專利名稱：芽孢桿菌蛋白生產(chǎn)細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有增加的所需多肽生產(chǎn)的芽孢桿菌細(xì)胞和所需多肽的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
芽孢桿菌細(xì)胞已廣泛應(yīng)用于所需多肽的工業(yè)生產(chǎn)。Kunst等，自然(nature)390249-256(1997)上公布了革蘭氏陽性的枯草芽孢桿菌的完整基因組序列。
發(fā)明概述本發(fā)明要解決的問題是提供能產(chǎn)生增加量的所需多肽的芽孢桿菌細(xì)胞。
解決方案的基礎(chǔ)是，本發(fā)明人鑒定出了一種能產(chǎn)生增加量的所需多肽的芽孢桿菌細(xì)胞，該細(xì)胞中，含如SEQ ID NO1所示DNA序列的基因以低于野生型的水平表達(dá)。
該基因在枯草芽孢桿菌細(xì)胞中得到證實，并在所述芽孢桿菌細(xì)胞中命名為yjbH。參見Kunst等自然(nature)390249-256(1997)。
而且，本發(fā)明人在地衣芽孢桿菌中已鑒定出了一種同源yjbH基因(SEQID NO3)。
如上所述，(見背景部分；Kunst等自然(nature)390249-256(1997))在本發(fā)明的優(yōu)先權(quán)日以前，yjbH基因未被破譯，即該基因未與優(yōu)先權(quán)日前已知的功能相聯(lián)系。
根據(jù)本文的指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用常規(guī)知識，通過如與本文公開的yjbH基因(SEQ ID NO1和3)的DNA序列同源性，鑒定另一種芽孢桿菌細(xì)胞中的同源基因，并由此，通過以上概述的方法，生產(chǎn)能產(chǎn)生增加量的所需多肽的芽孢桿菌細(xì)胞。
此外，如SEQ ID NO1所示的DNA序列，與任何細(xì)胞中的任何其他已知DNA序列的同一性都極低。在公知數(shù)據(jù)庫中，例如EMBL中進(jìn)行同源搜索的結(jié)果表明不存在與如SEQ ID NO1所示DNA序列有任何相近的同一性的序列。
同樣的，用如SEQ ID NO2所示的多肽序列在公用SWISSPROT數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果表明沒有任何同一性近似的多肽。
據(jù)此，本發(fā)明的第一方面涉及一種具有增加的所需多肽生產(chǎn)的芽孢桿菌細(xì)胞，該芽孢桿菌的細(xì)胞以低于野生型的水平表達(dá)一種基因，該基因包括(a)如SEQ ID NO1第1位到828位所示的的DNA序列；(b)與項目(a)中DNA序列同一性至少為70％的DNA序列；(c)編碼如SEQ ID NO2中第1位到275位所示多肽序列的DNA序列；或(d)編碼與如SEQ ID NO2中第1位到275位的序列同一性至少為70％的多肽的DNA序列。
而且，本發(fā)明人已證實如SEQ ID NO1第1到147位所示的部分序列高度保守。
據(jù)此，本發(fā)明的第二方面涉及一種具有增加的所需多肽生產(chǎn)的芽孢桿菌細(xì)胞，該芽孢桿菌細(xì)胞以低于野生型的水平表達(dá)一種基因，所述基因包括(a)如SEQ ID NO1第1位到147位所示的DNA序列；(b)與項目(a)中DNA序列同一性至少為70％的DNA序列；(c)編碼如SEQ ID NO2中第1位到49位所示的多肽序列的DNA序列；或(d)編碼與SEQ ID NO2中第1位到49位所示的序列同一性至少為70％的多肽的DNA序列。
如上所顯而易見，本文的芽孢桿菌細(xì)胞非常適合所需多肽的生產(chǎn)。
據(jù)此，本發(fā)明的第三方面是生產(chǎn)所需多肽的方法，其包括下列步驟(i)在允許所需多肽生產(chǎn)的條件下，培養(yǎng)上述第一或第二方面的芽孢桿菌；(ii)分離所需多肽。
定義
在對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行討論之前，先對與本發(fā)明的主要方面相關(guān)的特定術(shù)語進(jìn)行定義。
術(shù)語“基因”在此處表示能在所述細(xì)胞中表達(dá)為多肽的基因(DNA序列)。據(jù)此，所述基因可定義為由一個起始密碼子(一般為“ATG”，“GTG”或“TTG”)開始到一個終止密碼子(一般為“TAA”，“TAG”或“TGA”)終止的開放閱讀框。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，為了表達(dá)所述基因，必須有與該基因相關(guān)聯(lián)的，且在細(xì)胞中表達(dá)該基因所必須的元件。這些標(biāo)準(zhǔn)元件包括啟動子，核糖體結(jié)合位點，終止序列及本領(lǐng)域所知的其它序列。
依照本發(fā)明第一和第二兩方面的術(shù)語“芽孢桿菌以低于野生型的水平表達(dá)一種基因”是指對能產(chǎn)生以低于野生型之水平表達(dá)一種基因的細(xì)胞的野生型細(xì)胞的任何改變。這些改變可能是啟動子和/或開放閱讀框的改變，如缺失，插入，移碼或本領(lǐng)域所知的任何DNA操作。
如上述改變的芽孢桿菌細(xì)胞中基因的表達(dá)水平，可優(yōu)選地通過比較所述細(xì)胞與未經(jīng)改變的親代細(xì)胞中所需多肽的生產(chǎn)水平，來很好地確定。如果與未經(jīng)改變的親代細(xì)胞相比，經(jīng)改變的芽孢桿菌細(xì)胞產(chǎn)生更多的所需多肽，則依本發(fā)明的第一和第二方面所得的芽孢桿菌細(xì)胞中的基因表達(dá)低于野生型水平。測定所需多肽生產(chǎn)水平的實際分析將依賴于具體的所需多肽。選擇合適的分析方法是屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識范圍內(nèi)的。
DNA序列的同一性涉及本發(fā)明第一方面中術(shù)語“與SEQ ID NO中第1至828位所示的DNA序列有至少70％同源性的DNA序列”和本發(fā)明第二方面中的術(shù)語“與SEQ ID NO1中第1至147位所示的DNA序列有至少70％同源性的DNA序列”，的DNA序列同一性被確定為兩個序列之間的同一性程度，其表示第一個序列與第二個序列的偏差。同一性可通過本領(lǐng)域所知的計算機(jī)程序來確定，例如，GCG程序包中的GAP程序(WISCONSIN軟件包的程序使用手冊，1994年8月第8版，遺傳學(xué)計算機(jī)組，575 SCIENCE DRIVE MADISON，威斯康星，美國)53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)分子生物學(xué)雜志，48，443-453)。使用帶有下列設(shè)置的GAP程序進(jìn)行DNA序列比較GAP創(chuàng)建罰分5.0，GAP延伸罰分0.3。上述的相似DNA序列具有與本發(fā)明第一方面中第1到828位的DNA序列，或本發(fā)明第二方面中SEQ ID NO1之1到147位的DNA序列優(yōu)選至少為70％，更優(yōu)選至少為75％，更優(yōu)選至少為80％，更優(yōu)選至少為90％，更優(yōu)選至少為95％，更優(yōu)選至少為97％的同一性程度。
多肽序列的同一性涉及本發(fā)明第一方面中術(shù)語“與編碼SEQ ID NO2中第1至275位所示多肽序列的DNA序列同一性至少為70％的DNA序列”和本發(fā)明第二方面中的術(shù)語“與編碼SEQ ID NO2中第1至49位所示多肽的DNA序列同一性至少為70％的DNA序列”的多肽序列同一性被確定為兩個序列之間的同一性程度，其指示第一個序列與第二個序列的偏差。同源性可通過本領(lǐng)域所知的計算機(jī)程序來確定，例如，GCG程序包中的GAP(WISCONSIN軟件包的程序使用手冊，1994年8月第8版，遺傳學(xué)計算機(jī)組，575 SCIENCEDRIVE MADISON，威斯康星，美國)53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)分子生物學(xué)雜志，48，443-453)。使用帶有下列設(shè)置的GAP程序進(jìn)行DNA序列比較GAP創(chuàng)建罰分3.0，GAP延伸罰分0.1，由本發(fā)明中相似DNA所編碼的多肽序列與本發(fā)明第一方面SEQ ID NO2中第1到275位的多肽序列，或本方面第二方面SEQ ID NO2中1到49位的多肽序列的同一性程度，優(yōu)選至少為70％，更優(yōu)選至少為75％，更優(yōu)選至少為80％，更優(yōu)選至少為90％，更優(yōu)選至少為95％，更優(yōu)選至少為97％。
發(fā)明詳述依本發(fā)明第一或第二方面具有增加的所需多肽生產(chǎn)的芽孢桿菌細(xì)胞此處所述的基因優(yōu)選位于芽孢桿菌中的兩個公知的遺傳標(biāo)記srfAA和thyA之間。
術(shù)語“位于芽孢桿菌的兩個公知的遺傳標(biāo)記srfAA和thyA之間”此處是指所述基因位于枯草芽孢桿菌染色體上約32°處的srfAA的3’端和枯草芽孢桿菌染色體上約162.5°處thyA的5’端之間(F.Kunst等，1997，自然，390(20)249-256)。
遺傳標(biāo)記srfAA編碼芽孢桿菌中的枯草菌表面活性劑合成酶亞單位I，詳細(xì)內(nèi)容參見(Fuma，S等，核酸研究1993；21(1)93-7)。
遺傳標(biāo)記thyA編碼芽孢桿菌中的胸苷酸合成酶A，詳細(xì)內(nèi)容參見(Tam，N.H.等分子普通遺傳學(xué)1998；258(4)427-30)。
srfAA標(biāo)記是多種不同原核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的同源標(biāo)記超家族的成員，例如液化腸桿菌(Serratia liquefaciens)的swrA(Lindum等細(xì)菌學(xué)雜志，1998；180(23)6384-8)和短芽孢桿菌(Bacillus brevus)的grsA(Krause，M.等細(xì)菌學(xué)雜志1988；1704669-74)。
thyA標(biāo)記常見于多種原核細(xì)胞，例如淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)(Carlson，J.H.等FEMS微生物學(xué)通訊.1997；151(2)225-30)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus liquefaciens)(Tam，N.H.等分子普通遺傳學(xué).1998；258(4)427-30)，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(Cole，S.T.等自然1998；393(6685)537-44)。
此處所述的基因更優(yōu)選位于芽孢桿菌中2個公知的遺傳標(biāo)記mecA和tenA之間(F.Kunst等，1997，自然390(20)249-256)。
術(shù)語“位于芽孢桿菌中2個公知的遺傳標(biāo)記mecA和tenA之間”此處指所述基因位于枯草芽孢桿菌染色體上約105°處mecA的3’端和枯草芽孢桿菌染色體上約106°處tenA的5’端之間(F.Kunst等，1997，自然390(20)249-256)。
遺傳標(biāo)記mecA編碼芽孢桿菌遺傳感受態(tài)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，詳細(xì)內(nèi)容參見(Kong，L等分子微生物學(xué)1993年7月；9(2)365-73)。
遺傳標(biāo)記tenA編碼一種多肽，該多肽可調(diào)節(jié)芽孢桿菌中胞外酶的產(chǎn)生，詳細(xì)內(nèi)容參見(Pang，AS.等，細(xì)菌學(xué)雜志，1991，1月，173(1)46-54)。
這兩種遺傳標(biāo)記常見于多種不同原核生物細(xì)胞，例如堅強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)(Guo，D.等Biochim Biophys Acta 1998 1月5日；1389(1)34-42)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermis)(Ryffel等，基因1990年9月28日；94(1)137-8)，幽門螺桿菌(Helcobacter pylori)(Tomb，JF.等，自然1997年8月7日；388(6642)539-47)。
在以上述參考為基礎(chǔ)的其他文獻(xiàn)中，以本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識，即可在具體目標(biāo)芽孢桿菌細(xì)胞中鑒定這些遺傳標(biāo)記基因，如遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)，嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)，Bacillus clausii，環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)，堅強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)，或蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)。
其中優(yōu)選的是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis)，或解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的細(xì)胞。
本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案涉及此處所描述的芽孢桿菌細(xì)胞；其中由于一個基因已失活，而使所述芽孢桿菌細(xì)胞以低于野生型的水平表達(dá)該基因。
基因的失活可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何策略達(dá)到，例如在該基因內(nèi)或啟動子中缺失，插入移碼突變。
另一實施方案涉及此處所描述的芽孢桿菌細(xì)胞，其中所需多肽是酶，例如蛋白酶，纖維素酶，脂肪酶，木聚糖酶，磷脂酶，或優(yōu)選淀粉酶。
SEQ ID NO3和SEQ ID NO4分別公開了地衣芽孢桿菌中yjbH基因的部分DNA序列和多肽序列。SEQ ID NO1中第1到147位所示的DNA序列與SEQ ID NO3中第1到147位所示的DNA序列之間有76％的同一性，SEQ ID NO2中第1到49位的多肽序列與SEQ ID NO4中第1到49位的多肽序列之間有79％的同一性。
因此這些序列包括在本發(fā)明第一和第二方面的范圍內(nèi)。然后，本發(fā)明的一個實施方案涉及芽孢桿菌細(xì)胞，該細(xì)胞中所述基因包含如SEQ ID NO3中第1到147位所示的DNA序列，或該基因包含編碼如SEQ ID NO4中第1到49位所示多肽序列的DNA序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有增加的所需多肽生產(chǎn)的芽孢桿菌細(xì)胞，其中該芽孢桿菌細(xì)胞以低于野生型的水平表達(dá)一種基因，該基因包括(a)如SEQ ID NO3中第1到147位所示的DNA序列；(b)與(a)項中所述DNA序列的同一性至少為70％的DNA序列；(c)編碼如SEQ ID NO4第1到49位所示多肽序列的DNA序列；或(d)編碼與SEQ ID NO4第1到49位所示多肽序列同一性至少為70％的的多肽序列的DNA序列。
所有與本發(fā)明第一和第二方面相關(guān)的實施方案，例如更優(yōu)選的同源性特征和該基因在優(yōu)選的遺傳標(biāo)記之間的位置也是與上述方面相關(guān)的優(yōu)選實施方案。
包含本發(fā)明第三方面的生產(chǎn)所需多肽的方法這一方法中的必需要素是使用此處所述的芽孢桿菌細(xì)胞。
允許所需多肽產(chǎn)生的具體培養(yǎng)條件可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的多種培養(yǎng)方法中的任意一種。
類似地，分離本發(fā)明第三方面第ii)項的所需多肽的特異性策略可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種分離方案中的任何一種。
此外，此處給出的任何范圍和計劃值都可以在不失去所需效果的前提下擴(kuò)展或改變，如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本文時所顯而易見的那樣。
實施例材料和方法若無另外說明，體外DNA操作，細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化等均依分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Sambrook，J.“分子克隆實驗室手冊”冷泉港實驗室，1982；Ausubel，F(xiàn).V.，等(編)“現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)”.JohnWiley和Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(編)“芽孢桿菌分子生物學(xué)方法”.John Wiley和Sons，1990)。
若無另外說明，DNA操作所使用的酶依供應(yīng)商提供的說明書使用。
所用培養(yǎng)基(TY，BPX和LB瓊脂)見歐洲專利0506780。LBPSG瓊脂是添加了磷酸鹽(0.01M K3PO4)、葡萄糖(0.4％)和淀粉(0.5％)的LB瓊脂。如WO94/19454所述含經(jīng)染色的支鏈淀粉的瓊脂平板在用于篩選提高的淀粉酶生產(chǎn)的平皿中使用。用Spizizen’s基本培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，其中葡萄糖替換為核糖。(Spizizen，1958.美國國家科學(xué)院學(xué)報44，1072-1078)。
α-淀粉酶分析用Phadebas淀粉酶檢測試劑盒(Pharmacia Diagnosics)測定培養(yǎng)上清中的淀粉酶活性，測定方法由Phadebas試劑盒提供。
實施例1基因失活(其產(chǎn)生α-淀粉酶生產(chǎn)能力提高了的芽孢桿菌)表達(dá)染色體上整合基因所編碼嵌合α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌菌株通過mini-Tn10轉(zhuǎn)座子pIC333誘變(Steinmetz，M and Tichter，R.1994，細(xì)菌學(xué)雜志。1725019)。所用菌株為DN1885xylR∷pCJ203，其表達(dá)嵌合α-淀粉酶AmyLQS55-4。該嵌合α-淀粉酶基因的確切組成和該菌株的構(gòu)建已公開(Christina lund Jensen(1997)，嵌合α-淀粉酶自枯草芽孢桿菌中的分泌，博士論文，丹麥工業(yè)大學(xué)(DTU))。轉(zhuǎn)座子整合到枯草芽孢桿菌染色體上可導(dǎo)致靶基因的失活；那些因這類失活而致淀粉酶生產(chǎn)增加的基因，可通過在含0.4％葡萄糖、0.01M磷酸鹽pH7、0.2％木糖、經(jīng)染色的支鏈淀粉、6μg/ml氯霉素和120μg/ml壯觀霉素的LB培養(yǎng)基上暈圈的形成，篩選嵌合α-淀粉酶AmyLQS55-4之生產(chǎn)增加的轉(zhuǎn)座子文庫而找到。
實施例2基因(SEQ ID NO1)的鑒定，其在枯草芽孢桿菌中失活后可使所述細(xì)胞增加α-淀粉酶的生產(chǎn)分離α-淀粉酶產(chǎn)量提高了的芽孢桿菌細(xì)胞，并依照下述方法鑒定基因(SEQ ID NO1)。
由于mini-Tn10包括pUC的復(fù)制起點，因此可輕易鑒定出因轉(zhuǎn)座子插入而失活的基因。為了挽救轉(zhuǎn)座子插入位置兩側(cè)的DNA序列，必須使用不在mini-Tn10轉(zhuǎn)座子內(nèi)部切割的限制性內(nèi)切酶。有幾種酶均可應(yīng)用于該目的，但本研究中使用了限制性內(nèi)切酶EcoRI。大多數(shù)情況下可獲得所需質(zhì)粒。除分離轉(zhuǎn)座子插入位點周圍的側(cè)翼區(qū)外，為檢測每個突變體中插入的轉(zhuǎn)座子個數(shù)，染色體DNA也用于Southern印跡分析。用EcoRI進(jìn)行的轉(zhuǎn)座子突變體的Southern印跡分析顯示大多數(shù)的突變體只包含一個插入。僅有兩個突變體在其染色體上插入了不止一個轉(zhuǎn)座子。
用EcoRI消化染色體DNA獲得了轉(zhuǎn)座子突變體的側(cè)翼區(qū)，然后將其連接并經(jīng)由穿孔轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SJ2的電感受態(tài)細(xì)胞中(Diderichsen，B.等，1990，細(xì)菌學(xué)雜志，1724315-4321)，用壯觀霉素(120μg/ml)抗性進(jìn)行篩選。所拯救的質(zhì)粒經(jīng)酶切分析驗證。用引物TKp1(5’-CCA ATA CGC AAA CGCCCT CTC-3’)和TKp2(5’-TAG TGA CAT TTG CAT GCT TC-3’)對所得質(zhì)粒進(jìn)行序列分析可鑒定因轉(zhuǎn)座子插入而失活的基因。DNA序列由自動測序儀確定。為了所靶向的基因，將所得的序列對照枯草芽孢桿菌的完整基因組進(jìn)行了分析(F.Kunst等，1997，自然390(20)249-256)。
通過分析實施例1中所獲得的突變體，證實了下述基因中的轉(zhuǎn)座子插入yjbH。轉(zhuǎn)座子插入在yjbH開放閱讀框中第711位核苷酸的后面。
實施例3在增加α-淀粉酶生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌中證實基因(SEQ ID NO1)的失活在營養(yǎng)十分豐富的培養(yǎng)基中延長生長的過程中α-淀粉酶的積累。使DN1885 xylR∷pCJ203菌株(其由染色體基因拷貝表達(dá)嵌合α-淀粉酶AmyLQS55-4)的yjbH轉(zhuǎn)座子突變體進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，將培養(yǎng)上清中積累的α-淀粉酶量與未經(jīng)誘變的親本株所積累的α-淀粉酶量相比較。在補(bǔ)充了0.2％木糖、6μg/ml氯霉素的BPX培養(yǎng)基中37℃發(fā)酵7天后，用Phadebas試驗測量培養(yǎng)上清中α-淀粉酶的活性。觀察到y(tǒng)jbH突變株的α-淀粉酶比野生型菌株的提高了40％。
穩(wěn)定生長期的枯草芽孢桿菌中α-淀粉酶的分泌DN1885 xylR∷pCJ203菌株(其由染色體基因拷貝表達(dá)嵌合α-淀粉酶AmyLQS55-4)的yjbH轉(zhuǎn)座子突變體也在添加了1％木糖和6μg/ml氯霉素的TY培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，以誘導(dǎo)α-淀粉酶的合成。在37℃培養(yǎng)期間，取樣測定細(xì)胞密度(OD660/ml)和培養(yǎng)上清中的α-淀粉酶活性(NU/ml)。未突變的菌株DN1885 xylR∷pCJ203做平行培養(yǎng)和取樣。用下列等式計算α-淀粉酶的特異性產(chǎn)率。
特異性產(chǎn)率＝(dP/dt)×(1/OD660)特異性產(chǎn)率(NU/min/OD660)P產(chǎn)量/培養(yǎng)上清中的活性(NU/ml)t生長時間(min)OD660細(xì)胞密度(OD660/ml)比活性可衡量給定時間段(此處指1min)內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生α-淀粉酶能力。為計算特異性產(chǎn)率，以時間的函數(shù)描述生長和以時間的函數(shù)描述α-淀粉酶活性的等式由生長實驗期間所獲數(shù)據(jù)來估算。然后用這兩個等式計算特異性產(chǎn)率。
觀察到y(tǒng)jbH突變株中α-淀粉酶的特異性產(chǎn)率比親代細(xì)胞的提高了。在對數(shù)期后期，該突變株的α-淀粉酶特異性產(chǎn)率比親代株高約70％。
對數(shù)生長的枯草芽孢桿菌細(xì)胞中α-淀粉酶的分泌。
枯草芽孢桿菌菌株DN1885 xylR∷pCJ199(Christina lund Jensen(1997)，嵌合α-淀粉酶自枯草芽孢桿菌中的分泌，博士論文，丹麥工業(yè)大學(xué)(DTU))由位于染色體上的一個基因拷貝表達(dá)地衣芽孢桿菌的野生型α-淀粉酶。通過用來自yjbH突變株DN1885 xylR∷pCJ203的染色體DNA轉(zhuǎn)化受體的感受態(tài)細(xì)胞，可將yjbH轉(zhuǎn)座子突變轉(zhuǎn)到該菌株中。通過壯觀霉素抗性進(jìn)行篩選。
對菌株DN1885 xylR∷pCJ199和yjbH突變體衍生物進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基是含1％核糖作為主要碳源的基本培養(yǎng)基，其中添加了6μg/ml氯霉素和1％木聚糖以誘導(dǎo)淀粉酶的合成。在37℃培養(yǎng)期間，取樣測定細(xì)胞密度(OD660/ml)和培養(yǎng)上清中α-淀粉酶的活性(NU/ml)。如上述計算α-淀粉酶的特異性產(chǎn)率。
在對數(shù)生長期內(nèi)，特異性產(chǎn)率在yjbH突變株中比在親代細(xì)胞中高約60％。
從這些數(shù)據(jù)可以清楚地看出，yjbH突變株中α-淀粉酶的生產(chǎn)比野生型細(xì)胞得到改善。
權(quán)利要求
1.一種具有增加的所需多肽生產(chǎn)的芽孢桿菌細(xì)胞，其中所述芽孢桿菌細(xì)胞以低于野生型的水平表達(dá)一種基因，該基因包括(a)如SEQ ID NO1中第1到828位所示的DNA序列；(b)與(a)項中所述DNA序列的同一性至少為70％的DNA序列；(c)編碼如SEQ ID NO2中第1到275位所示多肽序列的DNA序列；或(d)編碼與SEQ ID NO2中第1到275位所示的多肽序列同一性至少為70％的多肽序列的DNA序列。
2.一種具有增加的所需多肽生產(chǎn)的芽孢桿菌細(xì)胞，其中所述芽孢桿菌細(xì)胞以少于野生型的量表達(dá)一種基因，該基因包括(a)如SEQ ID NO1中第1到147位所示的DNA序列；(b)與(a)項中所述DNA序列的同一性至少為70％的DNA序列；(c)編碼如SEQ ID NO2中第1到49位所示多肽序列的DNA序列；或(d)編碼與SEQ ID NO2中第1到49位所示的多肽序列同一性至少為70％的多肽序列的DNA序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的芽孢桿菌細(xì)胞，其中所述基因位于遺傳標(biāo)記mecA和tenA之間。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項所述的芽孢桿菌細(xì)胞，其中的芽孢桿菌細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞，枯草芽孢桿菌細(xì)胞或解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的芽孢桿菌細(xì)胞，其中的芽孢桿菌細(xì)胞因所述基因的失活而以低于野生型的水平表達(dá)權(quán)利要求1或2的基因。
6.如權(quán)利要求1至5中任一項所述的芽孢桿菌細(xì)胞，其中所需多肽是酶，諸如蛋白酶，纖維素酶，脂肪酶，木聚糖酶，磷脂酶；或優(yōu)選淀粉酶。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項所述的芽孢桿菌細(xì)胞，其中所述基因包括SEQ ID NO3中第1到147位所示的DNA序列，或所述基因包括編碼如SEQ ID NO4中第1到49位所示多肽序列的DNA序列。
8.一種生產(chǎn)所需多肽的方法，其包括下列步驟(i)在允許所需多肽產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)上述權(quán)利要求中任一項所述的芽孢桿菌細(xì)胞；(ii)分離所需多肽。
全文摘要
具有增加的所需多肽生產(chǎn)的芽孢桿菌細(xì)胞和所需多肽的生產(chǎn)方法。通過抑制yjbH基因的表達(dá)提高產(chǎn)量。
文檔編號C12N15/09GK1347449SQ00806302
公開日2002年5月1日 申請日期2000年3月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月16日
發(fā)明者斯蒂恩·T·喬根森, 克里斯蒂娜·L·克里斯坦森, 蒂納·克里斯滕森 申請人:諾維信公司