是對β _1，3鍵特異的酶，對牛奶中的乳糖中的鍵β _1，4鍵沒有作用。因此，是與在牛奶、來自牛奶的乳糖的處理中使用的通常的半乳糖苷酶不同的酶。 另外，基因數(shù)據(jù)庫(GenBank)中登錄有2種來自環(huán)狀芽孢桿菌的β _半乳糖苷酶基因(基因數(shù)據(jù)庫登錄號(GenBank accession number)L034M和L03425)，但對于它們，僅報告了基因序列，不清楚是否編碼實際具有活性的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)有技術文獻非專利文獻# # ^lJ i K 1 :Mozaffar, Ζ. ， Nakanishi, K. ， Matsuno, R. ， and Kami kubo, Τ. Agric. Biol. Chem.，48 (12)，3053-3061，1984# 專禾Ij JC 2 :Vetere, A. , and Paoletti, S. Biochem. Biophys. Acta., 1380，223-231 (1998)非專禾Ij 文獻 3 :Ito. Y.，and Sasaki, Τ. Biosci. Biotech. Biochem. ,61(8),
41270-1276(1997)4 :Fujimoto, H. ， Miyasato, M. ， Ito, Y. ， Sasaki, Τ. ， and Ajisaka, K. Glycoconjugate Journal,15，1550160(1998)非專利文獻 5 =Saito, and Miura. Biochim. Biophys. Acta, 72，619—629 (1963)

發(fā)明內(nèi)容
像這樣，報告了作為來自環(huán)狀芽孢桿菌的半乳糖苷酶的多種酶，但由于不清楚它們相互的蛋白質(zhì)化學相關性、分子生物學(基因的)特性，因此，在低乳糖牛奶的制造、 低聚半乳糖的制造等制造產(chǎn)業(yè)上的各種用途的酶劑方面存在限制。本發(fā)明提供來自環(huán)狀芽孢桿菌的新型半乳糖苷酶。本發(fā)明人等在研究環(huán)狀芽孢桿菌產(chǎn)生的半乳糖苷酶的過程中，發(fā)現(xiàn)了目前為止沒有報告的分子量為195kDa(利用SDS-PAGE測得，在質(zhì)量分析中為189. 3kDa)的酶(本說明書中稱為“ β-Gall”)，而且成功地克隆了編碼該酶的基因(以下稱為“本基因”)。并且，明確了本基因的堿基序列和由其推定的氨基酸序列是與目前為止報告的來自環(huán)狀芽孢桿菌的3種半乳糖苷酶(氨基酸序列參照非專利文獻3，基因數(shù)據(jù)庫登錄號L034M和L0342O大不相同的新型堿基序列和氨基酸序列。另外，本發(fā)明人等還發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀芽孢桿菌對合成底物2-硝基苯基-β -D-吡喃半乳糖苷O-nitrophenyl β -D-Galactopyranoside =ONPG)的分解活性低，即產(chǎn)生3種半乳糖基轉(zhuǎn)移活性高的酶(在本說明書中稱為“ β _Gal2”、“ β -Gal3”、“ β _Gal4”)。進而，還發(fā)現(xiàn)這3種β-半乳糖苷酶是由本基因(編碼β-Gall的基因)派生而產(chǎn)生。此外，通過將本基因和本基因的片段導入適當?shù)乃拗鳎€確立了這些半乳糖苷酶蛋白質(zhì)組的制造方法。本發(fā)明基于以上成果而完成，以下示出本發(fā)明。[1] 一種來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶，其分子量為195kDa(利用 SDS-PAGE 測得)。[2] 一種來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶，其由[1]所述的β-半乳糖苷酶的片段構成。[3] 一種β -半乳糖苷酶，由序列號7的氨基酸序列、或顯示β -半乳糖苷酶活性的其片段構成。[4]根據(jù)[3]所述的β -半乳糖苷酶，其中，所述片段含有序列號7的氨基酸序列中從N末端到WSIGNEIY(序列號18)的區(qū)域。[5]根據(jù)[3]所述的β -半乳糖苷酶，其中，所述片段含有序列號8 10中的任意序列號的氨基酸序列。[6]根據(jù)[3]所述的β-半乳糖苷酶，其中，利用含有序列號5的序列的DNA進行編碼。[7] 一種β-半乳糖苷酶基因，其由選自以下(a) (e)中的任意DNA構成(a)編碼序列號6或7的氨基酸序列的DNA ；(b)含有序列號5的序列的DNA ；(c)在嚴格條件下對與序列號5的序列互補的序列進行雜交的DNA ；(d)作為序列號5的序列的DNA序列簡并體的DNA ；
(e)由以序列號5的序列為基準并含有1個或多個堿基的取代、缺失、插入、附加或逆位的序列構成的且編碼具有β -半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。[8]根據(jù)[7]所述的半乳糖苷酶基因，其中，具有半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)由序列號7的氨基酸序列中發(fā)生小于60%、優(yōu)選小于45%、進一步優(yōu)選小于25%的變化的序列或其片段構成。[9]根據(jù)[8]所述的β -半乳糖苷酶基因，其中，所述變化為保守性氨基酸取代。[10] 一種β -半乳糖苷酶，由[7] [9]中任一項所述的β -半乳糖苷酶基因編碼。[11] 一種重組載體，其含有[7] [9]中任一項所述的β-半乳糖苷酶基因。[12]根據(jù)[11]所述的重組載體，其為表達載體。[13] 一種轉(zhuǎn)化體，其導入有[7] [9]中任一項所述的β -半乳糖苷酶基因。[14] 一種轉(zhuǎn)化體，其導入有[11]或[12]所述的重組載體。[15]根據(jù)[1 或[14]所述的轉(zhuǎn)化體，其為細菌細胞、酵母細胞或真菌細胞。[16] 一種β-半乳糖苷酶的制造方法，其包括以下步驟⑴和(2)(1)將[13] [15]中任一項所述的轉(zhuǎn)化體在能產(chǎn)生由所述半乳糖苷酶基因編碼的蛋白質(zhì)的條件下進行培養(yǎng)的步驟；(2)將產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)進行回收的步驟。[17] 一種酶劑，將[1] [6]和[10]中任一項所述的β _半乳糖苷酶作為有效成分。[18]根據(jù)[17]所述的酶劑，其中，所述有效成分是選自含有序列號7的氨基酸序列的半乳糖苷酶、含有序列號8的氨基酸序列的半乳糖苷酶、含有序列號9的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶和含有序列號10的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶中的一種以上的半乳糖苷酶。[19] 一種[1] [6]和[10]中任一項所述的β _半乳糖苷酶或者[17]或[18] 所述的酶劑的使用，用于制造選自低乳糖牛奶、作為腸內(nèi)雙歧桿菌生長因子的低聚半乳糖、 乳糖不耐受癥患者用藥品或補充劑中的制品。[20]使用[1] [6]和[10]中任一項所述的β-半乳糖苷酶或者[17]或[18] 所述的酶劑而得到的低乳糖牛奶、作為腸內(nèi)雙歧桿菌生長因子的低聚半乳糖、乳糖不耐受癥患者用藥品或補充劑。


圖1是來自環(huán)狀芽孢桿菌的β -半乳糖苷酶粗酶溶液的羥基磷灰石色譜的洗脫圖形。280nm的吸光度表示蛋白質(zhì)，420nm的吸光度表示用ONPG法測定的β -半乳糖苷酶活性。圖2是所得組分1 (參照圖1)的利用親和色譜法得到的洗脫圖形。280nm的吸光度表示蛋白質(zhì)濃度，420nm的吸光度表示用ONPG法測定的β-半乳糖苷酶活性。圖3是所得組分2 (參照圖1)的利用親和色譜法得到的洗脫圖形。280nm的吸光度表示蛋白質(zhì)濃度，420nm的吸光度表示用ONPG法測定的β-半乳糖苷酶活性。圖4是4種純化的β -半乳糖苷酶β -GalK泳道3)、β -Gal2 (泳道4)、3-Gal3(泳道5)和i3_Gal4(泳道6)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果。向泳道2提供粗酶粉末。左端表示使用的分子量標記(泳道1和7)的分子量。圖5是大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的細胞破碎物離心上清液的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果。泳道1為β-Gall、泳道2為3-Gal2、泳道3為3_Gal3、泳道4為β _Gal4。泳道 5和6是大腸桿菌載體轉(zhuǎn)化體的細胞破碎物的離心上清液。箭頭表示表達的半乳糖苷酶蛋白質(zhì)。左端表示使用的分子量標記(泳道Μ)的分子量。
具體實施例方式(用語)在本發(fā)明中，“編碼氨基酸序列的DNA”是指將其進行表達時可以得到具有該氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，即，具有與該氨基酸序列對應的堿基序列的DNA。因此還可以考慮密碼子的簡并。在本說明書中，用語“分離”可以與“純化”交換使用。對本發(fā)明的酶(β-半乳糖苷酶)使用時的“分離”是指當本發(fā)明的酶來自天然材料時，在該天然材料中實質(zhì)上不含有該酶以外的成分的(特別是實質(zhì)上不含有污染蛋白質(zhì))狀態(tài)。具體而言，例如在本發(fā)明的分離的酶中，污染蛋白質(zhì)的含量以重量換算計為總體的約小于20%、優(yōu)選約小于10%、進一步優(yōu)選約小于5%、更進一步優(yōu)選約小于1 %。另一方面，本發(fā)明的酶是利用基因工程方法制備的酶時，用語“分離”是指實質(zhì)上不含有來自所使用的宿主細胞的其它成分、培養(yǎng)液等的狀態(tài)。具體而言，例如在本發(fā)明的分離的酶中污染成分的含量以重量換算計為總體的約小于20%、優(yōu)選約小于10%、進一步優(yōu)選約小于5%、更進一步優(yōu)選約小于1%。應予說明，在沒有明確表示與其不同的意思的情況下，在本說明書中只是記載為“β-半乳糖苷酶” 時，意味著“分離狀態(tài)的半乳糖苷酶”。對于代替半乳糖苷酶而使用的用語“本酶” 也同樣。對DNA使用時的“分離”是指在原本天然存在的DNA的情況下，典型地從天然狀態(tài)下共存的其它核酸中分離的狀態(tài)。但是，可以含有天然狀態(tài)下鄰接的核酸序列(例如啟動子區(qū)域的序列、終止子序列等)等一部分其它核酸成分。例如對于基因組DNA的情況的“分離”狀態(tài)，優(yōu)選實質(zhì)上不含有天然狀態(tài)下共存的其它DNA成分。另一方面，對于利用cDNA分子等基因工程方法來制備的DNA的情況的“分離”狀態(tài)，優(yōu)選實質(zhì)上不含有細胞成分、培養(yǎng)液等。同樣地，對于利用化學合成制備的DNA的情況的“分離”狀態(tài)，優(yōu)選實質(zhì)上不含有dNTP 等前體(原材料)、合成過程中使用的化學物質(zhì)等。應予說明，在沒有明確表示與其不同的意思的情況下，在本說明書中只是記載為“DNA”時，意味著分離狀態(tài)的DNA。β -半乳糖苷酶一般顯示乳糖分解活性(作用于β -1，4鍵來分解乳糖的活性)和半乳糖基轉(zhuǎn)移活性(轉(zhuǎn)移半乳糖的活性)。因此，本發(fā)明中的“β_半乳糖苷酶活性”包括該兩種活性。乳糖分解活性可以利用實施例所示的乳糖法而測定。另外的半乳糖基轉(zhuǎn)移活性可以將利用實施例所示的ONPG法得到的活性值與利用該乳糖法得到的活性值的比作為指標來表示。已知[利用實施例所示的ONPG法得到的活性值/利用該乳糖法得到的活性值]的值越小，則轉(zhuǎn)移活性越高(非專利文獻1)。本發(fā)明中的“分子量”在沒有特別說明的情況下是指用SDS-PAGE (SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)測定的分子量。
(β-半乳糖苷酶)本發(fā)明的第1方式提供本發(fā)明人等在分離和賦予特征上取得成功的來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶。本發(fā)明的β-半乳糖苷酶在一個方式中，其分子量為195kDa(利用SDS-PAGE測得)。本發(fā)明人等在分離純化本β-半乳糖苷酶的過程中發(fā)現(xiàn)另外產(chǎn)生分子量為135kDa的β -半乳糖苷酶(β -Gal2)、86kDa的β -半乳糖苷酶(β -Gal3)和160kDa 的β -半乳糖苷酶(β "Gal4)(均利用SDS-PAGE測得)，并且發(fā)現(xiàn)這3種β -半乳糖苷酶均由一個基因派生。另一方面，確認了實際上缺失了一半以上C末端區(qū)域的基因表達具有活性的半乳糖苷酶。基于這些發(fā)現(xiàn)，作為本發(fā)明的另一方式，提供由上述半乳糖苷酶 (分子量為195kDa的來自環(huán)狀芽孢桿菌的半乳糖苷酶)的片段(以下稱為“本片段”) 構成的半乳糖苷酶。只要顯示半乳糖苷酶活性，則本片段的長度沒有特別的限定， 但含有作為基準的蛋白質(zhì)的例如5 98%、優(yōu)選為40 95%、最優(yōu)選為55 75%的蛋白質(zhì)。另外，優(yōu)選含有作為基準的蛋白質(zhì)的N末端區(qū)域。本片段的具體例是本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)的分子量為135kDa的β -半乳糖苷酶(β -Gal2)、86kDa的β -半乳糖苷酶(β -Gal3)和 160kDa的β -半乳糖苷酶(β -Gal4)。本片段也可以通過蛋白酶處理而得到。例如，通過將純化的上述β-半乳糖苷酶 (分子量為195kDa的來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶)提供給蛋白酶處理從而得到本片段。或者，也可以通過將含有上述半乳糖苷酶的環(huán)狀芽孢桿菌的培養(yǎng)液用蛋白酶處理從而得到本片段。使用的蛋白酶沒有特別的限制。例如，可以使用市售的蛋白酶劑、環(huán)狀芽孢桿菌產(chǎn)生的內(nèi)源性蛋白酶。本發(fā)明的β -半乳糖苷酶在一個方式中含有序列號7的氨基酸序列。該氨基酸序列是從序列號6的氨基酸序列中除去信號肽部分而得到的氨基酸序列。應予說明，序列號6 的氨基酸序列是從由環(huán)狀芽孢桿菌克隆得到的基因的堿基序列(序列號5)推定而得的氨基酸序列。具有序列號7的氨基酸序列的本發(fā)明的半乳糖苷酶從氨基酸數(shù)的不同和相同性低的程度(10 12%)來講，是與目前為止報告的3種來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶明顯不同的新型酶。本發(fā)明的另一方式是由序列號7的氨基酸序列的片段構成的半乳糖苷酶。在這里，片段優(yōu)選含有序列號7的氨基酸序列中從N末端至WSIGNEIY(序列號18)的區(qū)域。該部分序列(WSIGNEIY)是推定的活性區(qū)域。作為片段的具體例，可以舉出具有序列號8 10 中任一序列號的氨基酸序列的片段。序列號8的氨基酸序列對應fel2，序列號9的氨基酸序列對應Gal3，序列號10的氨基酸序列對應feil4。一般在某蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分實施修飾的情況下，有時修飾后的蛋白質(zhì)與修飾前的蛋白質(zhì)具有相同的功能。即，有時氨基酸序列的修飾對蛋白質(zhì)的功能不帶來實質(zhì)性的影響，蛋白質(zhì)的功能在修飾前后得以維持?？紤]到該技術常識，與本發(fā)明的半乳糖苷酶(由序列號7 10中的任一氨基酸序列構成)進行比較的情況下，雖然發(fā)現(xiàn)氨基酸序列的略微的不同但沒有發(fā)現(xiàn)在作為半乳糖苷酶的功能上的實質(zhì)性差異的酶可以看作與上述β-半乳糖苷酶實質(zhì)上相同的酶。這里的“氨基酸序列的略微的不同”是指代表性地通過構成氨基酸序列的1 數(shù)個(上限是例如3個、5個、7個、10個)的氨基酸的缺失、 取代、或1 數(shù)個(上限是例如3個、5個、7個、10個)的氨基酸的附加、插入、或它們的組合從而在氨基酸序列中發(fā)生變異(變化)的情況?！皩嵸|(zhì)上相同的酶”的氨基酸序列與作為基準的上述半乳糖苷酶的氨基酸序列的同一性(％)優(yōu)選為90%以上、更優(yōu)選為95% 以上、進一步優(yōu)選為98%以上、最優(yōu)選為99%以上。應予說明，氨基酸序列的不同也可以發(fā)生在多個位置?！鞍被嵝蛄械穆晕⒌牟煌眱?yōu)選由保守性氨基酸取代而產(chǎn)生。這里的“保守性氨基酸取代”是指將某一氨基酸殘基替換為具有相同性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸殘基。氨基酸殘基根據(jù)其側(cè)鏈而被分為堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、 谷氨酸)、非電荷極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支鏈側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、組氨酸)之類的幾個家族。保守性氨基酸取代優(yōu)選為同一家族內(nèi)的氨基酸殘基間的取代。在這里，二個氨基酸序列的同一性(％ )例如可以用以下的程序確定。首先，為了能夠進行最佳的比較，將二個序列進行排列(例如可以在第一序列中導入間隙(< W 1 )而使得與第二序列的對齊最佳化)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸殘基)與第二序列中對應的位置的分子相同時，可以說該位置的分子相同。序列同一性是該二個序列共通的同一位置的數(shù)目的函數(shù)(即，同一性(％)=同一位置的數(shù)/位置的總數(shù)X100)，優(yōu)選將對齊的最佳化所需的間隙的數(shù)目和尺寸也考慮進來。二個序列的比較和同一性的確定可以利用數(shù)學算法來實現(xiàn)。作為可以用于序列比較的數(shù)學算法的具體例，有記載于Karlin 和 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-68,并在 Karlin 和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-77中改良的算法，但不限于此。這樣的算法被合并到 Altschul 等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403-10 中記載的 NBLAST 程序和 XBLAST 程序(版本 2. 0)中。例如，在XBLAST程序中如果以score = 50、wordlength = 3進行BLAST多肽檢索，則可以得到同一性高的氨基酸序列。為了得到用于比較的間隙對齊，可以利用Altschul 等(1997) Amino Acids Research 25(17) :3389-3402 中記載的 Gapped BLAST。利用 BLAST 和Gapped BLAST時，可以使用對應的程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認參數(shù)。詳細的可以參照例如NCBI的網(wǎng)頁。作為可以用于序列比較的其它數(shù)學算法的例子，有Myers和 Miller (1988)Comput Appl Biosci. 4 :11-17中記載的算法。這樣的算法被合并到例如 GENESTREAM網(wǎng)絡服務器(IGH Montpellier，法國)或ISREC服務器中可使用的ALIGN程序中。在氨基酸序列的比較中利用ALIGN程序時，例如，可使用PAM120殘基質(zhì)量表，使間隙長罰分(￥ \ 7 長 f Hr ^ ) = 12、間隙罰分(￥ \ 7 《f A于4 ) = 4?？梢允褂?GCG軟件包的GAP程序，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，使間隙權重=12、10、8、6或 4、間隙長權重=2、3或4來確定二個氨基酸序列的同一性。(β-半乳糖苷酶基因)本發(fā)明的第2方式涉及半乳糖苷酶基因。在一個方式中本發(fā)明的基因含有編碼序列號6或7的氨基酸序列的DNA。該方式的具體例是由序列號5的堿基序列構成的 DNA。然而，一般在編碼某蛋白質(zhì)的DNA的一部分實施修飾的情況下，有時修飾后的DNA 所編碼的蛋白質(zhì)與修飾前的DNA所編碼的蛋白質(zhì)具有相同的功能。S卩，有時DNA序列的修飾對編碼的蛋白質(zhì)的功能沒有帶來實質(zhì)性的影響，編碼的蛋白質(zhì)的功能在修飾前后得以維持。因此，本發(fā)明作為其它方式提供具有與序列號5的堿基序列等價的堿基序列、編碼具有 β -半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的DNA(以下也稱為“等價DNA”)。這里的“等價的堿基序列” 是指與序列號5所示的核酸一部分不同、但其編碼的蛋白質(zhì)的功能(在這里為半乳糖苷酶活性)不會因該不同而受到實質(zhì)性影響的堿基序列。作為等價DNA的具體例，是在嚴格條件下對與序列號5的堿基序列互補的堿基序列進行雜交的DNA。這里的“嚴格條件”是指形成所謂的特異性雜交、不形成非特異性雜交的條件。這樣的嚴格條件是本領域技術人員公知的，可以參照例如Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring H arbor Laboratory Press, New York)、Current protocols in molecular biolog y (edited by Frederick M. Ausubel et al.，1987)來設定。作為嚴格條件，例如可以舉出以下條件使用雜交液(50%甲酰胺、10 XSSC (0. 15M NaCl，15mM檸檬酸鈉，ρΗ 7· 0)、5XDenhardt溶液、SDS、10%硫酸葡聚糖、10 μ g/ml的變性鮭魚精子DNA、 50mM磷酸緩沖液(pH7. 5))在約42°C 約50°C下進行溫育，然后使用0. 1XSSC、0. 1% SDS 在約65°C 約70°C中進行清洗。作為進一步優(yōu)選的嚴格條件，例如可以舉出如下條件作為雜交液使用50%甲酰胺、5XSSC(0. 15M NaCl，15mM檸檬酸鈉，ρΗ 7. 0)、1 XDenhardt溶液、305、10%硫酸葡聚糖、101^/1111的變性鮭魚精子DNA、50mM磷酸緩沖液(pH7. 5))。作為等價DNA的其它具體例，可以舉出由以序列號5所示的堿基序列為基準并包括1個或多個(優(yōu)選為1 數(shù)個)堿基的取代、缺失、插入、附加、或逆位的堿基序列構成且編碼具有半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。堿基的取代、缺失等可以發(fā)生在多個部位。這里的“多個”是指根據(jù)該DNA編碼的蛋白質(zhì)的立體結構中的氨基酸殘基的位置、種類而不同，例如2 40個堿基、優(yōu)選為2 20個堿基、更優(yōu)選為2 10個堿基。以上的等價DNA例如可以利用限制性內(nèi)切酶處理、核酸外切酶或DNA連接酶等的處理、定位突變導入法(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)或隨機突變導入法(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13， Cold Spring Harbor Laborat ory Press,New York)的變異導入等,通過修飾具有序列號 5所示的堿基序列的DNA使其包括堿基的取代、缺失、插入、附加和/或逆位從而得到。另外，也可以通過紫外線照射等其它方法而得到等價DNA。作為等價DNA的其它的例子，可以舉出將以SNP (單核苷酸多態(tài)性)為代表的多態(tài)性作為起因而發(fā)現(xiàn)如上述的堿基不同的DNA。在這里，如后述的實施例所示，由作為序列號7的氨基酸序列(Gall)的片段的序列號8 10的氨基酸序列構成的蛋白質(zhì)(Gal2、(ia13和顯示了高β -半乳糖苷酶活性?；谠撌聦?，本發(fā)明的一個方式提供編碼由在序列號7所示的氨基酸序列中發(fā)生小于 60%、優(yōu)選小于45%、進一步優(yōu)選小于25%的變化的序列或其片段構成的蛋白質(zhì)的β-半乳糖苷酶基因。本發(fā)明的基因可以通過參考本說明書或附加的序列表所示的序列信息，使用標準的基因工程方法、分子生物學方法、生物化學方法等而制備成分離的狀態(tài)。具體而言，可以由適當?shù)沫h(huán)狀芽孢桿菌的基因組DNA庫或eDNA庫、或者環(huán)狀芽孢桿菌的菌體內(nèi)提取液，適當使用對本發(fā)明的基因能特異性地進行雜交的寡聚核苷酸探針 引物而制備。寡聚核苷酸探針·引物可以利用市售的自動化DNA合成裝置等而容易地合成。應予說明，對于為了制備本發(fā)明的基因而使用的庫的制作方法，例如可以參照Molecular Cloning, Third Edition,
10Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York。例如，如果是具有序列號5的堿基序列的基因，則可以利用將該堿基序列或其互補序列的整體或一部分作為探針的雜交法來進行分離。另外，可以利用使用了設計成能夠?qū)υ搲A基序列的一部分特異性地進行雜交的合成寡聚核苷酸引物的核酸擴增反應(例如 PCR)來進行擴增和分離。另外，可以基于序列號6所示的氨基酸序列、序列號5的堿基序列的信息，通過化學合成而得到作為目標的基因(參考文獻Gene，60 (1)，115-127 (1987))。(重組載體)本發(fā)明的另一個方式涉及含有本發(fā)明的半乳糖苷酶基因的重組載體。在本說明書中用語“載體”是指能夠?qū)⒉迦肫渲械暮怂岱肿虞斔椭良毎劝袃?nèi)的核酸性分子，其種類、形態(tài)沒有特別的限定。因此，本發(fā)明的載體可以采取質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體、 病毒載體(腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、單純皰疹病毒載體等)的形態(tài)?？梢愿鶕?jù)使用目的(克隆、蛋白質(zhì)的表達)，另外考慮宿主細胞的種類來選擇適當?shù)妮d體。如果舉出載體的具體例子，有以大腸桿菌為宿主的載體(Μ13噬菌體或其修飾體、 λ噬菌體或其修飾體、pBR322或其修飾體(pB325、pAT153、pUC8等)等)、以酵母為宿主的載體(pY^^eCl、pMFa、pYES2等、以昆蟲細胞作為宿主的載體(pAc、pVL等)，以哺乳類細胞作為宿主的載體(pCDM8、pMT2PC等)等。本發(fā)明的重組載體優(yōu)選為表達載體。“表達載體”是指可以將插入其中的核酸導入目標細胞(宿主細胞)內(nèi)，并且能夠在該細胞內(nèi)表達的載體。表達載體通常含有對插入的核酸的表達所必要的啟動子序列、促進表達的增強子序列等。還可以使用含有選擇標記的表達載體。使用該表達載體時，可以利用選擇標記來確認表達載體導入的有無(及其程度)。本發(fā)明的基因向載體的插入、選擇標記基因的插入(必要時)、啟動子的插入 (必要時)等可以利用標準的重組DNA技術(例如可以參照Molecular Cloning, Third Edition, 1. 84, Cold Spring Harbor Laboratory PFess,New York，利用了限制性內(nèi)切酶禾口 DNA連接酶的公知方法)來進行。(轉(zhuǎn)化體)本發(fā)明進一步涉及導入有本發(fā)明的基因的宿主細胞(轉(zhuǎn)化體)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中，本發(fā)明的基因作為外來性的分子而存在。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體優(yōu)選通過使用了上述本發(fā)明的載體的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化而制備。轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化可以通過磷酸鈣共沉淀法、電穿孔(Potter， H. et al. , Proc. Natl. Aca d. Sci. U. S. Α. 81，7161-7165 (1984))、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(Feigner, P.L.et al. , Pro c. Natl. Acad. ki. U. S. A. 84，7413-7417 (1984))、顯微注射(Graessman η, Μ. &Graessmann, Α. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 73, 366-370 (1976))、Hanahan 方法 (Hanahan, D.，J. Mol. Biol. 166，557-580 (1983))、乙酸鋰法(Schiestl, R. H. et al. , Curr. Genet. 16，339-346 (1989))、原生質(zhì)體-聚乙二醇法(Yelton, M. M. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. 81，1470-1474(1984))等來實施。宿主細胞只要是能夠表達本發(fā)明的半乳糖苷酶，就沒有特別的限定，例如可以從枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌(Bacillus likemiformis)、環(huán)狀芽孢桿菌等芽孢桿菌屬細菌，乳球菌、乳酸菌、鏈球菌、明串珠菌、雙歧桿菌等乳酸菌，大腸桿菌、鏈霉菌等其它細菌、酵母菌、克魯維酵母、念珠菌、圓酵母(Torula)、球似酵母等酵母，米曲霉、黑曲霉等曲霉菌屬、青霉菌屬、木霉菌屬、鐮刀菌屬等絲狀真菌(真菌)等中進行選擇。( β -半乳糖苷酶的制造方法)本發(fā)明的另一個方式提供半乳糖苷酶的制造方法。本發(fā)明的制造方法的一個方式中，利用上述轉(zhuǎn)化體制造半乳糖苷酶。在該方式的制造方法中，首先，在能產(chǎn)生由導入到其中的基因編碼的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體(步驟(1))。關于各種載體宿主系的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)條件是公知的，只要是本領域技術人員就能夠容易地設定適合的培養(yǎng)條件。培養(yǎng)法和培養(yǎng)條件只要是能夠產(chǎn)生作為目標蛋白質(zhì)的β -半乳糖苷酶的培養(yǎng)法和培養(yǎng)條件，就沒有特別的限定。即，將產(chǎn)生半乳糖苷酶作為條件，可以適當設定適合所使用的微生物的培養(yǎng)的方法、培養(yǎng)條件。作為培養(yǎng)法，液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)均可，優(yōu)選利用液體培養(yǎng)。以液體培養(yǎng)為例子，說明其培養(yǎng)條件。作為培養(yǎng)基，只要是所使用的轉(zhuǎn)化體能夠進行生長的培養(yǎng)基，就可以是任意培養(yǎng)基。例如，可以使用添加有葡萄糖、蔗糖、龍膽二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有機酸等碳源、進而硫酸銨、碳酸銨、磷酸銨、乙酸銨、或者蛋白胨、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、糠、肉提取物等氮源、進而鉀鹽、鎂鹽、鈉鹽、磷酸鹽、錳鹽、鐵鹽、鋅鹽等無機鹽的培養(yǎng)基。為了促進所使用的轉(zhuǎn)化體的生長，還可以在培養(yǎng)基中添加維生素、氨基酸等。在有氧條件下培養(yǎng)，條件為培養(yǎng)基的PH調(diào)節(jié)到例如約3 10、優(yōu)選為約7 8左右，培養(yǎng)溫度通常為約10 50°C、優(yōu)選為約20 37°C左右，1 7天、優(yōu)選3 4天左右。作為培養(yǎng)法，可以采用例如振蕩培養(yǎng)法、利用發(fā)酵罐的有氧深部培養(yǎng)法。培養(yǎng)步驟之后，回收產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(β_半乳糖苷酶)(步驟O))。從培養(yǎng)液中進行回收時，例如通過將培養(yǎng)上清液進行過濾、離心處理等而除去不溶物后，通過將利用超濾膜的濃縮、硫酸銨沉淀等鹽析、透析、離子交換樹脂等各種色譜等適當組合來進行分離、純化，從而可以得到本酶。另外，從菌體內(nèi)進行回收時，例如可以通過采用加壓處理、超聲波處理等將菌體進行破碎后，與上述同樣地進行分離、純化從而得到目標蛋白質(zhì)。應予說明，也可以通過過濾、離心處理等預先從培養(yǎng)液中回收菌體后，進行上述一系列的工序(菌體的破碎、分離、純化)。β -半乳糖苷酶的純化度沒有特別的限定。另外，最終形態(tài)可以是液體狀，也可以是固體狀(包括粉末狀)。(酶劑)本發(fā)明的半乳糖苷酶例如可以酶劑的方式提供。酶劑除了有效成分(本發(fā)明的半乳糖苷酶)以外，還可以含有賦形劑、緩沖劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、保存劑、防腐劑、生理鹽水等。作為賦形劑，可以使用乳糖、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作為緩沖劑，可以使用磷酸鹽、枸櫞酸鹽、乙酸鹽等。作為穩(wěn)定劑，可以使用丙二醇、抗壞血酸等。作為保存劑， 可以使用苯酚、苯扎氯銨、芐醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯等。作為防腐劑，可以使用苯扎氯銨、對羥基苯甲酸、氯丁醇等。在本發(fā)明的酶劑的一個方式中，作為有效成分，可以使用選自含有序列號7的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶、含有序列號8的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶、含有序列號9 所示的氨基酸序列的半乳糖苷酶和含有序列號10所示的氨基酸序列的半乳糖苷酶中的一種以上的半乳糖苷酶。作為一個方式，可以提供全部含有這4種β-半乳糖苷酶的酶劑。(β-半乳糖苷酶的用途)本發(fā)明的另一個方式提供本發(fā)明的半乳糖苷酶或酶劑的用途。用途的例子是低乳糖牛奶的制造、作為腸內(nèi)雙歧桿菌生長因子的低聚半乳糖的制造、或者乳糖不耐受癥患者用的藥品、補充劑的制造。可以通過使用本發(fā)明的半乳糖苷酶或酶劑來降低原材料中的乳糖。例如，通過相對于ImL生牛奶添加IU的β -半乳糖苷酶，在10°C的低溫下放置從而使乳糖分解，可得到低乳糖牛奶。在低聚半乳糖的制造中，例如，在預先加熱溶解的 40%乳糖液(pH 7.0)中加入100LU的β -半乳糖苷酶，在40°C中放置5小時，從而生成低聚半乳糖。應予說明，低聚半乳糖由fell-(Gal)n-Glc (η通常為0 幻表示(Gal 半乳糖殘基、Glc 葡萄糖殘基)。結合方式除了 β 1-6、β 1-3、β 1-4、β 1-2以外，還有α 1-3、α 1-6寸。實施例1.來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶的純化(a) β -半乳糖苷酶活性測定法在以下的純化中，β -半乳糖苷酶活性測定是以將2-硝基苯基β -D-吡喃半乳糖苷(ONPG)作為底物的方法⑴和將乳糖作為底物的方法(ii)這2種進行測定。均是根據(jù)非專利文獻1記載的方法實施。另外，蛋白質(zhì)濃度是以^Onm的吸光度表示。i) ONPG 法將含有0. 245% ONPG的IOOmM磷酸緩沖液(pH 6. 0) 1. 98ml在40°C預熱10分鐘。 向其中添加20 μ 1樣品，在40°C反應10分鐘后，加入10%碳酸鈉溶液2. Oml，停止反應。測定反應液在420nm處的吸光度，將每1分鐘生成1 μ mol的2-硝基苯酚時的活性作為IU而算出半乳糖苷酶活性。ii)乳糖法將含有5%乳糖的IOOmM磷酸緩沖液(pH 6. 0) 2ml在40°C預熱10分鐘。向其中添加50 μ 1樣品，在40°C反應15分鐘后，在沸騰浴中煮沸，停止反應。對100 μ 1反應液用糖原穩(wěn)定法測定葡萄糖濃度。即，在反應液100 μ 1中加入0. IN氫氧化鈉溶液100 μ 1放置1分鐘，接著添加0. IN乙酸、3ml的乙酸緩沖液(pH 5. 0)。在該溶液中添加葡萄糖氧化酶液(小野藥品工業(yè)公司)500 μ 1，測定在550nm處的吸光度的增加速度，將每1分鐘生成 Iumol的葡萄糖時的活性作為IU而算出乳糖分解活性。(b) β -半乳糖苷酶的粗酶粉末的制備將環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans) ATCC31382接種于含有3. 0 %大豆胨、 2. 5%肉提取物、1. 0%酵母提取物、0. 5%乳糖的液體培養(yǎng)基，在30°C振蕩培養(yǎng)3天。將通過離心分離除去菌體而得到的培養(yǎng)上清液提供到超濾膜(AIP-1013D，旭化成公司制)而濃縮 5倍。將得到的濃縮液噴霧干燥，得到了半乳糖苷酶的粗酶粉末。(c) β -半乳糖苷酶的純化將在IOmM磷酸鈉緩沖液(pH 6. 0)中以5. 0%的濃度溶解有所得粗酶粉末的溶液 50ml提供到已用該緩沖液平衡化的羥基磷灰石凝膠柱(CHTTM Ceramic hydroxyapataite, BIO-RAD公司制，內(nèi)徑2. 5cm、長度25cm)上，用IOmM磷酸鈉緩沖液(pH 6. 0)洗脫未吸附蛋白質(zhì)。然后，利用使磷酸鈉緩沖液濃度以100mM、150mM、200mM、300mM和500mM依次變化的分步洗脫法洗脫酶。本色譜在室溫下進行。如圖1所示，在磷酸鈉緩沖液濃度為100mM、 150mM、300-500mM時，洗脫了顯示β-半乳糖苷酶(ONPG)活性的酶，將各個組分依次設為組分1、2、3。組分3含有的酶在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定中是分子量為195kDa的近乎單一的蛋白質(zhì)，稱為β-Gall。接著，將組分1利用親和色譜法進行分離純化。首先，將組分1對50mM乙酸緩沖液(PH 5.8)進行透析。使透析的酶液經(jīng)過已用該緩沖液平衡化的親和凝膠柱(對氨基苯基-1-硫代-β -D-吡喃半乳糖苷-瓊脂(p-Aminobenzyl-1-thio- β -D-galactopyranosi de-agarose)，Sigma公司制，直徑1. 6cm，長度18cm)，用該緩沖液洗脫未吸附蛋白質(zhì)后，在 4°C用使pH從5. 8變化到3. 5的線性梯度法(50mM乙酸緩沖液(pH 5. 8)/50mM乙酸緩沖液， (pH 3. 5))洗脫。如組分1所示，在清洗組分和在pH 4. 4前后分別洗脫出具有β _半乳糖苷酶活性的酶。它們在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯示了近乎單一的條帶，分子量分別為 135kDa、86kDa。前者稱為 3_Gal2，后者稱為 β -Gal3 另一方面，將組分2與組分1同樣地利用親和色譜法進行分離純化。將組分2相對于50mM乙酸緩沖液(pH 5.8)進行透析，并提供到已用該緩沖液進行平衡化的上述親和柱上。與圖2的情況相同，在用該緩沖液洗脫未吸附蛋白質(zhì)后，在4°C用使pH從5. 8變化到3. 5 的線性梯度法進行洗脫。如圖3所示，在清洗組分和在pH 4.4前后分別洗脫出具有β-半乳糖苷酶活性的酶。它們在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯示近乎單一的條帶，分子量分別為86kDa、160kDa。前者與β -Gal3相同，后者稱為β _Gal4。圖4中表示了粗酶標準品 (泳道2)與純化的β -GalK泳道3)、β -Gal2 (泳道4)、β -Gal3 (泳道5)和β -Ga 14 (泳道6)的10% SDS-PAGE的解析結果。2.來自環(huán)狀芽孢桿菌的純化β-半乳糖苷酶的各種性質(zhì)研究純化的4種β -半乳糖苷酶的主要性質(zhì)。(a)比活度的測定在40°C、IOOmM磷酸緩沖液pH 6中測定使用了 ONPG (終濃度0. )和乳糖(終濃度4. 88%)作為底物時的活性。將結果示于表1。應予說明，使用了 ONPG作為底物的情況下，將在40°C、pH6的條件下1分鐘生成1 μ mol產(chǎn)物硝基苯酚的酶量定義為IU ；使用了乳糖作為底物的情況下，將在40°C、pH6的條件下1分鐘生成1 μ mol產(chǎn)物葡萄糖的酶量定義為1U。如表1所示，可知與對乳糖的分解活性相比，對ONPG的分解活性為β-Gall高， β -Gal2, β -Gal3 禾口 β _Gal4 低。[表1]
酶粗酶β-Gallp-Gal2p-Gal3β-GaW(U/mg)(U/mg)(U/mg)( /mg)(U/mg)比活度16.050.013.417. 610.9(底物；0NPG)比活度35.446.562.072. 645.0(底物；乳糖)分子量-189. 283 kDa134.788 kDa91.027 kDa153.932 kDa(SDS-PAGE)(195 kDa)(135 kDa)(86 kDa)(160 kDa)N末端-GNSVSYDGERRVNFNEN同左同左同左氨基酸序列(SVSYDGERRVNFNEN)
14
(b)分子量的確定利用基質(zhì)輔助激光解吸/ 電離(Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionization, MALDI)分析計求出4種β-半乳糖苷酶的分子量。樣品使用了 0. 1 μ 1 IOmg/ ml 芥子酸/0. 1μ 1 0. 7-3mg/ml 酶溶液的混合溶液。結果，β -Gall 為 189. 283kDa、β -Gal2 為 134. 788kDa、β -Gal3 為 91. 027kDa、β -Gal4 為 153. 932kDa (表 1)。另外，將用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳求出的分子量(圖4)示于表1的括號內(nèi)。利用質(zhì)量分析計求得的分子量對于任何酶均顯示了與由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳求出的分子量近似的結果。(C) N末端氨基酸序列的確定利用蛋白質(zhì)序列分析儀進行4種β-半乳糖苷酶的N末端氨基酸序列的解析。其結果，明確了 β -Gall中含有2種序列GNSVSYDGERRVNFNEN(序列號1)和 SVSYDGERRVNFNEN(序列號17)。但是，可知這2種序列是在N末端有無GN方面的不同，基本上是相同序列。另外0-Gal2、β-Gal3, β _Gal4的N末端氨基酸序列也與β-Gall相同。(d)內(nèi)部氨基酸序列的確定接著，將β -GalU β -Gal2, β -Gal3的純化酶制備成1 ang/ml，向其中加入胰蛋白酶(0.5mg/ml)，在37°C中進行溫育。48小時后提供到8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中。從任意酶中均檢測出了 70kDa的條帶。將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)印到硝基纖維素膜上，用考馬斯亮藍進行染色。從染色的條帶中切出來自各酶的70kDa的條帶，用蛋白質(zhì)序列分析儀解析氨基酸序列。結果，來自各酶的70kDa蛋白質(zhì)的N末端5殘基的序列一致。另外，來自 β -Gal3的70kDa蛋白質(zhì)的N末端15殘基的氨基酸序列為EDRADVNIKTKISND (序列號2)。3.編碼來自環(huán)狀芽孢桿菌的半乳糖苷酶的基因片段的獲取(a)染色體DNA的分離利用齊藤 三浦(非專利文獻幻的方法由環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus c irculans) ATCC31382的菌體制備染色體DNA。(b)利用PCR進行DNA探針的制作基于2.中確定的N末端氨基酸序列和內(nèi)部氨基酸序列合成2種寡聚核苷酸(序列號3、4)而作為PCR引物。使用這些引物，以環(huán)狀芽孢桿菌的染色體DNA作為模板，在以下的條件下進行PCR反應。<PCR 反應液〉10 X PCR 反應緩沖液(TaKaRa 公司)5. 0 μ 1
dNTP 混合液(各 2. 5mM, TaKaRa 公司)8. 0 μ 125mM MgCl25. 0 μ 150μΜ 正義引物 0. 5μ 150μΜ 反義引物 0. 5μ 1蒸餾水四.5μ1染色體DNA 溶液(100 μ g/ml) 1· 0 μ 1LA Taq DNA 聚合酶(TaKaRa 公司)0· 5 μ 1<PCR反應條件〉步驟1 變性(95 °C、5分鐘)1循環(huán)
步驟2 變性(95 °C、1分鐘)30循環(huán)退火(52°C、1分鐘)延伸(72°C、1分鐘)步驟3 延伸(720C UO分鐘)1循環(huán)將得到的約0. 6kb的DNA片段克隆到pGEM-Teasy (Promega公司)后，確認堿基序列，結果在緊鄰正義引物之后和緊鄰反義引物之前發(fā)現(xiàn)了編碼上述部分氨基酸序列的堿基序列。將本DNA片段作為用于全長基因克隆的DNA探針。(c)基因庫的制作環(huán)狀芽孢桿菌的染色體DNA的Southern雜交解析的結果，在SpeI分解物中確認了與探針DNA進行雜交的約8. 21Λ的單條帶。為了克隆該約8. 21Λ的SpeI DNA片段，如下制作基因庫。進行上述(a)制備的染色體DNA的SpeI處理。將50 μ g的染色體DNA、40 μ 1 的10 XM緩沖液、342. 0μ 1的蒸餾水和8. 0μ 1的SpeI混合，在37°C中處理15小時。將得到的分解物連接到SpeI處理的pBluescript II KS+載體(Stratagene公司)上，得到了基因庫。(d)基因庫的篩選利用DIG-High Prime (Roche公司)將上述(b)得到的0. 6kb的DNA片段進行標記。將其作為DNA探針，將(c)中得到的基因庫通過菌落雜交而進行篩選。由得到的陽性菌落得到了質(zhì)粒pBlue-Gall。(e)堿基序列的確定根據(jù)通常方法確定質(zhì)粒pBlue-Gall的堿基序列。將編碼來自環(huán)狀芽孢桿菌的 β -半乳糖苷酶的堿基序列(5214bp)示于序列號5。另外，將被序列號5編碼的氨基酸序列(1738氨基酸)示于序列號6。該氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了 2.中確定的N末端區(qū)域氨基酸序列(序列號1)和內(nèi)部氨基酸序列(序列號2)。認為很有意味的是，本基因中的起始密碼子為GTG。應予說明，將從序列號6的氨基酸序列中除去信號肽的氨基酸序列示于序列號7。4.來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶β-Gall、β-Gal 2, β _Gal4在大腸桿菌中的表達(a) β -半乳糖苷酶在大腸桿菌中的表達質(zhì)粒的構建由于與分子量 189. 3kDa、134. 8kDa、153. 9kDa(質(zhì)量分析的值)的 β -Gall、 β -Gal2, β _Gal4相應的蛋白質(zhì)的N末端區(qū)域氨基酸序列共通，因而基于編碼其的DNA序列而合成了 1種寡聚核苷酸F-Gal(序列號11)。另外，基于編碼各自推定的C末端區(qū)域氨基酸序列的DNA序列而合成3種寡聚核苷酸R-Gall、R-Gal2、R-Gal4 (序列號12、13、14)，并作為PCR引物。在正義引物F-Gal中附加McI限制性內(nèi)切酶識別部位，在反義引物R_Gall、 R-Gal2、R-Gal4中附加MlI限制性內(nèi)切酶識別部位。將這些引物和作為模板的具有β _半乳糖苷酶基因的染色體DNA，用以下的條件進行PCR反應。<PCR 反應液〉10XPCR 反應緩沖液(Τ0Υ0Β0 公司)5. 0 μ 1dNTP 混合液(各 2. 5mM、Τ0Υ0Β0 公司)5. 0 μ 110μΜ 正義引物 1. 5μ 110μΜ 反義引物 1. 5μ 1
25mM MgS042. 0 μ 1蒸餾水33. Ομ 染色體DNA 溶液(200 μ g/ml) 1· O μ 1KOD-Plus-DNA 聚合酶(T0Y0B0 公司)1. 0 μ 1<PCR反應條件〉步驟1 變性(94 °C、2分鐘)1循環(huán)步驟2 變性(94 °C、15秒)30循環(huán)退火(57°C、30秒)延伸(68°C、5 分鐘)用電泳確認得到的PCR產(chǎn)物后，利用乙醇沉淀進行脫鹽(69 μ 1)。接著，加入15 μ 1 的10ΧΤ緩沖液、10 μ 1的0. BSA溶液和SacI3y 1與SalI3 μ 1，在37°C中酶處理15 小時。用電泳確認限制性內(nèi)切酶處理液，用NucleoSpin Extract II (Nippon Genetics公司)純化后，在預先經(jīng)Mel和Mil處理的載體pCold II DNA(Takara Bio公司)上連接 β-Gall、β-Gal2, β _Gal4 片段，得到了表達質(zhì)粒 pCold-Gall、Gal2、Gal4。(b) β -半乳糖苷酶在大腸桿菌中的表達將表達質(zhì)粒pCold-Gall、Gal2、Gal4 導入大腸桿菌 BL21Competent Cells (Takara Bio公司)中。從作為氨芐青霉素耐藥菌株而得到的轉(zhuǎn)化體中利用菌落PCR選擇保有了插入有目標β-半乳糖苷酶基因的pC0ld-Gall、Ga12、(}a14的菌株。另外，還得到了作為對照而具有表達載體pCold II DNA的大腸桿菌BL21的轉(zhuǎn)化體。將這些轉(zhuǎn)化體接種于含有 100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基Iml中，在37°C以170rpm培養(yǎng)，直至達到0. D600 = 0. 4-1. 0 (預培養(yǎng))。接著，將預培養(yǎng)液300 μ 1接種于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基9ml中，在37°C以170rpm培養(yǎng)，直至達到0.D600 = 0.4-1.0。在15°C放置30分鐘后，添力卩9 μ 1的0. IM IPTG，在15°C以160rpm培養(yǎng)M小時(本培養(yǎng))，進行集菌。將菌體懸浮于1. Oml的IOOmM磷酸緩沖液(pH 6. 0)中，加入Φ0. Imm的玻璃珠0. 50g，利用Multi Beads Siocker (安井機械公司)破碎菌體。破碎條件是將ON 120秒、OFF 60秒重復3. 75 循環(huán)。將得到的無細胞提取物(Cell free-extract)供給于離心分離，得到了可溶性成分。(c) β -半乳糖苷酶的表達確認將獲取的可溶性成分提供到SDS-PAGE。作為電泳裝置使用PhastSystem (GE Healthcare 公司)，作為分離凝膠使用 PhastGel Homogeneous 7. 5 (GE Healthcare 公司)。其結果，如圖5所示，pCoId-Gall中在189kDa附近、pCoId-Gal2中在135kDa附近、 pCold-Gal4中在IMkDa附近分別確認了認為是β -GalU β -Gal2, β -Gal4的有意義的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。作為對照的pCold II DNA中沒有確認同樣的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，因此認為本蛋白質(zhì)是分別導入β-半乳糖苷酶基因β-Gall、β-Gal 2, i3_Gal4帶來的結果。另外，對于相同樣品，測定將ONPG和乳糖作為底物的半乳糖苷酶活性。將活性測定結果示于表2。[表2]
權利要求
1.一種來自環(huán)狀芽孢桿菌的半乳糖苷酶，其利用SDS-PAGE測得的分子量為 195kDa。
2.一種來自環(huán)狀芽孢桿菌的半乳糖苷酶，其由權利要求1所述的半乳糖苷酶的片段構成。
3.—種β -半乳糖苷酶，由序列號7的氨基酸序列、或顯示β -半乳糖苷酶活性的其片段構成。
4.根據(jù)權利要求3所述的β-半乳糖苷酶，其中，所述片段含有序列號7的氨基酸序列中從N末端到WSIGNEIY即序列號18的區(qū)域。
5.根據(jù)權利要求3所述的β-半乳糖苷酶，其中，所述片段含有序列號8 10的任一序列號的氨基酸序列。
6.根據(jù)權利要求3所述的β-半乳糖苷酶，其中，由含有序列號5的序列的DNA進行編碼。
7.—種β-半乳糖苷酶基因，其由選自以下(a) (e)中的任一 DNA構成(a)編碼序列號6或7的氨基酸序列的DNA；(b)含有序列號5的序列的DNA；(c)在嚴格條件下對與序列號5的序列互補的序列進行雜交的DNA；(d)作為序列號5的序列的DNA序列簡并體的DNA；(e)由以序列號5的序列為基準并含有1個或多個堿基的取代、缺失、插入、附加或逆位的序列構成的且編碼具有β -半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
8.根據(jù)權利要求7所述的β-半乳糖苷酶基因，其中，具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)由序列號7的氨基酸序列中發(fā)生小于60%、優(yōu)選為小于45%、進一步優(yōu)選為小于25%的變化的序列或其片段構成。
9.根據(jù)權利要求8所述的半乳糖苷酶基因，其中，所述變化為保守性氨基酸取代。
10.一種β -半乳糖苷酶，由權利要求7 9中任一項所述的β -半乳糖苷酶基因編碼。
11.一種重組載體，其含有權利要求7 9中任一項所述的半乳糖苷酶基因。
12.根據(jù)權利要求11所述的重組載體，其為表達載體。
13.一種轉(zhuǎn)化體，其導入有權利要求7 9中任一項所述的半乳糖苷酶基因。
14.一種轉(zhuǎn)化體，其導入有權利要求11或12所述的重組載體。
15.根據(jù)權利要求13或14所述的轉(zhuǎn)化體，其為細菌細胞、酵母細胞或真菌細胞。
16.一種半乳糖苷酶的制造方法，其包括以下步驟(1)和O)(1)將權利要求13 15中任一項所述的轉(zhuǎn)化體在能產(chǎn)生由所述β-半乳糖苷酶基因編碼的蛋白質(zhì)的條件下進行培養(yǎng)的步驟；(2)將產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)進行回收的步驟。
17.一種酶劑，將權利要求1 6和10中任一項所述的β-半乳糖苷酶作為有效成分。
18.根據(jù)權利要求17所述的酶劑，其中，所述有效成分是選自含有序列號7的氨基酸序列的β -半乳糖苷酶、含有序列號8的氨基酸序列的β -半乳糖苷酶、含有序列號9的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶和含有序列號10的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶中的一種以上的半乳糖苷酶。
19.一種權利要求1 6和10中任一項所述的β -半乳糖苷酶或者權利要求17或18 所述的酶劑的使用，用于制造選自低乳糖牛奶、作為腸內(nèi)雙歧桿菌生長因子的低聚半乳糖、 乳糖不耐受癥患者用藥品或補充劑中的制品。
20.低乳糖牛奶、作為腸內(nèi)雙歧桿菌生長因子的低聚半乳糖、乳糖不耐受癥患者用藥品或補充劑，其使用權利要求1 6和10中任一項所述的β -半乳糖苷酶或者權利要求17 或18所述的酶劑而得到。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供新型β-半乳糖苷酶。提供來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶及其基因。本發(fā)明的β-半乳糖苷酶可以用于牛奶、乳制品、發(fā)酵乳制品、低聚半乳糖或膳食補充劑的制造等。
文檔編號C12N9/38GK102449148SQ20108002394
公開日2012年5月9日 申請日期2010年4月23日 優(yōu)先權日2009年6月5日
發(fā)明者中西一弘, 山口莊太郎, 星由紀子, 片瀨徹, 箕田正史, 長屋美穗 申請人:天野酶株式會社