專(zhuān)利名稱(chēng):寡核苷酸功能化的納米顆粒的遞送的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)產(chǎn)生的寡核苷酸修飾的納米顆粒(ON-NP)和方法。本發(fā)明還涉及遞送寡核苷酸功能化的納米顆粒的組合物和方法。
背景技術(shù):
將遺傳物質(zhì)引入細(xì)胞和組織以控制基因表達(dá)已深遠(yuǎn)地影響了牽涉基因途徑和功能的研究,并且為治療應(yīng)用提供了希望。遺傳水平方法具有大部分藥物所不可獲得的固有特異性。siRNA大有希望成為潛在治療工具并且目前正處于臨床試驗(yàn)中,其靶向廣泛的臨床問(wèn)題,包括癌癥?;虺聊哂斜刃》肿右种苿└叩枚嗟母咝?xún)r(jià)比,并且導(dǎo)致以比所述小分子抑制劑更高的潛在特異性下調(diào)蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能。特別地,siRNA治療可靶向基因的單點(diǎn)突變,而小分子療法迄今為止不能精確地區(qū)分突變體與正?;虍a(chǎn)物。鑒于通過(guò)熱點(diǎn)突變的鑒定、直接的基因測(cè)序或?qū)驍U(kuò)增的測(cè)定確定每一種黑素瘤的特定基因改變的能力,因此可為每一種黑素瘤賦予特定的遺傳標(biāo)簽。雖然siRNA可被許多細(xì)胞攝入,但只有具有突變的基因或激活的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的細(xì)胞才被靶向基因療法影響,從而允許使在黑素瘤中發(fā)信號(hào)的途徑正?;粫?huì)不利地影響正常細(xì)胞。與許多蛋白質(zhì)的遞送一樣,核酸在胃腸道中的降解和較低的生物利用度是siRNA 的口服遞送的主要障礙。即使對(duì)于靜脈內(nèi)遞送,常規(guī)siRNA被血清因子快速降解,從而不能到達(dá)其靶。核酸的局部施用為抑制損傷皮膚中的基因(例如但不限于,治療皮膚中的轉(zhuǎn)移灶)和經(jīng)皮膚遞送至內(nèi)靶提供了巨大的治療有利方面。施用是無(wú)痛的并且容易控制,并且皮膚是高度可進(jìn)入的。表皮中的有效物理障礙主要位于表皮的最外面區(qū)域-角質(zhì)層,其次位于更深處的表皮。該表皮屏障阻止大量水分丟失(由內(nèi)向外)和防止環(huán)境物質(zhì)(包括核酸)的進(jìn)入(由外向內(nèi))。機(jī)械方法例如超聲、激光和注射已被用來(lái)促進(jìn)穿過(guò)小鼠角質(zhì)層并且驅(qū)動(dòng)siRNA進(jìn)入皮膚,但需要專(zhuān)門(mén)設(shè)備,限制了遞送的區(qū)域并且潛在地?fù)p害皮膚。這些挑戰(zhàn)強(qiáng)調(diào)對(duì)用于遞送抑制核酸的容易施用的經(jīng)皮系統(tǒng)的需要,該經(jīng)皮系統(tǒng)能夠穿過(guò)角質(zhì)層。皮膚病的直接靶向是基因抑制療法的理想模型。然而,體外抑制基因的商購(gòu)可得的材料僅獲得微小成功,至多,將遺傳物質(zhì)遞送進(jìn)入原代培養(yǎng)細(xì)胞例如角質(zhì)細(xì)胞(KC)和黑素細(xì)胞。此外,皮膚的外層用作常規(guī)阻止核酸和蛋白質(zhì)滲入皮膚并且從真皮進(jìn)入循環(huán)的解剖學(xué)屏障[Prausnitz等人,Nat Biotechnol26 :1261-1268 (2008) ] 因此,穿過(guò)該層以轉(zhuǎn)移足量的寡核苷酸一直以來(lái)是個(gè)挑戰(zhàn)。皮膚是身體的最大器官,包括3層表皮、真皮和皮下組織。表皮是皮膚的最外層。 表皮的厚度在不同類(lèi)型的皮膚中可變化。眼瞼上的皮膚最薄為0. 05mm,掌和足底上的皮膚最厚,為1.5mm。表皮包括4個(gè)主要的分化逐漸加大的細(xì)胞層。從底層至頂層被稱(chēng)為·基底層·棘皮層·顆粒層·角質(zhì)層底層基底層具有形狀如圓柱的細(xì)胞。在該層中,細(xì)胞分裂并且將已形成的細(xì)胞推入更高層。當(dāng)細(xì)胞遷入更高層時(shí),它們變平,變得更成熟并且最終“死亡”,以及脫落。表皮的最頂層角質(zhì)層由會(huì)脫落的扁平皮膚細(xì)胞組成;其花費(fèi)約4周的時(shí)間從基底層的細(xì)胞到達(dá)角質(zhì)層并且隨后脫落。
發(fā)明內(nèi)容
本公開(kāi)內(nèi)容提供了用于遞送寡核苷酸功能化的納米顆粒的組合物和方法。在某些實(shí)施方案中,本公開(kāi)內(nèi)容提供了包含寡核苷酸功能化的納米顆粒(ON-NP) 和皮膚媒介物的皮膚組合物。本公開(kāi)內(nèi)容還提供了皮膚遞送寡核苷酸功能化的納米顆粒的方法,其包括給有此需要的患者的皮膚施用包含寡核苷酸功能化的納米顆粒和皮膚媒介物的組合物的步驟。在一個(gè)方面,寡核苷酸功能化的納米顆粒的遞送是經(jīng)皮膚的。在另一個(gè)方面,寡核苷酸功能化的納米顆粒的遞送是局部的。在另一個(gè)方面,寡核苷酸功能化的納米顆粒的遞送是局部施用后至表皮和真皮的遞送。在某些實(shí)施方案中,表皮媒介物包含軟膏。在某些方面,軟膏是阿夸福 (Aquaphor)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,提供了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法,其包括步驟在其中寡核苷酸功能化的納米顆粒與靶雜交并且調(diào)節(jié)基因表達(dá)的條件下給皮膚施用治療有效量的包含寡核苷酸功能化的納米顆粒的組合物。在某些方面,靶是多核苷酸。在相關(guān)方面,多核苷酸是RNA。在某些方面,靶是多肽。在本公開(kāi)內(nèi)容的其他實(shí)施方案中,組合物的施用改善皮膚病。在多個(gè)實(shí)施方案中,皮膚病選自癌癥、遺傳病、衰老、炎癥、感染和外形缺陷 (cosmetic disfigurement)。在某些方面,癌癥選自鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、乳腺癌和黑素瘤。在其他實(shí)施方案中,靶是由選自Ras、lKBa、hedgehog、B_Raf、Akt和細(xì)胞周期蛋白D的基因表達(dá)的基因產(chǎn)物。在某些方面,遺傳病選自單純性大皰性表皮松解、大皰性魚(yú)鱗病(bullous ichthyosis)、先天性厚甲癥(pachyonychia congenita)、面皮膚骨骼綜合征(Costellosyndrome)和結(jié)節(jié)性硬化癥。在其他方面,靶是包含突變的基因產(chǎn)物,所述基因產(chǎn)物由選自 K5、K14、K1、K10、H-Ras 和 m-I^or 的基因表達(dá)。在某些實(shí)施方案中,衰老病癥選自UV-損傷和早衰。在某些方面,靶是由選自基質(zhì)金屬蛋白酶-I和progerin的基因編碼的基因產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中,炎癥因銀屑病而引起。在某些方面,靶是白細(xì)胞介素-23。在一個(gè)實(shí)施方案中,病毒感染導(dǎo)致疣。在某些方面,靶是E6/E7。在其他實(shí)施方案中,外形缺陷選自脂溢性角化病、表皮痣和色素痣。在多個(gè)方面, 靶是包含突變的基因產(chǎn)物,所述基因產(chǎn)物由選自FGFR3、K10和B-Raf的基因表達(dá)。
圖1描繪了寡核苷酸金納米顆粒(Au-NP)綴合物阻斷啟動(dòng)子復(fù)合物結(jié)構(gòu)(A)和全 mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)構(gòu)(B)形成的方案。圖2描繪了在綴合物處理后大腸桿菌(E. coli)的電子顯微鏡圖像。圖3描繪了使用納米顆粒抑制細(xì)菌熒光素酶表達(dá)的結(jié)果的概要。無(wú)義表示在大腸桿菌基因組或轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒上無(wú)互補(bǔ)區(qū)的序列。反義表示靶向熒光素酶的序列。相對(duì)熒光素酶活性顯示為標(biāo)準(zhǔn)化成海腎表達(dá)的條塊內(nèi)的百分比。圖4描繪了雙鏈體侵入方案。A)雙鏈體(雙鏈體末端上的熒光素和鄰近的 dabcyl)被納米顆粒侵入,從而釋放熒光信號(hào)的示意圖。B)顯示在短(20個(gè)堿基對(duì))雙鏈體和長(zhǎng)(40個(gè)堿基對(duì))雙鏈體(灰色框表示無(wú)義序列,黑色框表示反義序列)中因雙鏈體侵入而不斷增加的熒光的結(jié)果。圖5描繪在施用后M小時(shí)內(nèi)約25nM siRNA-金納米顆粒滲入表皮、真皮和皮下組織。A)小鼠皮膚中siRNA-Au NP的共聚焦成像。左圖框=Cy3。明亮色為角質(zhì)層(外皮層),其可因致密的顆粒積累和自發(fā)熒光而發(fā)出明亮熒光;毛發(fā)(在囊內(nèi)縱切面中看到的) 也發(fā)出強(qiáng)烈的熒光;中間圖框=細(xì)胞核的DAPI染色;右圖框=重疊圖像。圖像顯示熒光 siRNA-Au NP在約100%的表皮細(xì)胞中的攝入。B)間充質(zhì)組織⑴下面的脂細(xì)胞(箭頭) 和成纖維細(xì)胞也幾乎全體攝入熒光顆粒。Bar = 20ymo圖 6 描繪在用 siRNA-Au NP 處理 4 周后 C57BL/6_Tg (UBC-GFP) 30Scha/J 小鼠中 GFP的敲低。
具體實(shí)施例方式本文中公開(kāi)了可局部或經(jīng)皮膚施用以進(jìn)行全身遞送的納米顆粒遞送系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中,該系統(tǒng)利用被密集地裹在納米顆粒(siRNA-NP)的表面上的siRNA雙鏈體。此類(lèi)綴合物展示許多獨(dú)特的性質(zhì),包括但不限于在生物條件下寡核苷酸殼的保留,從而導(dǎo)致單一試劑能夠同時(shí)轉(zhuǎn)染和基因調(diào)控。寡核苷酸-NP(ON-NP)能夠容易地橫穿細(xì)胞膜而無(wú)需加入有毒的轉(zhuǎn)染試劑。重要地,這些結(jié)構(gòu)不僅僅用作用于核酸遞送的媒介物,而且在細(xì)胞內(nèi)保留綴合結(jié)構(gòu)。熒光光譜研究顯示硫代寡核苷酸在細(xì)胞內(nèi)化后仍然結(jié)合NP,從而允許利用納米材料的組合特性。由ON-NP展示的另一個(gè)性質(zhì)是它們?cè)谏憝h(huán)境中的非凡穩(wěn)定性。與其他納米材料和基因轉(zhuǎn)染試劑不同,寡核苷酸-NP在生物相關(guān)條件下可被容易地操作。此類(lèi)生物相關(guān)條件包括高鹽和低鹽濃度、極端PH和溫度的波動(dòng)。ON-NP的另外特性是它們對(duì)核酸酶降解的抗性。由于內(nèi)切和外切核酸酶存在于生物液體中并且用于破壞外來(lái)遺傳物質(zhì),所以用于增加核酸的酶穩(wěn)定性的方法至為重要。雖然提高核酸的酶穩(wěn)定性的先前策略依賴(lài)于化學(xué)修飾,但寡核苷酸-NP的增強(qiáng)的抗性是獨(dú)特的,因?yàn)槠浠诩{米顆粒表面的密集功能化。該環(huán)境在納米顆粒表面附近內(nèi)產(chǎn)生更高的局部電介質(zhì),從而提供高親和力靶識(shí)別和對(duì)酶促降解的抗性。由ON-NP展示的其他性質(zhì)是它們進(jìn)入多種細(xì)胞類(lèi)型(包括“難以轉(zhuǎn)染的”原代細(xì)胞)而無(wú)需使用輔助試劑的能力。ON-NP的另一個(gè)性質(zhì)是它們不存在明顯毒性。此類(lèi)納米綴合物具有獨(dú)特的大小、電荷和表面功能性,特性來(lái)源于寡核苷酸與NP的組合。對(duì)此類(lèi)獨(dú)特材料的初步毒理學(xué)篩選在動(dòng)物模型中未顯示在高劑量下的急性毒性。本文中公開(kāi)了 ON-NP的局部施用是將選擇性基因抑制遞送至損傷的皮膚、淋巴結(jié)或進(jìn)入循環(huán)以經(jīng)皮膚遞送至內(nèi)靶的新型方法。在一個(gè)實(shí)施方案中,通過(guò)將ON-NP直接遞送至損傷的皮膚,使寡核苷酸-NP濃度在最大腫瘤負(fù)荷的位置上最大化,同時(shí)使?jié)撛诟弊饔脺p至最小。在一個(gè)方面,本公開(kāi)內(nèi)容提供抗生素組合物和其使用方法。在一個(gè)方面,抗生素組合物包含經(jīng)修飾而包含寡核苷酸的納米顆粒,其中寡核苷酸與原核生物基因的靶非編碼序列充分互補(bǔ),以便寡核苷酸可在允許雜交的條件下與靶序列雜交。通過(guò)該雜交,抗生素組合物抑制靶原核細(xì)胞的生長(zhǎng)。在靶細(xì)胞中,在某些方面,雜交抑制由靶序列編碼的功能性蛋白質(zhì)的表達(dá)。在多個(gè)方面,由靶向序列編碼的原核生物蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯或兩者被抑制。公開(kāi)內(nèi)容還提供了利用本文中公開(kāi)的抗生素組合物抑制靶原核生物基因產(chǎn)物在細(xì)胞中產(chǎn)生的方法,其包括將細(xì)胞與抗生素組合物接觸的步驟,其中與組合物的納米顆粒結(jié)合的寡核苷酸在允許雜交的條件下與細(xì)菌基因的靶非編碼序列充分互補(bǔ),并且其中雜交導(dǎo)致由靶基因編碼的功能性原核生物基因產(chǎn)物的抑制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解,靶原核生物序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯或轉(zhuǎn)錄和翻譯導(dǎo)致由靶原核生物序列編碼的功能性蛋白的產(chǎn)生的抑制。寡核苷酸功能化的納米顆粒與靶原核生物序列的雜交形成如本文中定義的“復(fù)合物”。如本文中所使用的,“復(fù)合物”是雙鏈(或雙鏈體)復(fù)合物或三鏈(或三鏈體)復(fù)合物。在本文中涉及三鏈體復(fù)合物和雙鏈體復(fù)合物抑制靶細(xì)菌原核生物核酸(prokaryotic acid)的翻譯或轉(zhuǎn)錄。如本文中所使用的,“非編碼序列”具有本領(lǐng)域內(nèi)接受的意義。通常,非編碼序列描述了不包含用于翻譯由基因編碼的蛋白質(zhì)的密碼子的多核苷酸序列。在某些方面,非編碼序列是染色體的。在某些方面,非編碼序列是染色體外的。在一個(gè)方面,非編碼序列與基因的編碼序列的全部或部分互補(bǔ)。非編碼序列包括表達(dá)的調(diào)控元件例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和沉默子。非編碼序列的實(shí)例是5'非編碼序列和3'非編碼序列?!?'非編碼序列”是指位于編碼序列的5'(上游)的多核苷酸序列。5'非編碼序列可存在于起始密碼子的完全加工的mRNA上游中并且可影響初始轉(zhuǎn)錄物至mRNA的加工、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率?!?'非編碼序列”是指位于編碼序列的3'(下游)的核苷酸序列并且包括多腺苷酸化信號(hào)序列和編碼能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的信號(hào)的其他序列。多腺苷酸化信號(hào)通常特征在于其影響添加多聚腺苷酸序列至mRNA前體的3'末端的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中,非編碼序列包括啟動(dòng)子?!皢?dòng)子”是指導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列。通常,啟動(dòng)子位于基因的5'非編碼序列,靠近結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。在啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄中起作用的啟動(dòng)子內(nèi)的序列元件的特征通常在于共有核苷酸序列。此類(lèi)啟動(dòng)子元件包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、TATA序列、CAAT序列、分化特異性元件[DSEs ;McGehee等人, Mol. Endocrinol. 7 :551 (1993)]、環(huán) AMP 應(yīng)答元件(CRE)、血清應(yīng)答元件[SREs ;Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1 :47 (1990)]、糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件(GI )和其他轉(zhuǎn)錄因子例如 CRE/ATF
、AP2 [Ye 等人,J.Biol. Chem. 269 :25728 (1994) ]、SP1、cAMP 應(yīng)答元件結(jié)合蛋白[CREB ;Loeken, Gene Expr. 3 253(1993)]和八聚體因子[通常參見(jiàn),Watson等人編輯,Molecular Biology of the Gene, 第 4 版(The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.1987),以及 Lemaigre 禾口 Rousseau, Biochem. J. 303 :1(1994)]的結(jié)合位點(diǎn)。如果啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,那么轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng)誘導(dǎo)劑而增加。相反地,如果啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子,那么轉(zhuǎn)錄速率不受誘導(dǎo)劑調(diào)控。阻抑型啟動(dòng)子也是已知的。“核心啟動(dòng)子”包含啟動(dòng)子功能所需的必需核苷酸序列,包括TATA盒和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。根據(jù)該定義,核心啟動(dòng)子在可提高活性或賦予組織特異性活性的特定序列不存在的情況下可以具有或可以不具有可檢測(cè)的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中,非編碼序列包括調(diào)控元件?!罢{(diào)控元件”是調(diào)節(jié)核心啟動(dòng)子的活性的多核苷酸序列。例如,調(diào)控元件可包含與細(xì)胞因子結(jié)合,從而使得能夠在特定的原核生物中專(zhuān)有地或優(yōu)先地轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中,非編碼序列包含增強(qiáng)子?!霸鰪?qiáng)子”是無(wú)論增強(qiáng)子相對(duì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離或定向如何都可提高轉(zhuǎn)錄效率的一種調(diào)控元件。此處要指出,如本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求中所使用的,除非另外明確地指出,否則單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指示物。將要指出的是術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互換使用并且具有本領(lǐng)域中接受的意義。還要指出的是術(shù)語(yǔ)“連接”、“綴合”、“修飾”和“功能化”在本文中也可互換使用并且是指寡核苷酸與納米顆粒的結(jié)合?!半s交”意指核酸的2條或3條鏈之間按照沃爾森-克里克DNA互補(bǔ)、Hoogstein 結(jié)合或本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他序列特異性結(jié)合的法則通過(guò)氫鍵的相互作用。雜交可在本領(lǐng)域已知的不同嚴(yán)格條件下進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸功能化的納米顆粒”和“納米綴合物”在本文中可互換使用。如本文中所使用的,解鏈溫度或“Tm”是雜交的兩個(gè)特定核酸離解50%時(shí)所處的溫度。如本文中所使用的,術(shù)語(yǔ)“皮膚的”意指皮膚或與皮膚相關(guān),并且在本文中可與“皮的”互換使用。如本文中所使用的,“經(jīng)皮膚”意指穿過(guò)皮膚至皮下組織并且通常進(jìn)入全身血管或淋巴循環(huán)。如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“局部”意指屬于皮膚。因此,當(dāng)局部施用組合物時(shí),將其施用至皮膚。然而,本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解,術(shù)語(yǔ)“局部”不一定指組合物將保留的地方,而是指如何施用其。在多個(gè)實(shí)施方案中,預(yù)期本公開(kāi)內(nèi)容的組合物和方法靶向皮膚的不同深度,這取決于例如但不限于,具體的目的靶。在多個(gè)實(shí)施方案中,本公開(kāi)內(nèi)容的組合物靶向表皮。在某些實(shí)施方案中,本公開(kāi)內(nèi)容的組合物靶向真皮。在其他實(shí)施方案中,本公開(kāi)內(nèi)容的組合物經(jīng)皮膚遷移并且到達(dá)皮下組織、全身性脈管系統(tǒng)或淋巴循環(huán)。影響本公開(kāi)內(nèi)容的組合物和方法的穿透深度的因素包括但不限于納米顆粒的大
7小和納米顆粒表面上的功能化寡核苷酸密度。這些方面在下文中進(jìn)行了更詳細(xì)的描述。因此,在某些方面,本公開(kāi)內(nèi)容涉及寡核苷酸功能化的納米顆粒本身推進(jìn)本公開(kāi)內(nèi)容的組合物可行進(jìn)的深度。在某些方面,組合物中的媒介物推進(jìn)本公開(kāi)內(nèi)容可行進(jìn)的深度。在其他方面,媒介物與寡核苷酸功能化的納米顆粒一起的組合推進(jìn)本公開(kāi)內(nèi)容的組合物可行進(jìn)的深度。黑素瘤代表具有不同的致癌突變和基因組擴(kuò)增的模式的一組異質(zhì)腫瘤。從前期病變(例如色素痣)進(jìn)展至黑素瘤被認(rèn)為遵循具有導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化的遺傳改變的分步途徑。最常見(jiàn)的是RAS/RAF/MEK/ERK途徑的活化(約60%的黑素瘤已激活BRAF突變和 25% NRAS突變)。日光照射的位置最常見(jiàn)地顯示BRAF突變,然而不太常見(jiàn)的粘膜或肢端位置極少顯示BRAF突變。超過(guò)95%的BRAF突變[Dhomen等人,Hematol Oncol Clin North Am 23,529-545, ix (2009)]是用纈氨酸置換谷氨酸(V600E)并且使BRAF活化增加至500倍的點(diǎn)突變 (T1799A)。該突變?cè)谛∈竽P椭袑?dǎo)致活動(dòng)過(guò)強(qiáng)的黑素細(xì)胞ERK信號(hào)傳導(dǎo)和外植腫瘤的生長(zhǎng)因子依賴(lài)性增殖[Wellbrock 等人,Cancer Res. 64(7) :2338-42 (2004) ] 然而單獨(dú)的BRAF/ERK途徑的活化不能解釋黑素瘤轉(zhuǎn)化。事實(shí)上,轉(zhuǎn)移性黑素瘤傾向于具有超過(guò)1個(gè)基因的改變[Goel等人,Oncogene 28 :2289_2四8 (2009)](參見(jiàn)表A,下文中),除了 BRAF/ERK活化外,最常見(jiàn)地導(dǎo)致磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT) 途徑(約70%的散發(fā)性黑素瘤(sporadic melanomas))的活化[Cheung等人,Cancer Res 68 :3429-3439 (2008)] ο組成型ΡΙΙ/ΑΚΤ活化在BRAF V600E突變介導(dǎo)的黑素瘤的發(fā)展中的至關(guān)重要的作用現(xiàn)已在體外和小鼠研究中得到證明。經(jīng)常發(fā)現(xiàn)BRAF突變與PTEN喪失 /失活(約30%的細(xì)胞系和至少58%的黑素瘤轉(zhuǎn)移灶)(Birck等人,2000)或激活A(yù)KT3 突變(43-50% 的黑素瘤)[Davies 等人,Br J Cancer 99 :1265-1268(2008) ;Lin 等人, Cancer Res 68:664-673(2008) ;Stahl 等人,Cancer Res 64 :7002-7010(2004) Jsao 等人,J Invest Dermatol 122 :337-341(2004)]組合。表Α.所選擇的黑素細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞的基因型
權(quán)利要求
1.一種皮膚遞送寡核苷酸功能化的納米顆粒的方法,其包括步驟給有此需要的患者的皮膚施用治療有效量的包含寡核苷酸功能化的納米顆粒和皮膚媒介物的組合物。
2.權(quán)利要求1的方法,其中所述寡核苷酸功能化的納米顆粒的遞送是經(jīng)皮膚的。
3.權(quán)利要求1的方法,其中所述寡核苷酸功能化的納米顆粒的遞送是局部的。
4.權(quán)利要求1的方法,所述皮膚媒介物包含軟膏。
5.權(quán)利要求4的方法,其中所述軟膏是阿夸福。
6.一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法,其包括步驟在其中所述寡核苷酸功能化的納米顆粒與靶雜交并且調(diào)節(jié)基因表達(dá)的條件下給皮膚施用治療有效量的包含寡核苷酸功能化的納米顆粒的組合物。
7.權(quán)利要求6的方法,其中所述靶是多肽。
8.權(quán)利要求6的方法,其中所述靶是多核苷酸。
9.權(quán)利要求8的方法,其中所述多核苷酸是RNA。
10.權(quán)利要求1或6的方法,其中所述組合物的施用改善皮膚病。
11.權(quán)利要求10的方法,其中所述皮膚病選自癌癥、遺傳病、衰老、炎癥、感染和外形缺陷。
12.權(quán)利要求11的方法,其中所述癌癥選自鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、乳腺癌和黑素瘤。
13.權(quán)利要求12的方法,其中所述靶是由選自Ras.Iκ Ba ,hedgehog.B-Raf.Akt和細(xì)胞周期蛋白D的基因表達(dá)的基因產(chǎn)物。
14.權(quán)利要求11的方法,其中所述遺傳病選自單純性大皰性表皮松解、大皰性魚(yú)鱗病、 先天性厚甲癥、面皮膚骨骼綜合征和結(jié)節(jié)性硬化癥。
15.權(quán)利要求14的方法,其中所述靶是包含突變的基因產(chǎn)物,所述基因產(chǎn)物由選自K5、 K14、K1、K10、H-Ras 和 m-I^or 的基因表達(dá)。
16.權(quán)利要求11的方法,其中所述衰老病癥選自UV-損傷和早衰。
17.權(quán)利要求16的方法,其中所述靶是由選自基質(zhì)金屬蛋白酶-1和progerin的基因表達(dá)的基因產(chǎn)物。
18.權(quán)利要求11的方法,其中所述炎癥因銀屑病而引起。
19.權(quán)利要求18的方法,其中所述靶是白細(xì)胞介素-23。
20.權(quán)利要求11的方法,其中所述病毒感染導(dǎo)致疣。
21.權(quán)利要求20的方法,其中所述靶是E6/E7。
22.權(quán)利要求11的方法,其中所述外形缺陷選自脂溢性角化病、表皮痣和色素痣。
23.權(quán)利要求22的方法,其中所述靶是包含突變的基因產(chǎn)物,所述基因產(chǎn)物由選自 FGFR3、KlO和B-Raf的基因表達(dá)。
24.一種包含寡核苷酸功能化的納米顆粒和皮膚媒介物的皮膚組合物。
25.權(quán)利要求1-23的任一項(xiàng)的方法,其使用權(quán)利要求M的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于遞送寡核苷酸功能化的納米顆粒的組合物和方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102449170SQ201080023986
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月15日
發(fā)明者大衛(wèi)·A·吉拉約翰, 查德·A·米爾金, 艾米·S·保勒 申請(qǐng)人:西北大學(xué)