一種短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑混合制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑混合制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌性疾病一直是困擾水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要原因之一。近年來(lái)，高密度集約化 的生產(chǎn)模式在促進(jìn)水產(chǎn)業(yè)提高產(chǎn)量的同時(shí)，也使得細(xì)菌疾病發(fā)生的機(jī)會(huì)增大、頻率增加、危 害加大；此外，抗生素使用導(dǎo)致的耐藥性、藥物殘留以及對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞也成為社會(huì)關(guān)注 的焦點(diǎn)。因此，尋找抗生素的替代藥物、探索新的防治方式已經(jīng)成為水產(chǎn)病害防治研宄重要 方向之一。
[0003] 群體感應(yīng)（Quorumsensing，簡(jiǎn)稱QS)是指細(xì)菌能自發(fā)產(chǎn)生并釋放一些特定的信 號(hào)分子，感知自身濃度的變化，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。目前，調(diào)節(jié)細(xì)菌群體感應(yīng)的信號(hào) 分子主要有三種，（a)N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHLs)，是廣泛存在于革蘭氏陰性細(xì)菌中的群 體感應(yīng)的信號(hào)分子；(b)自體誘導(dǎo)肽（Autoinducingpeptides，AIP)，AIP是一類短肽分子， 是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中常見(jiàn)的信號(hào)分子；（c)自體誘導(dǎo)物II類分子（AutoinducingII，AI2)， 是以費(fèi)氏弧菌（Vibriofischeri)為代表的由luxS酶催化的AI2系統(tǒng)的信號(hào)分子。研 宄表明，在革蘭氏陰性細(xì)菌中，如銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa)、嗜水氣單胞菌 (Aeromonashydrophila)等，其生物被膜形成、有害毒素產(chǎn)生、致病因子釋放等行為均受到 AHLs類信號(hào)分子的調(diào)節(jié)。Dong(2000)等人在賭樣芽孢桿菌（Bacilluscereus)中發(fā)現(xiàn)了 aiiA基因，能夠合成AHLs信號(hào)分子降解酶，阻斷QS信號(hào)分子在細(xì)菌間的傳遞；尹守亮等 (2009)從膠州灣海域篩選出一株能夠降解AHLs信號(hào)分子的真菌，表明海洋微生物也可以 作為QS抑制劑的潛在研宄對(duì)象；Bhavanath等（2013)發(fā)現(xiàn)紫杉狀海門冬（Asparagopsis taxiformis)的粗提物能夠降解AHLs信號(hào)分子，并且對(duì)銅綠假單胞菌生物膜有一定的抑制 作用。Defoirdt等（2011)首次從南美白對(duì)蝦和海水鱸魚(yú)等水產(chǎn)動(dòng)物的腸道中分離出了能 夠抑制哈氏弧菌（Vibrioharveyi)QS信號(hào)分子傳遞的芽孢桿菌，Natrah等（2011)分離出 一株能夠抑制AHLs信號(hào)分子的微藻，該微藻能夠阻斷哈氏弧菌QS系統(tǒng)，降低其致病力。這 些研宄為探討從群體感應(yīng)角度防控水產(chǎn)細(xì)菌性疾病提供了理論依據(jù)和科學(xué)數(shù)據(jù)的支撐。芽 孢桿菌（Bcaillussp)具有易生產(chǎn)、便運(yùn)輸、耐儲(chǔ)藏等特點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上可以起到凈化水 質(zhì)、防治疾病和促進(jìn)生長(zhǎng)等作用，是常用的益生微生物菌株。
[0004] 中國(guó)專利文獻(xiàn)CN103525723A公開(kāi)了一種具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢 桿菌，具有抑制細(xì)菌群體感應(yīng)的作用，可用于制備防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害的微生物制劑。但是 關(guān)于一種具有顯著防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害、提高存活率的短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑混合制 劑目前還未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑混 合制劑。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑混 合制劑，所述的混合制劑的有效成分由短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑組成，所述的短小芽孢 桿菌為具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌，保藏編號(hào)為CCTCCM2013240,所述的 免疫增強(qiáng)劑為維生素C、黃芪、杜仲、黨參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子，所述 的混合制劑中短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑的重量份分別為：短小芽孢桿菌14-16份、維生 素C10-12份、黃芪7-8份、杜仲4-5份、黨參2-4份、當(dāng)歸3-5份、金銀花6-8份、柴胡9-10 份、烏梅3-5份、石植皮4-6份、五味子9-10份。
[0007] 優(yōu)選的，所述的混合制劑中短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑的重量份分別為：短小芽 孢桿菌16份、維生素C12份、黃芪8份、杜仲5份、黨參4份、當(dāng)歸5份、金銀花8份、柴胡 10份、烏梅5份、石植皮6份、五味子10份。
[0008] 優(yōu)選的，所述的混合制劑的制備方法為將所述的短小芽孢桿菌經(jīng)液體發(fā)酵或固態(tài) 發(fā)酵制成微生物菌劑，所述的微生物菌劑中短小芽孢桿菌活菌數(shù)為10 9-10ncfu/g，將所述 的微生物菌劑、維生素C、黃芪、杜仲、黨參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子分別 粉碎過(guò)100目篩后，按照重量份配比混勻，即得所述的混合制劑。
[0009] 優(yōu)選的，所述的混合制劑作為水產(chǎn)飼料添加劑或水產(chǎn)養(yǎng)殖水體添加劑使用。
[0010] 優(yōu)選的，所述的水產(chǎn)為淡水魚(yú)類。
[0011] 優(yōu)選的，所述的混合制劑在飼料中的添加量為1% -3%。
[0012] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0013] 本發(fā)明的混合制劑對(duì)魚(yú)類的免疫保護(hù)率高達(dá)73-90%，能夠顯著提高魚(yú)體抵抗嗜 水氣單胞菌的感染能力，增強(qiáng)養(yǎng)殖魚(yú)類的機(jī)體免疫力，顯著抑制魚(yú)類腸道致病菌的生長(zhǎng)，促 進(jìn)魚(yú)體快速生長(zhǎng)，提高養(yǎng)殖魚(yú)類的增重率和抗病力。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明。
[0015] 本發(fā)明提供一種短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑混合制劑，所述的混合制劑的有效成 分由短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑組成，所述的短小芽孢桿菌為具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用 的短小芽孢桿菌，保藏編號(hào)為CCTCCM2013240,已證實(shí)其具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用。所 述的免疫增強(qiáng)劑為維生素C、黃芪、杜仲、黨參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子， 所述的混合制劑中短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑的重量份分別為：短小芽孢桿菌14-16份、 維生素C10-12份、黃芪7-8份、杜仲4-5份、黨參2-4份、當(dāng)歸3-5份、金銀花6-8份、柴胡 9-10份、烏梅3-5份、石植皮4-6份、五味子9-10份。
[0016] 所述的短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus)，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心（CCTCC)，地址：武漢大學(xué)生命科學(xué)院保藏中心，保藏日期2013年6月2日，保藏編號(hào)為 CCTCCNO:M2013240。已證實(shí)其具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用。
[0017] 所述的混合制劑的制備方法為將所述的短小芽孢桿菌經(jīng)液體發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵制 成微生物菌劑，所述的微生物菌劑中短小芽孢桿菌活菌數(shù)為10 9-10ncfu/g，將所述的微生 物菌劑、維生素C、黃芪、杜仲、黨參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子分別粉碎過(guò) 100目篩后，按照重量份配比混勻，即得所述的混合制劑。
[0018] 實(shí)施例1短小芽孢桿菌液體發(fā)酵
[0019]將短小芽抱桿菌菌株按斜面、液體種子、液體發(fā)酵的順序培養(yǎng)，斜面培養(yǎng)基為常規(guī) 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，液體種子培養(yǎng)基為常規(guī)營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基；液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方（W/ 乂）：葡萄糖2%，豆餅粉8%，玉米漿1%，]\%504*711 200.02%，似(：10.4%，腿2?04 0.1%， 皿11(：12 0.04%，發(fā)酵溫度301：，通風(fēng)培養(yǎng)24-4811。得到高濃度的發(fā)酵菌液，其中活菌數(shù) 109-10ncfu/g〇
[0020] 也可以將發(fā)酵菌液離心去除發(fā)酵液，得到濕菌泥，添加抗熱保護(hù)劑后，噴霧干燥， 得到固體菌粉，活菌數(shù)10 9-10ncfu/g。
[0021] 實(shí)施例2短小芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵
[0022] 將短小芽抱桿菌菌株按斜面、