專利名稱：芽孢桿菌制劑及其生產(chǎn)方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域。具體涉及一種用于治療和預(yù)防動(dòng)物細(xì)菌性腸道傳染病的芽孢桿菌微生態(tài)制劑及其生產(chǎn)方法。
動(dòng)物細(xì)菌性腸道疾病發(fā)生普遍而嚴(yán)重，是制約我國養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。多年來，使用抗生素和化學(xué)藥劑用于治療和預(yù)防動(dòng)物的細(xì)菌性腸道疾病十分廣泛，造成耐藥性病原微生物增加、防治效果下降，使治療成本加大。同時(shí)，抗生素在環(huán)境和養(yǎng)殖產(chǎn)品中殘留污染，造成了食物鏈的污染等副作用，進(jìn)而直接影響人類的健康。
腸道微生物的生態(tài)平衡是發(fā)揮腸道微生物抵御細(xì)菌感染作用的關(guān)鍵之所在。由于過度的衛(wèi)生管理和各種應(yīng)激反應(yīng)，使得動(dòng)物腸道的微生物菌群失去生態(tài)平衡，一般的趨勢(shì)是，乳酸桿菌類的數(shù)量下降，大腸菌群的數(shù)量上升。隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖條件下動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡失調(diào)問題的日益突出，導(dǎo)致幼齡家禽家畜生長緩慢及死亡的細(xì)菌性下痢在養(yǎng)殖業(yè)內(nèi)普遍發(fā)生而且日趨加重。
活的微生物制劑又叫益生素，是用有益微生物的細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物制成的對(duì)宿主動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡具有調(diào)控作用的一類產(chǎn)品。該類產(chǎn)品可以使新生動(dòng)物盡快形成其正常腸道微生物區(qū)系，可以使動(dòng)物在使用抗生素或遭遇應(yīng)激后盡快恢復(fù)腸道微生物平衡，從而達(dá)到預(yù)防疾病、治療疾病、促進(jìn)生長、提高產(chǎn)量的目的。常見的用于微生物制劑的菌種有嗜酸乳芽孢桿菌，保加利亞乳芽孢桿菌，干酪乳芽孢桿菌，瑞士乳芽孢桿菌，乳酸乳芽孢桿菌，唾液乳芽孢桿菌，植物乳芽孢桿菌，嗜熱鏈球菌，糞腸球菌，屎腸球菌，雙歧桿菌，大腸桿菌，芽孢桿菌等，它們大多是由動(dòng)物腸道和動(dòng)物體上分離獲得的菌種，然后制成微生態(tài)制劑，用于動(dòng)物有一定的效果，但作用動(dòng)物種類范圍有一定的專一性，受到一定的限制；而且多數(shù)微生物制劑是由兩種以上的菌種制成的混合產(chǎn)品，構(gòu)成了一種微生態(tài)體系，由于微生物生長特性的差異以及各種之間的相互作用，產(chǎn)品中各種微生物的數(shù)量會(huì)發(fā)生變化，造成其制劑的質(zhì)量不穩(wěn)定；許多益生細(xì)菌在產(chǎn)品中難以長期存活，對(duì)飼料加工中的高溫等條件沒有抵抗力，因此，其貨架期較短，使用效果不穩(wěn)定。據(jù)Pollamann(1986)統(tǒng)計(jì)，使用微生物添加劑效果不穩(wěn)定，甚至無效，其原因是多方面的，除了制劑質(zhì)量不穩(wěn)定外，所使用的微生物菌株也是至關(guān)重要的。
自80年代以來，由于發(fā)現(xiàn)某些芽孢桿菌具有良好的益生作用，并且具有耐高溫、耐酸堿和存活時(shí)間長的特點(diǎn)，因此，利用芽孢桿菌生產(chǎn)的微生態(tài)制劑用于飼料添加劑和醫(yī)用微生物調(diào)節(jié)劑的研究日益增多，方興未艾。例如，芽孢桿菌型微生態(tài)制劑已有含有一種或幾種芽孢桿菌的復(fù)合微生物制劑(呂青專利公開號(hào)CN 1146865A1997)、兩種或兩種以上的復(fù)合芽孢桿菌微生物制劑(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)專利公開號(hào)CN 1089442A 1994)及單一芽孢桿菌微生物制劑，報(bào)道有穿刺芽孢桿菌制劑(廈門大學(xué)CN 1086663A 1994)、蠟樣芽孢桿菌制劑(北京農(nóng)業(yè)大學(xué)CN 1083862A 1994；康白1981)、地衣芽孢桿菌(中國人民解放軍三零二醫(yī)院CN 1087523A 1994)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌制劑等，另外還有一些含有不明確菌種名稱和菌株數(shù)量的芽孢桿菌制劑；而且在一些醫(yī)用微生態(tài)制劑中，也含有芽孢桿菌，諸如整腸生(含地衣芽孢桿菌)、促菌生(需氧芽孢桿菌)、米雅BM(含芽孢桿菌)等。與該發(fā)明有關(guān)的，含有枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的制劑而言，有四川農(nóng)業(yè)大學(xué)(專利公開號(hào)CN1089442A 1994)飼用微生物添加劑制造方法及用途，中山大學(xué)研制的枯草芽孢桿菌粉劑(鄭勇力等，1998)和閻雙強(qiáng)發(fā)明的枯草芽孢桿菌提取物微生態(tài)制劑(CN 1136437A 1996)。
四川農(nóng)業(yè)大學(xué)(專利公開號(hào)CN 1089442A 1994)飼用微生物添加劑，由六種不同的芽孢桿菌制成的不同的微生態(tài)制劑，分別以一種到三種芽孢桿菌混合制成，其中單一的芽孢桿菌飼用微生態(tài)添加劑為蠟樣芽孢桿菌制劑，其余由兩種或以上組成，在某些品種中含有枯草芽孢桿菌，其菌種系中國菌種保藏中心商品菌種目錄中公開的菌種，而使用牛肉膏、蛋白胨等動(dòng)物性培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為32-37度，最適溫度為37度，其用途主要用于微生物飼料添加劑；中山大學(xué)研制的枯草芽孢桿菌粉劑(鄭勇力等，1998)，其菌株為BS964，特點(diǎn)是采用分子克隆技術(shù)獲得的一株基因工程菌，具有卡那霉素抗性和外源的α-淀粉酶基因，采用肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37度，其用途是主要用于促生長飼料添加劑；閻雙強(qiáng)發(fā)明的枯草芽孢桿菌提取物微生態(tài)制劑(CN 1136437A 1996)，其菌株為KE930518，其特征是提取枯草芽孢桿菌有效成分，同時(shí)附加有枸杞等中草藥成分等，主要用于人的防病保健。
綜上所述，目前還未見到有專門用于動(dòng)物細(xì)菌性腸道疾病的治療和預(yù)防的達(dá)到現(xiàn)有抗生素效果的單一枯草芽孢桿菌活菌制劑。
本發(fā)明的目的在于提供一種由單一菌株生產(chǎn)的、生產(chǎn)成本低廉、用于治療和預(yù)防動(dòng)物細(xì)菌性腸道疾病效果顯著的枯草芽孢桿菌制劑及其生產(chǎn)方法，以及該制劑的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的一種芽孢桿菌型微生物制劑，其特征是采用了一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YK-1R菌株，其菌種保藏號(hào)為CGMCC 0420，以該菌株為菌種，采用單一菌株深層發(fā)酵的方法制備而成的含量為每毫升2億-30億的液體活菌制劑。
該菌種是從苜蓿植物上分離、純化、經(jīng)系統(tǒng)鑒定而得，菌種名稱為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，菌株編號(hào)為YK-1R，其特征為革蘭氏染色陽性、在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌體短桿狀至桿狀、有時(shí)有幾個(gè)菌體連接成鏈狀，芽孢偏中生、孢囊不膨大或稍膨大，但不顯著；pH值為7.5，產(chǎn)蛋白水解酶、淀粉酶、纖維素酶等、其菌體大小為0.6-0.8(微米)×0.2-0.4(微米)；在PMA培養(yǎng)基平板上生長，菌落扁平，邊緣不整齊。其菌株的ERIC-PCR DNA指紋圖譜見附圖
中2泳道。
本發(fā)明提供的一種芽孢桿菌型微生物制劑的生產(chǎn)方法，采用芽胞桿菌為生產(chǎn)菌種，通過搖瓶菌種培養(yǎng)、種子罐、生產(chǎn)罐培養(yǎng)得產(chǎn)品，其特征在于采用如下步驟和方法搖瓶菌種培養(yǎng)取菌種保藏號(hào)為CGMCC 0420的枯草芽孢桿菌為菌種，采用馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基，pH值為6.5-7.5，滅菌，冷卻至室溫，接種，搖床培養(yǎng)，溫度為26-35℃，時(shí)間為10-28小時(shí)；種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)基為植物性培養(yǎng)基，pH值為6.5-7.5，滅菌，冷卻至室溫，接種量為1×106-100×106細(xì)胞/毫升培養(yǎng)基，氣流攪拌，26-35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)；
生產(chǎn)罐培養(yǎng)培養(yǎng)基為植物性培養(yǎng)基，pH值為6.5-7.5，滅菌，冷卻至室溫，按培養(yǎng)基體積的1％-10％接種，通氣，攪拌，26-35℃培養(yǎng)48-72小時(shí)，無菌條件下灌裝即得到含量為每毫升2億-30億的液體活菌制劑。
在該制劑生產(chǎn)中，種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)基組分及含量為玉米粉0.6-2.5％，豆餅粉0.8-2.4％，酵母粉0.1-0.3％，磷酸氫二鉀0.5-1.5％，碳酸鈣0.1-0.5％，水94-97.5％。
在該制劑的生產(chǎn)中，最佳培養(yǎng)溫度為28-32℃；培養(yǎng)基的起始pH值最好為7.0-7.5。
為了保證生產(chǎn)菌種的純度和產(chǎn)品的質(zhì)量，本發(fā)明在生產(chǎn)過程中和產(chǎn)品檢驗(yàn)中采用ERIC-PCR DNA指紋圖分析方法，進(jìn)行菌種純度和產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)控。
本發(fā)明的芽孢桿菌制劑，適用于動(dòng)物細(xì)菌性腸道疾病的治療和預(yù)防。特別適用于家禽家畜細(xì)菌性腸道疾病的治療和預(yù)防。尤其對(duì)幼齡禽畜效果更好。
用于豬細(xì)菌性腸道疾病的治療和預(yù)防治療用量每頭每次灌服該制劑10-15ml，日內(nèi)給藥1-2次，灌服1-3次；預(yù)防用量為每頭每次3-8ml，1日給藥1次，灌服1-2次，有效率可達(dá)95％以上。
用于雞細(xì)菌性腸道疾病的治療和預(yù)防治療用量按1-3％添加量拌入該芽孢桿菌制劑到無抗生素雛雞飼料中使用，2-3次；預(yù)防量為1-3％添加量拌入無抗生素飼料中使用，1-2次。有效率可達(dá)95％以上。
用于牛，尤其是牛犢細(xì)菌性腸道疾病的治療每頭每次灌服該微生態(tài)制劑為30-50ml，每日給藥一次，2-3次；預(yù)防量為每頭每次15-20ml，1-2次。有效率可達(dá)99％以上。
另外，本芽孢桿菌微生態(tài)制劑也可用作動(dòng)物飼料添加劑。按千分之一至千分之十添加到無抗生素飼料中，促進(jìn)動(dòng)物生長，增產(chǎn)效果達(dá)2-12％。
附圖，本發(fā)明芽孢桿菌與其它幾種芽胞桿菌的ERIC-PCR DNA指紋圖的比較。
圖中1是1kb ladder；2是本發(fā)明枯草芽孢桿菌YK-1R；3是枯草芽孢桿菌1.1849；4是堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌1.2010；5是蠟質(zhì)芽孢桿菌1.230；6是地衣芽孢桿菌1.105；7是巨大芽孢桿菌1.1741；8是環(huán)狀芽孢桿菌1.2008；9是陰性對(duì)照。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有明顯的特點(diǎn)和優(yōu)良的效果。首先，本發(fā)明的菌種來源獨(dú)特，它是從山西太原附近的植物上分離獲得的，并采用ERIC-PCRDNA指紋圖分析方法，與中科院微生物所菌種中心(北京)提供的芽孢桿菌屬的六種芽孢桿菌進(jìn)行了對(duì)比，本發(fā)明使用的枯草芽孢桿菌YK-1R菌株，其ERIC-PCR DNA指紋圖與這六種芽孢桿菌有明顯不同(參見附圖)。第二，生產(chǎn)中所用培養(yǎng)基為植物性培養(yǎng)基，生長良好，成本低廉；第三，培養(yǎng)溫度不同，該菌株的培養(yǎng)溫度為28-32度，最適溫度為30度；第四，產(chǎn)品的作用效果顯著，不但對(duì)動(dòng)物的細(xì)菌性腸道疾病具有預(yù)防作用，而且具有顯著的治療效果，總體預(yù)防和治療率達(dá)95％以上，有時(shí)甚至可達(dá)99％以上，達(dá)到了現(xiàn)有抗生素和化學(xué)藥物的治療水平。
總之，本發(fā)明產(chǎn)品的特點(diǎn)1.菌種來源獨(dú)特，適應(yīng)范圍廣；2.菌種純凈，不易退化；3.單位菌量的效價(jià)高；4.治療和預(yù)防效果顯著，尤其對(duì)幼齡禽畜的細(xì)菌性下痢的治療和預(yù)防有特效；5.有效期長，貨架期長；6.產(chǎn)品采用DNA指紋圖和分子探針等先進(jìn)的質(zhì)量控制體系，效果穩(wěn)定；7.可替代抗生素和化學(xué)藥物；8.使用安全，無毒副作用，無污染，無殘留。
實(shí)施例1菌種培養(yǎng)按配方配制馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基，調(diào)整pH值為7.5，分裝到20個(gè)500ml三角瓶中，每瓶100ml，121℃滅菌30分鐘，冷卻至室溫。取CGMCC 0420菌種，用接中環(huán)自斜面試管培養(yǎng)基菌種中挑取一環(huán)，接種到三角瓶中，置200轉(zhuǎn)/分搖床上28℃培養(yǎng)，時(shí)間為16小時(shí)，顯微鏡鏡檢，菌種生長旺盛，無雜菌形態(tài)，備用。
種子罐培養(yǎng)容積為1.5噸，按配方配制培養(yǎng)基700立升，調(diào)整pH值為7.0，120-130℃活蒸汽滅菌30分鐘，冷卻至室溫，空白鏡檢正常后，在火焰保護(hù)下，接種2L液體菌種，接種量約為3×106細(xì)胞/毫升，在28℃-30℃培養(yǎng)約20小時(shí)，進(jìn)氣罐壓為0.09-0.10Mpa，出氣罐壓維持在0.03Mpa，取樣，鏡檢菌體生長情況。菌體生長旺盛，無雜菌，待用。
生產(chǎn)罐培養(yǎng)生產(chǎn)罐容積為5噸，按配方配制培養(yǎng)基3.5噸，調(diào)整pH值為7.0，120-130℃活蒸汽滅菌30分鐘，冷卻至室溫，接種量為10％，自種子罐轉(zhuǎn)接到生產(chǎn)罐中，生產(chǎn)罐在28℃-30℃培養(yǎng)60小時(shí)，進(jìn)氣罐壓為0.09-0.10Mpa，出氣罐壓維持在0.03Mpa，機(jī)械攪拌速度為60-80RPM，待鏡檢發(fā)酵罐中培養(yǎng)菌體，有30％以上轉(zhuǎn)成芽孢后，放罐。儲(chǔ)存在儲(chǔ)存罐中，在無菌狀態(tài)下，分裝，即得芽孢桿菌制劑，芽孢桿菌每毫升含量為2.3億。
種子罐和生產(chǎn)罐發(fā)酵培養(yǎng)基配方玉米粉1.6％，豆餅粉1.8％，酵母粉0.3％，磷酸氫二鉀1.0％，碳酸鈣0.1％，余量為水。
實(shí)施例2菌種培養(yǎng)按配方配制馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基，調(diào)整pH值為7.0，分裝到20個(gè)500ml三角瓶中，每瓶100ml，121℃滅菌30分鐘，冷卻至室溫。取CGMCC 0420菌種，用接中環(huán)自斜面試管培養(yǎng)基菌種中挑取一環(huán)，接種到三角瓶中，置200轉(zhuǎn)/分搖床上30℃培養(yǎng)，時(shí)間為20小時(shí)，顯微鏡鏡檢，菌種生長旺盛，無雜菌形態(tài)，備用。
種子罐培養(yǎng)容積為1.5噸，按配方配制培養(yǎng)基700立升，調(diào)整pH值為7.4，120-130℃活蒸汽滅菌30分鐘，冷卻至室溫，空白鏡檢正常后，在火焰保護(hù)下，接種4L液體菌種，接種量約為7×106細(xì)胞/毫升，在30℃-32℃培養(yǎng)約24小時(shí)，進(jìn)氣罐壓為0.09-0.10Mpa，出氣罐壓維持在0.03Mpa，取樣，鏡檢菌體生長情況。菌體生長旺盛，無雜菌，待用。
生產(chǎn)罐培養(yǎng)生產(chǎn)罐容積為5噸，按配方配制培養(yǎng)基3.5噸，調(diào)整pH值為7.5，120-130℃活蒸汽滅菌30分鐘，冷卻至室溫，接種量為5％，自種子罐轉(zhuǎn)接到生產(chǎn)罐中，生產(chǎn)罐在30℃-33℃培養(yǎng)51小時(shí)，進(jìn)氣罐壓為0.09-0.10Mpa，出氣罐壓維持在0.03Mpa，機(jī)械攪拌速度為60-80RPM，待鏡檢發(fā)酵罐中培養(yǎng)菌體，有30％以上轉(zhuǎn)成芽孢后，放罐。儲(chǔ)存在儲(chǔ)存罐中，在無菌狀態(tài)下，分裝，即得芽孢桿菌制劑，芽孢桿菌每毫升含量為28.2億。
種子罐和生產(chǎn)罐發(fā)酵培養(yǎng)基配方玉米粉0.9％，豆餅粉0.8％，酵母粉0.1％，磷酸氫二鉀0.6％，碳酸鈣0.4％，余量為水。
應(yīng)用實(shí)施例3本發(fā)明芽孢桿菌制劑用于豬細(xì)菌性下痢的治療和預(yù)防，治療率和預(yù)防率達(dá)95％以上；用于促進(jìn)生長，增長率為4.0-10％；本實(shí)驗(yàn)是在太原市種豬場(chǎng)完成的。一、實(shí)驗(yàn)材料動(dòng)物大白豬，日齡1-2；下痢的大白豬仔豬藥物實(shí)施例1、2生產(chǎn)的芽孢桿菌制劑二、實(shí)驗(yàn)方法1.對(duì)子豬黃白痢疾的預(yù)防將初生大白豬仔豬205頭，1-2日齡，體重1.04±0.23kg，按生產(chǎn)母豬的編號(hào)隨機(jī)分為兩組，其中一組為試驗(yàn)組，一組為空白對(duì)照組。試驗(yàn)組仔豬104頭，將芽孢桿菌制劑液體灌服每頭仔豬，劑量5ml/頭，給藥1次?？瞻捉M為101頭，未采用芽孢桿菌制劑預(yù)防。兩組按常規(guī)的相同的管理方式進(jìn)行管理，觀察仔豬下痢情況，觀察時(shí)間為35天。2.對(duì)仔豬細(xì)菌性下痢的治療將下痢仔豬75頭按母豬編號(hào)分為兩組，其中一組為試驗(yàn)組，一組為對(duì)照組。試驗(yàn)組仔豬29頭，將芽孢桿菌制劑灌服試驗(yàn)組下痢仔豬，劑量10毫升/頭，一日一次，給藥兩次為1個(gè)療程。對(duì)照組為46頭，采取氟哌酸治療，每頭一日一次一粒，給藥三次為一個(gè)療程。各組按相同的方式進(jìn)行飼養(yǎng)管理，觀察記載仔豬下痢變化情況，觀察從首次給藥開始為7天。2.對(duì)仔豬促生長作用試驗(yàn)將1-2日齡仔豬205頭，體重1.04±0.23kg，按母豬編號(hào)隨機(jī)分為兩組，一組為試驗(yàn)組，一組為空白對(duì)照組。試驗(yàn)組仔豬104頭，將芽孢桿菌制劑液體灌服每頭仔豬，劑量5ml/頭，給藥1次。空白組為101頭，未灌服芽孢桿菌制劑。兩組按常規(guī)的相同的方式進(jìn)行管理，時(shí)間為35天，觀察仔豬生長情況，在灌服益生素前后，分別稱量仔豬體重。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.對(duì)仔豬黃白痢疾的預(yù)防對(duì)仔豬黃白痢疾的預(yù)防組別 數(shù)量劑量下痢數(shù)下痢率％試驗(yàn)組104 5ml 1 0.96對(duì)照組101 - 3433.66結(jié)果表明在給藥后35天內(nèi)，試驗(yàn)組104頭仔豬，發(fā)現(xiàn)只有一頭發(fā)生痢疾，下痢率為0.96％。對(duì)照組101頭仔豬，中有34頭下痢，下痢率達(dá)33.66％。3.對(duì)仔豬細(xì)菌性下痢的治療對(duì)仔豬細(xì)菌性下痢的治療組別 數(shù)量 止痢止痢率死亡死亡率(頭) (頭)％(頭)％試驗(yàn)組2929 100 0 0對(duì)照組4642 91.3 3 6.5結(jié)果表明在給藥后，試驗(yàn)一組29頭下痢仔豬，全部止痢，止痢率為100％，其中給藥一次后24小時(shí)內(nèi)，止痢25頭，止痢率為86％。對(duì)照組46頭下痢仔豬，給藥三次后，發(fā)現(xiàn)4頭下痢，止痢率為91.3，然后再用慶大霉素治療，4頭下痢仔豬中有一頭止痢，3頭治療無效死亡。3.對(duì)仔豬促生長作用試驗(yàn)對(duì)仔豬體重的影響組別 數(shù)量 使用前重量 試驗(yàn)后重量凈增增長％(頭) kg(X±SD)kg(X±SD) kg試驗(yàn)組1041.03±0.23 7.75±0.32*6.728.56對(duì)照組1011.04±0.24 7.23±±0.36 6.19結(jié)果表明試驗(yàn)組比對(duì)照組增0.53kg，與對(duì)照組比較增重8.56％。兩組相比有顯著性差異。
應(yīng)用實(shí)施例4本發(fā)明芽孢桿菌制劑用于蛋雞和雛雞細(xì)菌性下痢的治療和預(yù)防，治療率和預(yù)防率達(dá)95％以上，蛋雞產(chǎn)蛋增長率為2-12％，雛雞體重增長率為4.0-10％；本實(shí)驗(yàn)是在山西忻州禽畜實(shí)業(yè)有限公司養(yǎng)殖場(chǎng)完成的。I、對(duì)雛雞細(xì)菌性下痢的預(yù)防和促生長作用的實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)材料動(dòng)物雛雞，日齡23，體重200±20g。
藥物實(shí)施例1、2生產(chǎn)的芽孢桿菌制劑二、實(shí)驗(yàn)方法將800只23日齡的雛雞，隨機(jī)分為兩組，每組400只，分別標(biāo)記試驗(yàn)組和對(duì)照組。試驗(yàn)組，每只雛雞分別在23、34日齡各灌服益生素1次，劑量為0.3ml/只，操作時(shí)輕拿輕放，輕輕掰開雞嘴，以1ml注射器緩緩流出藥液待其下咽后，放回育雛火炕上。對(duì)照組，未灌服益生素。試驗(yàn)組和對(duì)照組采用相同的管理，每天下午觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組雛雞的活動(dòng)、飲食情況，是否有雞下痢，并觀察試驗(yàn)組雛雞對(duì)益生素是否過敏。23、42日齡時(shí)，稱量雛雞的重量，試驗(yàn)組和對(duì)照組分別隨機(jī)取出10只雛雞，稱重，稱重后放回雞群，再隨機(jī)取出10只雛雞，分別進(jìn)行5次，稱量50只雛雞，計(jì)算出每只雛雞的重量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。三、試驗(yàn)結(jié)果1.益生素對(duì)雛雞下痢的預(yù)防作用組別 數(shù)量 劑量 下痢數(shù)下痢率只 (ml/只)(只) ％試驗(yàn) 4000.31 10.25對(duì)照組400- 4611.5試驗(yàn)組下痢率為0.25％，對(duì)照組為11.5％，說明本制劑對(duì)雛雞具有下痢預(yù)防作用。2.益生素對(duì)雛雞體重的影響益生素雛雞體重的影響組別 數(shù)量 使用前重量試驗(yàn)后重量凈增增長％只 g(X±SD) g(X±SD) g試驗(yàn)組400204±8.1 421±6.4*217 8.5對(duì)照組400205±7.9 405±10.5 200試驗(yàn)組比對(duì)照組增重17g，與對(duì)照組比較增重8.5％。說明益生素對(duì)雛雞生長具有促進(jìn)作用。3.對(duì)雛雞應(yīng)激反應(yīng)的影響在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，雛雞活動(dòng)、飲食、毛色等均正常，且生長速度加快，說明本制劑應(yīng)激作用較小。II、對(duì)蛋雞細(xì)菌性下痢的治療實(shí)驗(yàn)在同一雞舍內(nèi)，取患細(xì)菌性下痢的種蛋雞40只，平均分為兩組，一組為試驗(yàn)組，一組為對(duì)照組。試驗(yàn)組灌服實(shí)施例1、2生產(chǎn)的芽孢桿菌制劑，每只每次灌服0.5ml，一日一次，連續(xù)給藥3天，對(duì)照組未進(jìn)行任何方式的治療，兩組管理?xiàng)l件一致，觀察時(shí)間為7天。結(jié)果表明試驗(yàn)組給藥三天后，19只止痢，止痢率為95％，七天后產(chǎn)蛋率恢復(fù)到75％，一只治療無效而死亡；對(duì)照組6只止痢，5只仍下痢，常臥不起，很少進(jìn)食，9只死亡，自然止痢率為30％，死亡率為45％。
應(yīng)用實(shí)施例5本發(fā)4明芽孢桿菌制劑用于牛，尤其是牛犢細(xì)菌性腸道疾病的治療，有效率可達(dá)99％以上。
太原市小店奶牛廠，兩頭牛犢腹瀉不止，經(jīng)過慶大霉素、痢特靈止痢無效后，用該芽孢桿菌制劑治療，第一次給藥30ml，24小時(shí)后第二次給藥，在第一次給藥20小時(shí)，止瀉，觀察7天，無復(fù)發(fā)。
山西省山蔭縣奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，有一頭連續(xù)7個(gè)月腹瀉的奶牛，用該芽孢桿菌制劑治療，一次50ml，給藥兩次，一天一次，給藥兩次后即止瀉。另有兩頭消化不良的奶牛，飲食量少，產(chǎn)奶少，灌服該芽孢桿菌制劑，一次50ml，一天一次，給藥兩次后，飲食正常。
權(quán)利要求
1.一種芽孢桿菌制劑，其特征在于該制劑是采用菌種保藏號(hào)為CGMCC0420的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的活菌含量為每毫升2億-30億的液體活菌制劑。
2.按照權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌制劑的生產(chǎn)方法，采用芽胞桿菌為生產(chǎn)菌種，通過搖瓶菌種培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、生產(chǎn)罐培養(yǎng)得產(chǎn)品，其特征在于采用如下步驟和方法①、搖瓶菌種培養(yǎng)取菌種保藏號(hào)為CGMCC 0420的枯草芽孢桿菌為菌種，采用馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基，pH值為6.5-7.5，滅菌，冷卻至室溫，接種，搖床培養(yǎng)，溫度為26-35℃，時(shí)間為10-28小時(shí)；②、種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)基為植物性培養(yǎng)基，pH值為6.5-7.5，滅菌，冷卻至室溫，接種量為1×106-100×106細(xì)胞/毫升培養(yǎng)基，氣流攪拌，30-32℃培養(yǎng)18-24小時(shí)；③、生產(chǎn)罐培養(yǎng)培養(yǎng)基為植物性培養(yǎng)基，pH值為6.5-7.5，滅菌，冷卻至室溫，按培養(yǎng)基體積的1％-10％接種，通氣，攪拌，28-32℃培養(yǎng)48-72小時(shí)，無菌條件下灌裝即得液體產(chǎn)品。
3.按照權(quán)利要求2所述的芽孢桿菌制劑的生產(chǎn)方法，其特征在于種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)基組分及含量為玉米粉0.6-2.5％，豆餅粉0.8-2.4％，酵母粉0.1-0.3％，磷酸氫二鉀0.5-1.5％，碳酸鈣0.1-0.5％，水94-97.5％。
4.按照權(quán)利要求2所述的芽孢桿菌制劑的生產(chǎn)方法，其特征在于最佳培養(yǎng)溫度為28-32℃。
5.按照權(quán)利要求2所述的芽孢桿菌制劑的生產(chǎn)方法，其特征在于最佳培養(yǎng)起始pH值為7.0-7.5。
6.按照權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌制劑的用途，特征在于用于動(dòng)物細(xì)菌性腸道疾病的治療和預(yù)防。
7.按照權(quán)利要求6所述的芽孢桿菌制劑的用途，特征在于用于家禽家畜細(xì)菌性腸道疾病的治療和預(yù)防。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種芽孢桿菌制劑及其生產(chǎn)方法,以及該制劑的應(yīng)用。其特征是采用從植物上分離、純化的單一枯草芽孢桿菌菌株CGMCC 0420和深層發(fā)酵的方法制備而成的液體活菌制劑。該制劑系純種發(fā)酵,其生產(chǎn)工藝簡單,成本低,保存期長;采用DNA指紋圖和分子探針等先進(jìn)的質(zhì)量控制體系使產(chǎn)品的純度高,質(zhì)量穩(wěn)定;該制劑適用范圍廣泛,可用來替代抗生素和化學(xué)藥物,對(duì)治療和預(yù)防多種動(dòng)物、尤其是幼齡動(dòng)物的細(xì)菌性腸道疾病有特效。
文檔編號(hào)A61K35/66GK1273097SQ0010512
公開日2000年11月15日 申請(qǐng)日期2000年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月29日
發(fā)明者趙立平, 趙艮貴, 李新峰, 李艷琴, 申泉 申請(qǐng)人:山西大學(xué)