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用不能形成芽孢的芽孢桿菌生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法

文檔序號:450119閱讀:434來源:國知局
專利名稱:用不能形成芽孢的芽孢桿菌生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種通過使用已突變?yōu)椴荒苄纬裳挎叩难挎邨U菌屬的細菌來生產(chǎn)多種產(chǎn)物(尤其是生產(chǎn)轉(zhuǎn)運多肽)的方法、用于生產(chǎn)上述細菌的方法以及在上述方法中所使用的DNA構(gòu)建體。
背景技術(shù)
在生產(chǎn)用于藥物以及多種產(chǎn)業(yè)的許多種多肽和蛋白質(zhì)中正使用著芽孢桿菌屬的細菌。
舉例來說,地衣形芽孢桿菌就廣泛用于生產(chǎn)如淀粉酶和蛋白酶之類的工業(yè)用酶并且它在工業(yè)制備克隆的基因產(chǎn)物(1,2,3)方面是一種受歡迎的宿主。每年從該生物體中生產(chǎn)出幾百噸的胞外酶,這便導(dǎo)致需要處理掉很多噸的用剩的生物體,而這些生物體通常都作為堆肥。
從環(huán)境的角度來看,當(dāng)把這些物質(zhì)分散到土壤中時,重要的是該物質(zhì)應(yīng)是死亡的。這通??梢酝ㄟ^用化學(xué)物質(zhì)、放射性物質(zhì)和/或熱處理污泥來實現(xiàn)。
盡管大多數(shù)的生產(chǎn)菌株是Sp-,但是在隨機突變實驗的過程中一般都已引入了引起這種表型的損傷并且這種損傷的功能及效果是未知的。因此,在廢棄的生物物質(zhì)中存在低水平芽孢的可能性會很高并且通過需要更苛刻、更昂貴以及環(huán)境更不宜接受的滅菌條件以確保根除芽孢而增加了滅菌工藝的復(fù)雜性。
此外,管理生產(chǎn)菌株的更嚴格的法律體系的建立使得使用一種十分有限的芽孢形成突變體非常合乎要求。這樣的突變體優(yōu)選的應(yīng)當(dāng)是(i)在芽孢形成方面是完全缺陷的;(ii)完全穩(wěn)定并且不能恢復(fù)成形成芽孢,以及(iii)在合成和分泌胞外酶方面類似于或者超過母體。
目前,枯草芽孢桿菌中芽孢形成的遺傳學(xué)處于高級階段(4,5)并且從已被明確表征的地衣形芽孢桿菌的芽孢形成基因(17,6,7)來看,如果發(fā)育途徑不同的話,那么這種枯草芽孢桿菌的近親似乎可能遵循類似的發(fā)育途徑。
在芽孢形成過程中所觀察到的第一形態(tài)學(xué)的變化為在第II階段中合成了不對稱的隔膜。最終將被母體細胞吞沒的更小的后代產(chǎn)生了前芽孢。在母體細胞以及成熟芽孢中的基因的表達一部分會受到一連串σ因子的有序合成和激活的控制,其中σ因子以瞬時并且立體定向的方式指導(dǎo)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄對芽孢形成具有特異性的啟動子(4,5)。
spoIIAC基因的產(chǎn)物σF蛋白(8,9)是一種存在于預(yù)分裂細胞中但其活性則限于前芽孢并僅在分隔后活性才變得明顯(14)的σ因子。這種σ因子對于建立對區(qū)室具有特異性的基因表達而言是至關(guān)重要的(10),并且如果沒有這種σ因子的話,就會阻止在發(fā)育芽孢中大量基因的表達。σF的一個主要的功能為激活對前芽孢具有特異性的σ因子σG的表達,其中的σG決定著在發(fā)育芽孢中基因的表達(11)。此外,把原-σE加工成決定著母體細胞中基因表達的σE也會受到spoIIAC中的無義突變的阻斷(11)。spoIIAC基因的缺失可能會導(dǎo)致芽孢中發(fā)育的完全破壞并且阻礙取決于σE的母體細胞的發(fā)育。
針對這些原因并且由于以前的研究已經(jīng)表明了spoIIAC突變對在枯草芽孢桿菌中胞外酶的合成影響很小(15,16),所以本發(fā)明發(fā)明人選擇spoIIAC突變作為地衣形芽孢桿菌中缺失的目標(biāo)。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)運多肽的方法,該方法包括i)在有利于編碼與所說代謝物的生產(chǎn)有關(guān)的多肽的DNA構(gòu)建體表達以及所說代謝物生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)由于突變而不能形成芽孢的芽孢桿菌屬的細菌,所說的細菌包含所說的DNA構(gòu)建體,以及ii)回收所說的代謝物,其前提是所說的細菌不屬于枯草芽孢桿菌。
本發(fā)明還提供了由于突變而不能形成芽孢的芽孢桿菌屬的宿主細菌以及一種用于生產(chǎn)上述宿主的方法。
該方法以使用從枯草芽孢桿菌提供的信息為基礎(chǔ),從而使得可以缺失涉及芽孢形成過程中的一個或者更多個基因。
通過重疊序列延伸技術(shù)采用拼接在體外制備了spoIIAC基因的缺失。在一個對溫度敏感的質(zhì)粒中把該基因引入地衣形芽孢桿菌中,并且在從染色體中整合和切除之后,制備一種精確定位缺失的染色體基因。
突變的細菌完全無孢子并且形成了其特征在于在細胞的極上具有不對稱隔膜的流產(chǎn)性雙孢擔(dān)子上的孢子細胞。定性平板測試表明上述細菌合成正常水平的DNA酶、多聚半乳糖醛酸裂合酶、蛋白酶、RNA酶以及木聚糖酶,但是由于β-1,3-葡聚糖酶和羧甲基纖維素酶的活性,因此與母體菌株相比在突變體中減少了水解區(qū)。
在延長溫育至72小時的過程中,在突變體和母體的分批培養(yǎng)中堿性蛋白酶的合成是相同的,但是由于突變α-淀粉酶的產(chǎn)率下降了大約30%。
在本研究當(dāng)中,我們指出可以在地衣形芽孢桿菌中使用體內(nèi)重組來制備所限定的基因缺失,并且spoIIAC的缺失產(chǎn)生了一種在芽孢形成方面完全并且穩(wěn)定缺陷的菌株,該菌株仍保持著絲氨酸蛋白酶的正常合成而在淀粉酶合成上稍微有所減少。
本發(fā)明以地衣形芽孢桿菌為例,但可以設(shè)想在諸如緩慢芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、腸膜芽孢桿菌等其它的芽孢桿菌中也可以使用本發(fā)明。
表格及附圖的簡要描述表I表示攜帶有地衣形芽孢桿菌的缺失spoIIAC等位基因的pE194ts的切除頻率。


圖1表示通過在spoIIA中創(chuàng)造缺失的重疊序列延伸反應(yīng)進行的拼接。
A.所使用的引物的詳細情況(附圖表示引物A,B,C,D的3-末端的核苷酸的位置)。
B.通過測定使用引物A和D從缺失的菌株DN286 spoIIACD3產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的序列而得到的spoIIAC基因的序列。
圖2表示造成在spoIIAC中產(chǎn)生缺失的整合和切除反應(yīng)。
圖3表示一種來自spoIIAC缺失突變體培養(yǎng)物的典型細胞的薄切片,該突變體顯示出流產(chǎn)性雙孢擔(dān)子上的孢子的表型(線條=3mm)。
圖4表示在地衣形芽孢桿菌DN286以及DN286 spoIIACD3中的生長,芽孢形成以及胞外酶的合成。
A和B;分別在基本培養(yǎng)基和腦心浸液中,菌株DN286的生長(■)及孢子(□)以及DN286 spoIIACD3的生長(●)。
C和D,分別在基本培養(yǎng)基和腦心浸液中,通過菌株DN286(■)進行的絲氨酸蛋白酶的合成以及通過菌株DN286 spoIIACD3(●)進行的合成。
E,在基本培養(yǎng)基(□,○)和腦心浸液(■,●)中,在菌株DN286(□)以及DN286 spoIIACD3(○)中進行的淀粉酶的合成。
發(fā)明詳述正如以上所指出的,本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)運多肽的方法,該方法包括i)在有利于編碼與所說代謝物的生產(chǎn)有關(guān)的多肽的DNA構(gòu)建體表達以及所說代謝物生產(chǎn)的條件下,培養(yǎng)由于突變而不能形成芽孢的芽孢桿菌屬的細菌,所說的細菌包含所說的DNA構(gòu)建體,以及ii)回收所說的代謝物,其前提是所說的細菌不屬于枯草芽孢桿菌。
根據(jù)本發(fā)明,上述細菌優(yōu)選屬于包括地衣形芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌等種的組。
本發(fā)明的方法是通過使用一種借助spoIIAC基因的缺失而使其不能形成芽孢的芽孢桿菌來舉例說明的,但是諸如Spo-2突變以及Spo-3突變這樣的以不可逆方式有效地破壞芽孢形成過程的任意其它的突變也包括在本發(fā)明當(dāng)中。
如上所述,本發(fā)明的方法應(yīng)當(dāng)優(yōu)選使用其中所說的突變?yōu)椴豢赡嫱蛔兊募毦?br> 預(yù)計本發(fā)明的方法主要用于生產(chǎn)任意多肽、其中尤其是轉(zhuǎn)運多肽。
對于上述細菌而言,所說的多肽可以是內(nèi)源性或是外源性的,這意味著上述多肽最初分別是由其自身或由一些其它的生物體生產(chǎn)的。
但是也可以設(shè)想本發(fā)明的芽孢形成缺陷型菌株可以用于生產(chǎn)次級代謝物。
從本發(fā)明的方法得到的產(chǎn)物優(yōu)選為酶、尤其是諸如蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、氧化還原酶、淀粉酶等工業(yè)用酶。
其它可以通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的產(chǎn)物為藥用酶。
術(shù)語“轉(zhuǎn)運多肽”欲指被表達的多肽攜帶了一個可以使其跨過細胞膜運輸?shù)男盘栃蛄?。更具體地講,轉(zhuǎn)運多肽可以是一種分泌多肽或是一種涉及上述芽孢桿菌細胞的分泌機理的多肽。
本發(fā)明也提供了一種生產(chǎn)屬于芽孢桿菌屬的細菌的方法,其中上述細菌由于通過部分或者完全地缺失了涉及芽孢形成過程的一個或者多個基因的突變而不能形成芽孢。
對于在枯草芽孢桿菌以及其它的革蘭氏陽性細菌(10,24,25)中產(chǎn)生具有特異性的突變而言,基因整合及切除是一種常用的方法。此處,我們指出對于向諸如地衣形芽孢桿菌之類的其它芽孢桿菌的染色體中引入所限定的突變而言,該方法也是一種有效的方法。
假定在枯草芽孢桿菌和地衣形芽孢桿菌之間為近親(26)的話,那么人們便對檢驗使用異源的等位基因來把基因引入染色體的可能性產(chǎn)生了興趣。根據(jù)本發(fā)明,以上述方式就可能在諸如地衣形芽孢桿菌之類的其它芽孢桿菌中使用大量來自枯草芽孢桿菌的已測序的基因進行基因組操作。盡管整合的頻率低于同源反應(yīng)的頻率,但是同源性仍足以使地衣形芽孢桿菌的spoIIAC等位基因整合到枯草芽孢桿菌的染色體上,并且由于這些整合體是無孢子的,所以估計整合可能發(fā)生在正確的位點上。
但是,通過位于整合交換點處的第二位點重組現(xiàn)象一定會在枯草芽孢桿菌宿主中發(fā)生切除并且得不到缺失。估計在該區(qū)域中高的同源性可能引入了一個重組的熱點,結(jié)果所有的子代(從幾個整合體中檢驗了至少2000個)都保留了一個原封不動的spoIIAC基因。
相反的條件似乎可能適合于地衣形芽孢桿菌;并且被迫進入地衣形芽孢桿菌染色體的枯草芽孢桿菌的基因會準(zhǔn)確地切除。
假設(shè)枯草芽孢桿菌和地衣形芽孢桿菌遵循著類似的發(fā)育途徑,那么可以根據(jù)枯草芽孢桿菌的模型來討論地衣形芽孢桿菌中spoIIAC缺失的效果。的確,地衣形芽孢桿菌DN286 spoIIACD3分化成為一種極其類似于在枯草芽孢桿菌的spoIIAC突變體中所看到(4)的流產(chǎn)性雙孢擔(dān)子上的孢子細胞,這完全支持了上述假設(shè)。
通常在指數(shù)生長的晚期以及在形成芽孢的第II階段之前的早穩(wěn)定期中合成胞外酶(在27中進行了回顧)。因此可以估計到spoIIAC的突變應(yīng)對上述基因的表達影響極小或者沒有影響,并且的確除了令人費解的β-葡聚糖酶之外,平板測試揭示出與母體菌株相比突變體中的胞外酶產(chǎn)率沒有總體的變化。
在隔膜完全形成之前將在spoIIA細胞中表達被表達的基因。這包括所有處于0階段的基因和一些第II階段的基因以及諸如abrB,hpr,sen和sin之類的調(diào)節(jié)基因(12)。影響著其中至少存在9種獨立的基因或者系統(tǒng)的枯草芽孢桿菌中aprE表達的大多數(shù)或者所有的控制(12)呈現(xiàn)出早穩(wěn)定期的現(xiàn)象并且可能在spoIIAC突變體中有效地發(fā)揮作用。它遵循絲氨酸蛋白酶合成的模式并且正如在圖4中所看到的在突變體中酶的產(chǎn)率與母體的相符。的確,Arbidge等人(13)使用一種未限定的無孢子的突變體已經(jīng)報道了在枯草芽孢桿菌中絲氨酸蛋白酶合成的類似結(jié)果。
amyE的表達所受到的枯草芽孢桿菌中調(diào)節(jié)基因的支配遠遠少于aprE。盡管sen(28)和pai(29)也涉及對基因的控制,但分解代謝物的抑制以及DegSU系統(tǒng)是該基因主要的控制系統(tǒng)(12)。而淀粉酶的合成受到spoIIAC突變影響的原因并不是顯而易見的。
早期形成芽孢的σ因子σH可能在spoIIAC突變體中積累,這是因為阻斷阻止了σF和σE的合成;前者是由于缺失,而后者是由于來自前體原-σE的活性σE的生產(chǎn)取決于σF(11)。
的確有證據(jù)表明在spoIIA突變體中σH的積累有所增加(Errington,J;個人交流)。因此,α-淀粉酶產(chǎn)率的下降可能是由于E-σA部分被E-σH代替所至。
本發(fā)明的一個主要目的在于提供一種適于工業(yè)用酶生產(chǎn)目的的細菌。此處所描述的突變體在實驗室條件下完全無孢子并且芽孢形成的分子生物學(xué)預(yù)示著上述突變體應(yīng)當(dāng)不能生成內(nèi)生孢子。橫跨了幾乎400bp的缺失的回復(fù)突變的可能性極小并且沒有證據(jù)表明抑制會帶來問題。最后,上述細菌例如在堿性蛋白酶合成方面等同于其母體。材料和方法菌株及生長條件DN286是一種地衣形芽孢桿菌的野生型菌株。
地衣形芽孢桿菌NCIMB6346可以從NCIMB得到。
枯草芽孢桿菌168是從D.A.Smith(伯明翰大學(xué),英國)處獲得的。
使用大腸桿菌JM83來構(gòu)建所有的質(zhì)粒。
按常規(guī)使用Luria肉湯和Luria肉湯瓊脂(16),并采用合適的抗生素選擇氨芐青霉素(100mg/ml)和紅霉素(1mg/ml)。也使用Spizizen基本鹽培養(yǎng)基(16),Schaefer芽孢形成培養(yǎng)基(16)以及腦心浸液(BHI)肉湯(Oxoid)。除非另作聲明,均在37℃下溫育。質(zhì)粒使用質(zhì)粒pUC19在大腸桿菌JM83中克隆。
來自在pUC13(17)中克隆的地衣形芽孢桿菌的完整的spoIIA操縱子是由M.Yudkin(牛津大學(xué),英國)提供的,以及pE194的突變體pE194ts在復(fù)制中對溫度敏感,它是來自P.Youngman(佐治亞大學(xué),雅典,Ga,美國)的贈品。DNA操作大多數(shù)方法都按照Sambrook等人(18)的方法或者以前就已描述了這些方法(21)。從瓊脂糖凝膠中切除DNA并且在連接反應(yīng)之前使用基因-清除II試劑盒(生物101公司)進行純化。采用ABI 373A DNA測序儀,通過由英國倫敦大學(xué)Kings學(xué)院分子醫(yī)學(xué)系提供的自動DNA測序裝置進行PCR產(chǎn)物的DNA測序。測序引物SEQ ID NO.15′-CGATCATGGAAAATTTCATGGATG-3′互補于位于所設(shè)計的重組接頭上游的大約100個堿基的區(qū)域,其中的接頭對應(yīng)于已公開序列的第943至第966個堿基。酶測定酶分泌的定性測定基于以前所述的平板檢測方法(22)。
在培養(yǎng)上清液中使用偶氮酪蛋白作為底物來測定堿性蛋白酶。在37℃下平衡磷酸鉀緩沖溶液(50mM,pH9.0,1ml)和培養(yǎng)上清液(1.0 ml)3分鐘并且通過在磷酸緩沖溶液中加入0.5ml 0.8%的偶氮酪蛋白溶液來引發(fā)反應(yīng)。在合適的時間段內(nèi),用0.5ml冰冷的20%TCA沉淀0.5ml的反應(yīng)混合物,離心該混合物并在405nm下測量上清液的吸光值。以每分鐘每毫升上清液的吸光值的變化來表示活性。
在37℃下,在培養(yǎng)上清液中使用Phadebas淀粉酶底物(Pharmacia)來測定淀粉酶并且使用由Phacebas和Nelson-Somogyi還原糖測定所測定的淀粉酶的稀釋建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線將其換算成從可溶淀粉中的還原糖(麥芽糖)的釋放。單位為mM釋放的麥芽糖當(dāng)量/min/ml上清液。所有的分批培養(yǎng)至少進行兩次;所提供的附圖為上述結(jié)果可重復(fù)形式的代表。電鏡術(shù)在含有0.5%的麥芽糖作為碳源的基本培養(yǎng)基中生長的細胞經(jīng)離心收集并在pH8的含有50mM NaCl的10mM Tris緩沖溶液中洗滌細胞。用含水的乙酸雙氧鈾(4%,2小時)給細胞染色并且根據(jù)Robards和Wilson(23)用檸檬酸鉛復(fù)染。在Jeol 100S透射顯微鏡下觀察薄切片。
實施例實施例1spoIIAC缺失的制備使用了通過重疊延伸(SOE)反應(yīng)的拼接(19)。在使用引物A(SEQID NO.2)5′-GCGGCGAATTCAGCTTGACCCGACGATGGATGAACTG-3′和引物B(SEQ ID NO.3)5′-CACGACCTCTTCTGAACTGAAGTTCTTTCACTTCATGGTCTTTAAGCTG-3′的反應(yīng)中擴增spoIIAC基因的啟動子近側(cè)區(qū)域并且在使用引物C(SEQ IDNO.4)5′-GACCATGAAGTGAAAGAACTTCAGTTCAGAAGAGGTCGTGATGGCC-3′和引物D(SEQ ID NO.5)
5′-GCGGCGGATCCTGCCTGCAACATGAGCAGCCTCAGC-3′(Fig.1).的單獨的反應(yīng)中擴增spoIIAC基因的啟動子遠側(cè)區(qū)域。在引物A和D中帶有下劃線的序列分別表示EcoRI和BamHI位點。該反應(yīng)混合物包括200ng的模板DNA(地衣形芽孢桿菌的克隆的spoIIA操縱子),100pmol的每種引物,最終濃度為125mM的每種dNTP,6ml的MgCl2(25mM),10ml(×10)的Taq緩沖溶液以及無菌的Millipore水(至100ml)。
擴增的程序由在加入1單位的Taq聚合酶(Promega)后在95℃下進行10分鐘變性的起始循環(huán)組成,并用100ml的輕質(zhì)礦物油覆蓋該反應(yīng)混合物。隨后在95℃下變性2分鐘、在55℃下退火2分鐘共35個循環(huán)并在72℃下延伸3分鐘。95℃/2分鐘、55℃/2分鐘的另外的循環(huán)以及72℃/6分鐘的延伸步驟完成了該程序。
通過乙醇沉淀來濃縮上述464bp以及382bp的PCR產(chǎn)物,采用基因-清除試劑盒進行純化,并且在SOE反應(yīng)中(條件與上面的相同)上述產(chǎn)物與引物A和D一起用作模板(每種取300ng),從而生成了包括片段AD的806個堿基對的spoIIAC缺失(圖1)。實施例2向地衣形芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌中引入缺失通過包含在引物A和D中的BamHI和EcoRI限制酶切位點分別把片段AD克隆至pUC19中,把上述片段轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM83中并且在含有40mg/mlX-半乳糖(gal)的LB氨芐青霉素平板上篩選含有攜帶插入片段的質(zhì)粒的菌落。
在用牛小腸堿性磷酸酶處理來自一個克隆的重組質(zhì)粒之后,通過在每個復(fù)制子中唯一的PstI位點把上述重組質(zhì)粒連接到pE194ts上。把連接反應(yīng)的混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM83中并且通過小量制備的瓊脂糖凝膠電泳來檢測該重組體。然后使用從大腸桿菌制備的質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化地衣形芽孢桿菌DN286(10)的原生質(zhì)體以及枯草芽孢桿菌168(20,7)的感受態(tài)細胞。
于28℃下,在50ml含有紅霉素的LB肉湯中培育含有以pE194為基礎(chǔ)缺失的spoIIAC等位基因的地衣形芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌過夜。用3ml含有紅霉素的軟瓊脂稀釋并混合樣品,將其涂覆在LB瓊脂Em平板上并在28℃(允許復(fù)制)及40℃(不允許復(fù)制)下溫育。整合的頻率為在允許的溫度下生長的菌落數(shù)量與那些在不允許的溫度下生長的菌落數(shù)量之比。在40℃下分離出來的整合體隨后在37℃下進行常規(guī)培育。
整合質(zhì)粒的切除是通過在30℃下、在沒有抗生素選擇的LB肉湯中培育細胞來實現(xiàn)的。把稀釋的樣品鋪在LB瓊脂上并在37℃下溫育過夜,在含有紅霉素以及不合紅霉素的LB瓊脂上平板接種上述菌落。以菌落的總數(shù)與Emr菌落的數(shù)目之比來測定切除的頻率。實施例3制備spoIIAC中的缺失在地衣形芽孢桿菌的spoIIAC基因中的缺失是通過重疊序列延伸(SOE)技術(shù)使用拼接來制備的。使用在材料和方法中所述的引物,從克隆的spoIIA操縱子中實現(xiàn)了兩種獨立的PCR擴增。一種產(chǎn)物(AB)包括下游基因(spoIIAB)的遠側(cè)末端以及spoIIAC基因的近側(cè)區(qū)域。第二產(chǎn)物(CD)覆蓋了spoIIAC的遠側(cè)區(qū)域以及上游非編碼區(qū)的一部分。使用在引物B和C中具有同源性的廣大區(qū)域(重疊區(qū))來引發(fā)包括產(chǎn)物AB和CD并插入了引物A和D的第三PCR擴增。于是得到了一個含有包括372bp缺失的spoIIAC基因的末端片段(片段AD,見圖1)。
把片段AD克隆到pUC19中并通過在每個復(fù)制子中唯一的PstI位點將其連接到pE194ts上,從而生成了轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的穿梭質(zhì)粒pHWM2(圖2)。然后使用從大腸桿菌制備的質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化地衣形芽孢桿菌DN286的原生質(zhì)體以及枯草芽孢桿菌168的感受態(tài)細胞。通過限制性內(nèi)切酶分析證實了來自每種轉(zhuǎn)化的克隆都含有pHWM2并且使用上述克隆可以進行整合及切除研究。實施例4缺失的spoIIAC等位基因的整合及切除在28℃下培養(yǎng)含有pHWM2的地衣形芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的細胞過夜并將其平板接種在選擇性(含有Em)和非選擇性的培養(yǎng)基上,在45℃下溫育。地衣形芽孢桿菌的整合頻率大約為10-4,而枯草芽孢桿菌(含有地衣形芽孢桿菌的等位基因)的整合頻率要低100倍(表1),其中的整合頻率以能夠于45℃下在紅霉素平板上生長的細胞的比例計算。當(dāng)在經(jīng)28℃下培養(yǎng)在整合質(zhì)粒中激活滾環(huán)復(fù)制后,對幾個整合體的質(zhì)粒切除進行測定時,地衣形芽孢桿菌的頻率在10-2與10-3之間。表I攜帶地衣形芽孢桿菌的缺失spoIIAC等位基因的pE194ts的切除頻率
在兩個克隆(整合體1和2)中,切除一定會通過整合位點并且回收了野生型的Spo+子代。但對于其它三個克隆而言,切除也通過第二位點重組的現(xiàn)象(見圖2)造成了在Ems衍生物中spoIIAC基因的缺失。令人感興趣的是,在枯草芽孢桿菌中插入是非常不穩(wěn)定的,但在插入點處一定會發(fā)生切除,甚至在延長過度生長階段至48小時后仍回收不到Spo-子代(表I)。實施例5地衣形芽孢桿菌DN286 spoIIACD3的特征確定選擇來自地衣形芽孢桿菌整合體3(表1)的缺失菌株進行進一步的研究。來自地衣形芽孢桿菌的標(biāo)記的spoIIA操縱子雜交到來自野生型并且已用EcoRI切割的缺失菌株的Southern印跡的染色體DNA上,這表明與母體中的4.2kb片段(數(shù)據(jù)未顯示)相比,在突變體中有一個3.8kb的更小的雜交片段。使用引物A和D從突變體和母體菌株的染色體DNA中進行的PCR擴增表明突變體具有一個大約370bp的缺失。當(dāng)測定來自該突變體的PCR產(chǎn)物的序列時,表明在引物B和C之間的連接點處精確地定位了一個缺失(圖1B)。spoIIA突變的形態(tài)學(xué)驗證是由電鏡術(shù)提供的。可以明顯地看到代表枯草芽孢桿菌spoIIAC突變體在“流產(chǎn)性雙孢擔(dān)子上的孢子”細胞中的兩個不對稱隔膜(圖3)。
上述缺失生成了完全無孢子的培養(yǎng)物,在該培養(yǎng)物中是檢測不到孢子的。在BHI、基本培養(yǎng)基(圖4)以及Schaeffer芽孢形成培養(yǎng)基(數(shù)據(jù)未顯示)中生長72小時后,在每種情況下母體的芽孢形成的頻率大約為2%。
通過與在同樣的三種條件下表明有90%至100%形成了芽孢的地衣形芽孢桿菌NCIMB6346相比證明DN286的芽孢形成率生來就低。
在任意一種培養(yǎng)基中,在spoIIAD3衍生物中均未檢測到孢子。盡管沒有孢子,但是當(dāng)在BHI上生長時卻沒有證據(jù)表明在突變體菌株中存在明顯的生存力的損失或者細胞裂解,并且在整個溫育期間細胞群保持穩(wěn)定在大約4×109cfu/ml。但在基本培養(yǎng)基中,當(dāng)溫育突變體超過36小時時卻存在一些生存力的損失,并且在細胞群最高高于10倍之后,最終的細胞群達到3×109cfu/ml。在生長于基本培養(yǎng)基的母體菌株的生存力的損失不太顯著。實施例6地衣形芽孢桿菌DN286 spoIIACD3中胞外酶的合成原始平板測試暗示著突變體菌株在合成胞外酶的數(shù)量上與母體之間有一些較小的差別。更具體地講,與母體菌株相比在突變體中β-1,3-葡聚糖酶和羧甲基纖維素酶的水解區(qū)有所減少,但是α-淀粉酶、DNA酶、多聚半乳糖醛酸裂合酶、蛋白酶、RNA酶以及木聚糖酶的合成大部分不受影響。
在豐富(BHI)和基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述突變體及其母體72小時。檢測芽孢形成以及絲氨酸蛋白酶的合成(圖4)。在母體和突變體中,蛋白酶的生產(chǎn)是類似的。在基本培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)大約40小時后上述兩種菌株中酶的產(chǎn)率達到最高值然后便保持穩(wěn)定。在BHI中,上述兩種菌株中酶的產(chǎn)率稍受抑制并在培養(yǎng)大約48小時后達到最高值。隨后在BHI中酶產(chǎn)率的下降比在鹽培養(yǎng)基中的下降更不顯著。在上述兩種培養(yǎng)基中,絲氨酸蛋白酶的產(chǎn)率不受spoIIAC缺失的影響。
與母體相比,在突變體的分批培養(yǎng)過程中α-淀粉酶的合成始終開始得較晚,結(jié)果這種淀粉酶的發(fā)酵比蛋白酶的發(fā)酵(84小時)會持續(xù)更長的一段時間。在上述兩種培養(yǎng)基中,突變體的酶的產(chǎn)率大約為母體菌株的70%。但是,如果以每單位的生物物質(zhì)的比活性來表達酶的產(chǎn)率時,上述突變體的表現(xiàn)幾乎與母體的相當(dāng),特別是當(dāng)在基本培養(yǎng)基中生物物質(zhì)下降時在生長循環(huán)的后期更是這樣。
通過僅僅顯示本發(fā)明的具體實施方案的實施例已經(jīng)解釋了本發(fā)明。由于對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說在閱讀實施例的基礎(chǔ)上許多其它的實施方案都是顯而易見的,所以這些實施例不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
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1.一種用于生產(chǎn)代謝物的方法,該方法包括i)在有利于編碼與所說代謝物的生產(chǎn)有關(guān)的多肽的DNA構(gòu)建體表達以及所說代謝物生產(chǎn)的條件下,培養(yǎng)由于突變而不能形成芽孢的芽孢桿菌屬的細菌,所說的細菌包含所說的構(gòu)建體,以及ii)回收所說的代謝物,其前提是所說的細菌不屬于枯草芽孢桿菌。
2.權(quán)利要求1的方法,其中所說的細菌屬于包括地衣形芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌的種的組。
3.權(quán)利要求1或2的方法,其中所說的突變選自包括Spo2-突變、Spo3-突變、SpoIIAC-突變的突變的組。
4.權(quán)利要求1至3之任一的方法,其中所說的突變是不可逆的。
5.權(quán)利要求1至4之任一的方法,其中所說的代謝物為一種內(nèi)源或者外源性多肽。
6.權(quán)利要求5的方法,其中所說的多肽是被轉(zhuǎn)運的。
7.權(quán)利要求5或6的方法,其中所說的多肽是一種酶。
8.權(quán)利要求5至7之任一的方法,其中所說的酶是一種工業(yè)用酶。
9.權(quán)利要求5至7之任一的方法,其中所說的酶是一種藥用酶。
10.一種生產(chǎn)屬于芽孢桿菌屬的細菌的方法,其中上述細菌由于突變部分或者完全地缺失了涉及芽孢形成過程的一個或者多個基因而不能形成芽孢。
11.權(quán)利要求10的方法,其中所說的細菌屬于包括地衣形芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌的種的組。
12.權(quán)利要求10或11的方法,其中所說的突變選自包括Spo2-突變、Spo3-突變、SpoI IAC-突變的突變的組。
13.權(quán)利要求10至12之任一的方法,其中所說的突變是不可逆的。
14.一種屬于除枯草芽孢桿菌以外的芽孢桿菌屬的細菌,其中所說的細菌由于突變而不能形成芽孢。
15.權(quán)利要求14的細菌,其中所說的細菌屬于包括地衣形芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌的種的組。
16.權(quán)利要求14或15的細菌,其中所說的突變選自包括Spo2-突變、Spo3-突變、SpoIIAC-突變的突變的組。
17.權(quán)利要求14至16之任一的細菌,其中所說的突變是不可逆的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種獲得除枯草芽孢桿菌以外的不能形成芽孢的芽孢桿菌屬細菌的方法,所說的細菌是通過使用來自枯草芽孢桿菌的信息使母體菌株突變?yōu)橥耆珶o芽孢的菌株得到的??梢允褂眠@樣的菌株來生產(chǎn)有用的代謝物,特別是生產(chǎn)如酶之類的多肽。
文檔編號C12N15/75GK1190434SQ96195350
公開日1998年8月12日 申請日期1996年7月4日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月7日
發(fā)明者F·G·普里斯特, A·B·弗萊明格, M·坦格尼, P·L·約吉恩森, B·迪德里克森 申請人:諾沃挪第克公司
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