液體種子、固態(tài)發(fā)酵的順序培養(yǎng)，斜面培養(yǎng)基為常 規(guī)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，液體種子培養(yǎng)基為常規(guī)營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基。將種子培養(yǎng)液以5-10% 的接種量接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵時間為24-48h，發(fā)酵溫度30°C，發(fā) 酵產(chǎn)物烘干粉碎后，即得短小芽孢桿菌微生物菌劑。其中活菌數(shù)l〇9-l〇ncfu/g。
[0023] 其中固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由料和水組成，所述的料按總質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%計，包括米糠 10%，麩皮25%，豆柏32%，玉米粉30%，酵母提取物2%，NaCl1%，料水比為1:1。
[0024] 實施例3混合制劑的制備
[0025]將所述的短小芽孢桿菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制成微生物菌劑，所述的微生物菌劑中短小芽 孢桿菌活菌數(shù)為l〇9-l〇nCfu/g，將所述的短小芽孢桿菌菌劑16份、維生素C12份、黃芪8 份、杜仲5份、黨參4份、當(dāng)歸5份、金銀花8份、柴胡10份、烏梅5份、石榴皮6份、五味子 10份。分別粉碎過100目篩后，按照重量份配比混勻，即得所述的混合制劑。
[0026] 實施例4混合制劑的制備
[0027]將所述的短小芽孢桿菌經(jīng)液體發(fā)酵制成微生物菌劑，所述的微生物菌劑中短小芽 孢桿菌活菌數(shù)為l〇9-l〇nCfu/g，將所述的短小芽孢桿菌菌劑14份、維生素C10份、黃芪7 份、杜仲4份、黨參2份、當(dāng)歸3份、金銀花6份、柴胡9份、烏梅3份、石榴皮4份、五味子9 份。分別粉碎過100目篩后，按照重量份配比混勻，即得所述的混合制劑。
[0028] 實施例5混合制劑的制備
[0029]將所述的短小芽孢桿菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制成微生物菌劑，所述的微生物菌劑中短小芽 孢桿菌活菌數(shù)為l〇9-l〇ncfu/g，將所述的短小芽孢桿菌菌劑15份、維生素C11份、黃芪7 份、杜仲4份、黨參3份、當(dāng)歸4份、金銀花7份、柴胡10份、烏梅4份、石榴皮5份、五味子 10份。分別粉碎過100目篩后，按照重量份配比混勻，即得所述的混合制劑。
[0030] 實施例6混合制劑的水體潑灑效果實驗
[0031]鯽魚，購買自江蘇徐州淡水魚養(yǎng)殖中心，體重100±0.5g，提前飼喂10天，無任何 嗜水氣單胞菌癥狀。飼料購買自寧波天邦股份有限公司，按照體重的3%飼喂。
[0032]在試驗前先馴養(yǎng)一周確定無任合嗜水氣單胞菌癥狀，然后取體重（100±2. 3)g的 鯽魚90條，隨機分為三組每組三個重復(fù)，每組10條，養(yǎng)殖在700X500X50mm，體積90L水 族箱中，保持水溫16?20 °C。
[0033] 實驗設(shè)計三個組，共90條，每組10條，三個重復(fù)，對照組：在水體中加入培養(yǎng)的嗜 水氣單胞菌菌液l〇〇mL(經(jīng)稀釋后最終菌液濃度達到108cfu/mL，在先實驗確定嗜水氣單胞 菌的絕對致死濃度為1X108cfu/mL)，試驗組加入嗜水氣單胞菌菌液100mL和實施例3制備 得到的本發(fā)明的混合制劑l〇g，空白組為空白對照水體中不加入任何東西。每隔兩天換水， 加入曝過氣的自來水，和重新培養(yǎng)的菌液，記錄鯽魚的生長狀況以及死亡數(shù)。
[0034] 在兩周的飼養(yǎng)周期內(nèi)，空白組沒有任何的死亡現(xiàn)象；對照組所有樣本在9天內(nèi)全 部死亡，而水體中加入嗜水氣單胞菌和本發(fā)明的混合制劑的試驗組，在七天后達到穩(wěn)定，最 終的存活率為90%。
[0035] 實施例7混合制劑促生長和攻毒實驗
[0036] 生長實驗：試驗選擇健康、規(guī)格、重量基本一致的鯽魚，個體初均重約50g。隨機分 組，設(shè)有對照組、試驗一組、試驗二組、試驗三組和試驗四組，每組設(shè)3個平行試驗，每平行 組50尾試驗魚，共6個網(wǎng)箱（規(guī)格為250cmX150cmX100cm)。鯽魚馴化30d后，對照組投 喂普通飼料，試驗一組投喂添加3. 0%重量百分比本發(fā)明混合制劑（實施例3)的飼料，試驗 二組投喂添加1.0%重量百分比本發(fā)明混合制劑的飼料，試驗三組投喂添加3.0%重量百 分比本發(fā)明所述短小芽孢桿菌（不包括免疫增強劑的混合制劑）的飼料，試驗四組投喂添 加3.0%重量百分比免疫增強劑（不包括短小芽孢桿菌的免疫增強劑）的飼料，飼養(yǎng)56d， 測定其生長的影響。
[0037] 攻毒實驗：對照組、試驗一組、試驗二組、試驗三組和試驗四組每組隨機抽取15尾 鯽魚。lX101cfu/mL嗜水氣單胞菌，按每100g魚重腹腔注射菌液1.0ml，后放養(yǎng)于同樣規(guī) 格容積的水泥池網(wǎng)箱中（規(guī)格為lOOcmXIOOcmXIOOcm)，并保證充足的氧氣，每天觀察魚 體死亡情況，觀察l〇d，統(tǒng)計存活率。
[0038] 具體試驗結(jié)果見下表1。
[0039] 表1三組增重率和死亡率的對照
【主權(quán)項】
1. 一種短小芽孢桿菌和免疫增強劑混合制劑，其特征在于，所述的混合制劑的有效成 分由短小芽孢桿菌和免疫增強劑組成，所述的短小芽孢桿菌為具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用 的短小芽孢桿菌，保藏編號為CCTCC M 2013240,所述的免疫增強劑為維生素C、黃芪、杜仲、 黨參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子，所述的混合制劑中短小芽孢桿菌和免疫 增強劑的重量份分別為：短小芽孢桿菌14-16份、維生素C 10-12份、黃芪7-8份、杜仲4-5 份、黨參2-4份、當(dāng)歸3-5份、金銀花6-8份、柴胡9-10份、烏梅3-5份、石榴皮4-6份、五味 子9-10份。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合制劑，其特征在于，所述的混合制劑中短小芽孢桿菌和 免疫增強劑的重量份分別為：短小芽孢桿菌16份、維生素C 12份、黃芪8份、杜仲5份、黨 參4份、當(dāng)歸5份、金銀花8份、柴胡10份、烏梅5份、石榴皮6份、五味子10份。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2任一所述的混合制劑，其特征在于，所述的混合制劑的制備方法 為將所述的短小芽孢桿菌經(jīng)液體發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵制成微生物菌劑，所述的微生物菌劑中短 小芽孢桿菌活菌數(shù)為l〇9-l〇ncfu/g，將所述的微生物菌劑、維生素C、黃芪、杜仲、黨參、當(dāng) 歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子分別粉碎過100目篩后，按照重量份配比混勻，即 得所述的混合制劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-2任一所述的混合制劑，其特征在于，所述的混合制劑作為水產(chǎn)飼 料添加劑或水產(chǎn)養(yǎng)殖水體添加劑使用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的混合制劑，其特征在于，所述的水產(chǎn)為淡水魚類。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的混合制劑，其特征在于，所述的混合制劑在飼料中的添加量 為 1% _3%〇
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種短小芽孢桿菌和免疫增強劑混合制劑，所述的混合制劑的有效成分由短小芽孢桿菌和免疫增強劑組成，所述的短小芽孢桿菌為具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌，保藏編號為CCTCC M 2013240，所述的免疫增強劑為維生素C、黃芪、杜仲、黨參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子。本發(fā)明優(yōu)點在于：能夠顯著提高魚體抵抗嗜水氣單胞菌的感染能力，增強養(yǎng)殖魚類的機體免疫力，顯著抑制魚類腸道致病菌的生長，促進魚體快速生長，提高養(yǎng)殖魚類的增重率和抗病力。CCTCC NO.M201324020130602
【IPC分類】A61P37-04, A61K31-375, A61K35-742, A61K36-736, A61P3-00, A61K36-79, A61P31-04
【公開號】CN104523956
【申請?zhí)枴緾N201410751286
【發(fā)明人】宋增福, 許維素
【申請人】蘇州埃瑞特生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月10日