專利名稱：海南隔指孢的絲氨酸蛋白酶基因及其克隆方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的食線蟲(chóng)真菌來(lái)源的胞外絲氨酸蛋白酶基因及其克隆方法。
背景技術(shù)：
植物寄生線蟲(chóng)是一類重要的植物病原微生物，每年造成巨大的損失。目前主要采 用殺線蟲(chóng)劑防治植物寄生線蟲(chóng)，但殺線蟲(chóng)劑通常毒性較高，污染環(huán)境。植物線蟲(chóng)的生物防治 越來(lái)越受到人們的重視。在線蟲(chóng)生物防治中，食線蟲(chóng)真菌是一類非常重要的線蟲(chóng)生防資源， 目前已有包括線必克等商品化的線蟲(chóng)生防制劑上市。真菌是植物線蟲(chóng)生物防治中研究較多的天敵生物，也是最為重要的生防因子之 一。研究表明海南隔指孢對(duì)防治線蟲(chóng)有很好的效果。在線蟲(chóng)侵染過(guò)程中，無(wú)論是對(duì)于線蟲(chóng) 蟲(chóng)體或者蟲(chóng)卵來(lái)說(shuō)，覆蓋于其表面的體壁或卵殼都是防止侵染的重要保護(hù)結(jié)構(gòu)。研究表明， 在食線蟲(chóng)菌物侵染線蟲(chóng)的過(guò)程中，主要是機(jī)械作用與蛋白酶水解酶共同作用的結(jié)果，其中 顯微結(jié)構(gòu)和組織化學(xué)的研究表明，至少在線蟲(chóng)體壁的刺入、線蟲(chóng)被侵入、線蟲(chóng)的消化等過(guò)程 中均有蛋白酶和水解酶的參與。蛋白酶能有效地降解線蟲(chóng)體壁，協(xié)助完成侵染過(guò)程，是線蟲(chóng) 侵染的重要毒力因子。因此，從食線蟲(chóng)菌物中獲取蛋白酶基因，利用生物基因工程技術(shù)對(duì)現(xiàn)有的生防菌 株基因組DNA進(jìn)行改造，增加蛋白酶基因的拷貝數(shù)和表達(dá)水平，對(duì)提高生防菌的防效具有 十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過(guò)對(duì)一株海南隔指孢真菌的研究，從食線蟲(chóng)菌物中獲取蛋白酶 基因，利用生物基因工程技術(shù)對(duì)現(xiàn)有的生防菌株基因組DNA進(jìn)行改造，增加蛋白酶基因的 拷貝數(shù)和表達(dá)水平，提供一種新的絲氨酸蛋白酶編碼基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述基因的克隆方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供所述基因的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)提供一種海南隔指孢的絲氨酸蛋白酶基因，具有表SEQ ID NO :1所示序列或表SEQ ID NO 3所示序列。本申請(qǐng)人從感染根結(jié)線蟲(chóng)的空心菜根結(jié)土壤中分離得到的一株對(duì)線蟲(chóng)具有很好 毒殺作用的隔指孢屬新種，命名為海南隔指孢(Dactylellahainanensis lg21_l)。菌株于 2010年2月4日保存于中國(guó)湖北武昌珞珈山中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO M 2010042。根據(jù)對(duì)GenBank所報(bào)道的食線蟲(chóng)真菌來(lái)源的絲氨酸蛋白酶的同源性分析，設(shè)計(jì)了 四條兼并引物，以海南隔指孢的基因組DNA作為模板擴(kuò)增得到蛋白酶編碼基因的保守序 列，并通過(guò)RACE技術(shù)擴(kuò)增得到3'端和5'端未知的基因序列，把序列拼接得到海南隔指孢胞外絲氨酸蛋白酶編碼基因的全序列。所述基因的獲得包括以下步驟(1)收集固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)的海南隔指孢，采用CTAB法提取總DNA ；(2)選擇GenBank上真菌絲氨酸蛋白酶cDNA序列保守區(qū)，利用ClustalX軟件進(jìn)行 同源性分析，設(shè)計(jì)二對(duì)兼并引物，以海南隔指孢基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)利用RACE技術(shù)擴(kuò)增蛋白酶3'端和5'端未知的基因序列；(4)根據(jù)cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)一對(duì)覆蓋ORF的特異引物，分別以海南隔指孢cDNA和 DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增獲得海南隔指孢的DhCSP的cDNA序列1218bp，序列表如SEQ ID NO :1，基因組編碼區(qū)序列1270bp，編碼區(qū)包含1個(gè)內(nèi)含子，序列表如SEQ ID NO :2。此外， DhSLP的cDNA序列1577bp，序列表如序列表如SEQ ID NO :3，基因組編碼區(qū)序列1899bp，編 碼區(qū)包含2個(gè)內(nèi)含子，序列表如SEQ ID NO :4。所述的海南隔指孢所述海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)， (D. hainanensis)，菌株形態(tài)特征為CMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落近無(wú)色，生長(zhǎng)較緩慢，25°C暗 培養(yǎng)lld，菌落可達(dá)6. 8cm ；周邊菌絲透明，有隔，通常寬度在2. 5 4. 5 μ m。分生孢子棒 狀，頂端鈍圓，長(zhǎng)17. 7 40. 5(27. 7) μ m，寬4. 8 10.1(7. 0) μ m，分生孢子多數(shù)為孢子 梗頂部單端生，少頂部多生，最多不超過(guò)4個(gè)，分生孢子梗無(wú)色，直立，有分隔，長(zhǎng)146. 7 260. 6 μ m，基部寬2. 0 4. 0 μ m，端部約2. 0 μ m，端部少數(shù)頂部分枝。分生孢子有0 4 個(gè)隔，大多數(shù)1 3個(gè)分隔。老熟菌絲易生厚垣孢子，厚垣孢子近圓形，直徑大小一般在 7. 5 12. 5 (11. 3) μ m。菌株的捕食器官為黏性球，黏性球的柄長(zhǎng)5 27. 5 μ m，柄寬2. 3 3. 2 μ m，球部長(zhǎng)5. 0 10. 0 μ m，寬4. 5 9. 0 μ m。多數(shù)黏性球的柄垂直伸出菌絲生長(zhǎng)。所述lg21_l菌的制備方法，包括試管種培養(yǎng)、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)或固體培養(yǎng)基培養(yǎng) 方法。所述試管種培養(yǎng)基配方為馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA) :200g馬鈴薯，20g葡萄糖，20g 瓊脂粉，IOOOml水；方法為將D. hainanensis菌絲體接種到PDA培養(yǎng)基斜面上，20 30°C 下培養(yǎng)6 12天，得到試管種。所述液體培養(yǎng)基可采用LMZ培養(yǎng)液，配方為每一升磷酸緩沖液中含2g明膠、8g 胰蛋白胨、Ig 酵母浸出粉、0. 5g (NH4)2SO4^O. OlgFeSO4 · 7Η20、0· 5g MgSO4 · 7H20，所磷酸緩沖 液組成為 11. 28gNa2HP04 · 12Η20/10· 687g NaH2PO4 · 2H20, pH 6· 5?；蛘卟捎肔MZ+B. χ培養(yǎng)液，配方為加入約1000條松材線蟲(chóng)的LMZ培養(yǎng)液。液體培養(yǎng)方法是每個(gè)250mL三角瓶裝50mL培養(yǎng)液，濕熱滅菌后，冷卻。接活化的 海南隔指孢菌圓片，每瓶5片。在180轉(zhuǎn)/min 28士2°C情況下，暗培養(yǎng)8d，中性中速濾紙無(wú) 菌過(guò)濾，濾液保存于4°C冰箱中待用。所述固體培養(yǎng)基CMA配方為20g玉米粉，15g瓊脂粉，IOOOml水。培養(yǎng)方法是每個(gè) 90mm的培養(yǎng)皿中倒入約1/3厚的培養(yǎng)基，接種D. hainanensis后，用封口膜封口后于25°C 下培養(yǎng)6 12天。步驟(1)所述的真菌基因組DNA的提取方法如下(a)用解剖刀刮取PDA平板上25°C培養(yǎng)IOd的菌絲在液氮中研磨成粉狀；將菌絲 粉迅速置入1. 5mL的液氮預(yù)冷離心管中，每管0. 3g ；(b)用500 μ L DNA抽提緩沖液懸浮并加入50 μ L 20 % SDS (十二烷基磺酸鈉)，輕輕混合，37 °C處理Ihr ；所述DNA抽提緩沖液為IOOmM Tris-HCl (三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽)、750mM NaCl (氯化鈉)和40Mm EDTA (乙二胺四乙酸)(c)往步驟(b) 37 0C處理Ihr后的液體中加入75 μ L的5Μ NaCl禾Π 65 μ L CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)溶液(0. 75Μ NaCl含10% (質(zhì)量百分比濃度)CTAB)，65°C 水浴20min ；
(d)加入與步驟(c)水浴處理后的液體等體積的酚-氯仿-異戊醇(25 24 1) 抽提，5000g離心lOmin，取上清；(e)重復(fù)步驟d ；(f)加 2 μ L RNase (核糖核酸酶)(10mg/mL) 37°C處理 30min ；(g)加入與步驟(f)處理后的液體等體積的異丙醇混勻，5000g離心IOmin沉淀 DNA ；(h)用0.5mL 70% (體積百分比濃度)的酒精洗劑沉淀，離心2min，到掉酒精，風(fēng)
干沉淀；(i)力口 30 μ L TEdOmM Tris-HCl, IMm EDTA, ρΗ8· 0)重新懸浮 DNA ；(j)每個(gè)樣取2 μ L，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度。步驟(2)所述的兼并引物為CSPdupl 5' -ATYRMBGRYAARTACATYGTCR-3‘；CSPddownl 5' -CCNG⑶GCVMARAYRTCRA-3‘；CSPdup2 5' -CAYGGHACHCACTGYGCHG-3‘；CSPddown2 5' -CATVGARGTRCCVGAGATG-3‘。兼并堿基代碼=H= A/C/T，Y = C/T，W = Α/Τ, M = A/C，R = A/G，K = G/T。步驟(3)包括以下步驟(A)根據(jù)兩個(gè)海南隔指孢的絲氨酸蛋白酶基因片段分別設(shè)計(jì)特異上游引物 DhCSP3，U0/DhSLP3，UO和通用引物UPM進(jìn)行第一輪的PCR反應(yīng)；(B)分別取步驟(a)所得的PCR產(chǎn)物作為模板，以DhCSP3’ U0/DhSLP3’ UO和通用 引物NUP為引物進(jìn)行第二輪PCR，測(cè)序得到3'端序列；(C)根據(jù)上述3'端序列，設(shè)計(jì)特異下游引物DhCSP5，D0/DhSLP5，DO和通用引物 UPM進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)；(D)取步驟(c)所得的PCR產(chǎn)物為模板，以DhSLP5，D0/DhSLP5，D0和通用引物NUP 為引物進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)；(E)利用SeqMan軟件將上述片段進(jìn)行拼接，得到二個(gè)cDNA全長(zhǎng)片段。一條為 1743bp，命名為 DhCSP，一條為 1867bp，命名為 DhSLP。步驟(A)和步驟⑶所述的引物為DhCSP3‘ UO 5' -CAGGTGTCGTGAGTGGAATGAACTGGGTC-3‘DhSLP3‘ UO 5' -ACCCTCGCTGACGACCGTGCCTACT-3‘步驟(C)和步驟(D)所述的引物為DhCSP5‘ DO 5' -CCAGGTGGCATCGGTTTGTTCCGTATT-3‘DhSLP5，DO 5 ‘ -TTGAAGCCCTTCTCGCTCTTGGATTTCT-3‘
步驟(4)所述特異引物為DhCSP基因全長(zhǎng)引物DhCSPHup 5' -ATGTTGAGCCAAGGTTTCATCT-3‘DhCSPHdown 5' -TCAAGCATAACCATTGTATCCAA-3‘DhSLP基因全長(zhǎng)引物DhSLPHup 5' -AAAATGAAGTTGACAAAGTCCTTGATGG-3‘DhSLPHdown 5' -GGCATTGTGGCAGTCAGGTGAAG-3‘所述海南隔指孢絲氨酸基因的克隆方法還包括利用NCBI上的核苷酸序列同源性分析工具 BLASTN (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)進(jìn)行分析，并用 BioEdit 進(jìn)行同 源性分析，對(duì)兩個(gè)基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，確認(rèn)兩個(gè)海南隔指孢的胞外絲 氨酸蛋白酶基因。根據(jù)本發(fā)明提供的基因序列信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以通過(guò)以下方法容易地獲 得等同的基因(1)通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得；(2)根據(jù)所述基因序列信息設(shè)計(jì)引物，用PCR擴(kuò) 增的方法從其它基因組、mRNA和cDNA中獲取；(3)在所述基因序列的基礎(chǔ)上用基因工程方 法改造獲得；(5)用化學(xué)合成的方法獲得。本發(fā)明所述的基因可應(yīng)用于生防工程菌的改造。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了一對(duì)新的絲氨酸蛋白酶基因。本發(fā)明為利用生物工程技術(shù)將海南隔 指孢絲氨酸蛋白酶基因轉(zhuǎn)化其它的線蟲(chóng)生防真菌、實(shí)現(xiàn)該基因的異源表達(dá)、提高線蟲(chóng)生防 真菌絲氨酸蛋白酶的表達(dá)量和對(duì)植物寄生線蟲(chóng)的生防能力提供重要的技術(shù)基礎(chǔ)。


圖1兩個(gè)絲氨酸蛋白酶基因在線蟲(chóng)誘導(dǎo)下不同時(shí)間的表達(dá)情況電泳2利用軟件AlphaImager分析的基因表達(dá)量
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1 真菌的分離與鑒定和培養(yǎng)及DNA的提取1、土樣的采集和菌株的分離土樣的采集采集于感染根結(jié)線蟲(chóng)的空心菜的根際土樣，取土樣時(shí)將表層干土去 除，取5 20cm層的土樣300g裝袋。土壤菌株的分離在WA平板上撒土 0.5 1. Og 土樣，接入全齒復(fù)活線蟲(chóng) (Panagrellus redivius)(來(lái)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，也可以采用本領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)用的同 類線蟲(chóng))，培養(yǎng)一周，鏡檢并用針挑取單個(gè)的真菌分生孢子于含氯霉素50ppm+硫酸鏈霉素 IOOppm的PDA平板上，純化真菌。2、形態(tài)鑒定挑取PDA平板上純化的菌株，接種于CMA平板25°C暗培養(yǎng)lld，測(cè)量菌落直徑，在 培養(yǎng)皿內(nèi)直接觀察菌落形態(tài)；在顯微鏡下觀察并拍照孢子在孢子梗上的著生形態(tài)，在皿內(nèi) 加入4ml 0. 5% Tween80溶液輕輕振蕩，吸取20 μ L于凹玻片上，于顯微鏡下觀察厚垣孢子和分生孢子的形態(tài)，并測(cè)量孢子大小及拍照，同時(shí)計(jì)數(shù)不同隔數(shù)的分生孢子的個(gè)數(shù)和計(jì)算比率。3、培養(yǎng)(1)試管種培養(yǎng) 培養(yǎng)基配方為馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA) :200g馬鈴薯，20g葡萄糖，20g瓊脂粉， IOOOml水。將D. hainanensis菌絲體接種到PDA培養(yǎng)基斜面上，20 30°C下培養(yǎng)6 12 天，得到試管種。(2)固體培養(yǎng)將海南隔指孢(D. hainanensis Y. Z. Li et J. L. Liao, sp. nov.) lg21_l 菌保存菌 接種到CMA培養(yǎng)基(組成20g玉米粉，15g瓊脂粉，IOOOml水)進(jìn)行活化，然后接種到Y(jié)MA 培養(yǎng)基(組成2g酵母浸出粉，20g麥芽糖，IOOOml水)上(直徑75mm培養(yǎng)皿)，25°C下暗 培養(yǎng)16d。將菌保存于4°C冰箱中待用，或直接配備孢子培養(yǎng)液使用。(3)液體培養(yǎng)選用LMZ液(Zhao et al，2004)或LMZ+B. χ作為培養(yǎng)液，每個(gè)250mL三角瓶裝50mL 培養(yǎng)液，濕熱滅菌后，冷卻。接活化的海南隔指孢菌圓片，每瓶5片。在180轉(zhuǎn)/min 28 士 2°C 情況下，暗培養(yǎng)8d，中性中速濾紙無(wú)菌過(guò)濾，濾液保存于4°C冰箱中待用。LMZ液配方為每1升磷酸緩沖液中含2g明膠，8g胰蛋白胨，Ig酵母 浸出粉，0.5g (NH4)2SO4,0.0Ig FeSO4 · 7Η20，0. 5g MgSO4 · 7H20，磷酸緩沖液為 11. 28gNa2HP04 · 12Η20/10· 687g NaH2PO4 · 2H20, pH 6. 5 ；LMZ+B. χ 培養(yǎng)液配方為加入約 1000 條松材線蟲(chóng)的LMZ培養(yǎng)液。所述松材線蟲(chóng)來(lái)源于農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)設(shè)立的線蟲(chóng)學(xué)和殺線活性物研 究機(jī)構(gòu)一華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物線蟲(chóng)研究室，也可以采用本領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)室常規(guī)實(shí)驗(yàn)使用的松材線 蟲(chóng)。4、捕食器的觀察接種分離純化的菌株于CMA平板的培養(yǎng)皿內(nèi)25°C暗培養(yǎng)7d，加入全齒復(fù)活線蟲(chóng) (Pnanagrellus redivivus)約500條(250 μ L)，25°C暗培養(yǎng)3d。顯微鏡下觀查捕食器形態(tài) 并測(cè)量其大小。5、分子鑒定(1)基因組DNA的提取(a)用解剖刀刮取PDA平板上25°C培養(yǎng)IOd的菌絲在液氮中研磨成粉狀；將菌絲 粉迅速放入1. 5mL的液氮預(yù)冷離心管中，每管0. 3g ；(b)用 500 μ L DNA 抽提緩沖液懸浮(IOOmM Tris-HCl, 750mM NaCl, 40Mm EDTA)， 并加入50 μ L 20% SDS輕輕混合，37°C處理Ihr ；(c)加入 75 μ L 的 5Μ NaCl 禾口 65 μ L CTAB 溶液(0. 75Μ NaCl 含 10% CTAB)，65°C 水浴20min ；(d)加入等體積的酚-氯仿-異戊醇(25 24 1)抽提，離心(5000g，10min)，
取上清；(e)重復(fù)步驟d;(f)力卩 2 μ L RNase (10mg/mL) 37°C處理 30min ；(g)加入等體積的異丙醇混勻，5000g，離心IOmin沉淀DNA ；
(h)用0. 5mL 70%的酒精洗劑沉淀，離心2min，到掉酒精，風(fēng)干；(i)力口 30 μ L TEdOmM Tris-HCl, IMm EDTA, ρΗ8· 0)重新懸浮 DNA ；(j)每個(gè)樣取2 μ L，Marker2000取5 μ L，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度。2) ITS 區(qū)的 PCR 擴(kuò)增以菌株的基因組DNA為模板，用真菌通用引物ITSl和ITS4擴(kuò)增ITS區(qū)的片段，ITS 序列如表SEQ ID NO 5所示。ITSl 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3‘ITS4 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘反應(yīng)體系模板lyL;10x緩沖液 2.5yL;4x dNTP 0. 5yL;引物 ITSl IyL;引物 ITS4 1 μ L ；酶0. 25 μ L ；水18. 75 μ L。以不加模板為陰性對(duì)照。反應(yīng)程序94"C 5min ；94 "C 30sec — 55 "C 30sec — 72 "C lmin, 35 個(gè)循環(huán)； 720C 2min ；4°C ⑴。PCR產(chǎn)物切膠回收，連接到pMD-18T載體，最后轉(zhuǎn)化克隆送交上海英駿生物技術(shù)有 限公司測(cè)序。3)序列分析序列分析的結(jié)果通過(guò)國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行序列同源性檢索，檢索主程序采用BLASTN， 即核酸序列對(duì)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，序列分析采用DNA Star軟件進(jìn)行。比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)海南隔指孢與3個(gè)近似種，即弱捕隔指孢、D. querci和回筍隔指孢 的相似性分別為77. 9%、82%和84. 7%，進(jìn)一步證明該新種與這3個(gè)近似種為不同種。實(shí)施例2 海南隔指孢的胞外絲氨酸蛋白酶基因的克隆以海南隔指抱(Dactylella hainanensis Y. Z. Li et J. L. Liao, sp. nov.)的基因 組DNA作為模板，首先用兼并引物擴(kuò)增得到蛋白酶的保守基因序列，再用RACE技術(shù)擴(kuò)增未 知的3'端和5'端序列，最后拼接得到完整的蛋白酶編碼基因序列。海南隔指孢的培養(yǎng)和海南隔指孢DNA的提取同實(shí)施例1。選擇GenBank上絲氨酸蛋白酶基因序列，利用ClustalX軟件進(jìn)行同源性分析，根 據(jù)保守序列設(shè)計(jì)二對(duì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增獲得海南隔指孢絲氨酸蛋白酶基因的兩片段，分別為 912bp和489bp ；簡(jiǎn)并引物分別為912bp片段的引物CSPdup1:5' -ATYRMBGRYAARTACATYGTCR-3‘CSPddown 1:5' -CCNG ⑶ GCVMARAYRTCRA-3 ‘489bp片段的引物CSPdup2 5‘ -CAYGGHACHCACTGYGCHG-3‘CSPddown2 5‘ -CATVGARGTRCCVGAGATG-3‘兼并堿基代碼=H= A/C/T，Y = C/T，W = Α/Τ, M = A/C，R = A/G，K = G/T。
PCR擴(kuò)增體系為(共25 μ 1):上游引物CSPdupl/CSPdup2(10ymol/L)0. 5 μ 1下游引物CSPddownl/CSPddown2 (10 μ mol/L) 0. 5 μ 1IOXBuffer2. 5 μ 1
Taq 酶(5U/ μ 1)0. 125 μ 1dNTP (IOmM)0. 5 μ 1滅菌ddH2010. 875 μ 1
DNA 模板1 μ 1PCR反應(yīng)程序
94°C4 rain
94°C30 sec一
55°C30 sec35 Cycle
72 °C1 min~~
72°C5 min
4 °C根據(jù)絲氨酸蛋白酶基因片段設(shè)計(jì)特異引物，運(yùn)用SMART RACE RT-PCR技術(shù)從海南 隔指孢cDNA —鏈中獲得基因5’端和3’端序列，將三段序列進(jìn)行拼接得到cDNA全長(zhǎng)序列； 一條為1743bp，命名為DhCSP，一條為1867bp，命名為DhSLP。(a)根據(jù)海南隔指孢絲氨酸蛋白酶基因片段，分別設(shè)計(jì)一條特異上游引物 DhCSP3’ U0/DhSLP3’ UO和通用引物UPM進(jìn)行第一輪的PCR反應(yīng)，隨后以第一輪PCR產(chǎn)物作 為模板，以DhCSP3，U0/DhSLP3，UO和通用引物NUP為引物進(jìn)行第二輪PCR，進(jìn)行3‘ RACE 末端擴(kuò)增；(b)根據(jù)上述3'端基因片段，設(shè)計(jì)特異下游引物DhCSP5，D0/DhSLP5，DO與UPM short接頭引物和巢式錨定引物NUP配對(duì)；(c)利用SeqMan軟件將上述片段進(jìn)行拼接，得到cDNA全長(zhǎng)片段，一條為1743bp， 命名為DhCSP，一條為1867bp，命名為DhSLP。(a) 3' RACE根據(jù)海南隔指孢絲氨酸蛋白酶基因片段，分別設(shè)計(jì)一條特異上游引物DhCSP3’U0/ DhSLP3’ UO和通用引物UPM及NUP進(jìn)行二輪PCR，進(jìn)行3' RACE末端擴(kuò)增。特異上游引物 為DhCSP3' UO 5' -CAGGTGTCGTGAGTGGAATGAACTGGGTC-3‘DhSLP3' UO 5' -ACCCTCGCTGACGACCGTGCCTACT-3‘第一輪PCR擴(kuò)增體系為(共50 μ 1)IOXEx Taq Buffer5μ 1Ex Taq (2. 5U/μ 1)0. 25 μ 1上游引物DhCSP3，U0/DhSLP3，U0(10 μ mol/L) 1 μ 1通用引物UPM5μ 1dNTP(各 2· 5mmol/L)4μ 1
滅菌ddH2032. 25 μ 1cDNA 模板2. 5μ1PCR 反應(yīng)程序94°C2min
940C30 sec—ι
J 5 Cycle
72 °C1 min
94°C30 sec—
5 Cycle
70 °C1 min
940C30 sec—
20 Cycle
68°C30 sec
72 °C1 min
72°C2 min4 "C①第二輪PCR擴(kuò)增體系為(共25 μ 1)IOXBuffer5μ 1Ex Taq (5U/μ 1)0. 25 μ 1NUP(10ymol/L)1 μ 1上游引物DhCSP3，U0/DhSLP3，UO (各 lOymol/L) 1 μ 1dNTP (各 10mmol/L)1 μ 1滅菌ddH2041. 65 μ 1第一輪PCR 產(chǎn)物0. 1 μ 1第二輪PCR反應(yīng)程序
940C30 sec —
c on25 Cycle
60 C30 sec
72 0C1 min
720C2 min
4 °C(b)5' RACE根據(jù)上述3'端基因片段，設(shè)計(jì)特異下游引物DhCSP5，D0/DhSLP5，DO與BD SMARTRACE cDNA Amplication Kit中的UPM short接頭引物及巢式錨定引物NUP配對(duì)，通過(guò)兩輪 PCR進(jìn)行5' RACE末端擴(kuò)增。特異下游引物為DhCSP5' DO 5' -CCAGGTGGCATCGGTTTGTTCCGTATT-3‘DhSIiV DO :5' -TTGAAGCCCTTCTCGCTCTTGGATTTCT-3‘第一輪PCR擴(kuò)增體系為(共50μ1):IOXEx Buffer5μ 1 Ex Taq (5U/μ 1)0. 25 μ 1上游引物UPM5μ 1下游引物DhCSP5，D0/DhSLP5，D0(10 μ mol/L) 1 μ 1dNTP (各 2. 5mmol/L)4 μ 1滅菌ddH2032. 25 μ 1cDNA 模板2. 5μ 1第一輪PCR反應(yīng)程序
94"C30 sec—.
J 5 Cycle
72 °C1 min
94°C30 sec
5 Cycle
70 0C1 min」
940C30 sec—
20 Cycle
680C30 sec〕
72 °C1 min
72 0C2 min
4 °C00第二輪PCR擴(kuò)增體系為(共50μ1):IOXBuffer5μ 1Ex Taq (5U/μ 1)0. 25 μ 1NUP (10 μ mol/L)1 μ 1下游引物DhCSP5，D0/DhSLP5，DO (10 μ mol/L)1 μ 1dNTP (各 lOmmol/L)1 μ 1滅菌ddH2041. 65 μ 1第一輪PCR 產(chǎn)物Ο. μ 第二輪PCR反應(yīng)程序
94°C30 sec—
60°C30 sec25 Cycle
72 °C1 min
72°C2 min
4 0C(c)序列分析利用SeqMan軟件、DNAStar和ClustalX軟件進(jìn)行序列拼接和分析。序列分析的 結(jié)果通過(guò)國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行序列同源性檢索，檢索主程序采用BLASTN和BLASTX，即核酸序列 對(duì)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索和氨基酸序列對(duì)氨基酸序列的檢索，序列分析在NCBI進(jìn)行。根據(jù)絲氨酸蛋白酶cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)一對(duì)覆蓋ORF的特異引物，以海南隔指孢 cDNA和DNA為模板，擴(kuò)增獲得海南隔指孢的DhCSP的cDNA序列1218bp，序列表如SEQ ID NO :1，基因組編碼區(qū)序列1270bp，編碼區(qū)包含1個(gè)內(nèi)含子，序列表如SEQ ID NO :2。此外， DhSLP的cDNA序列1577bp，序列表如序列表如SEQ ID NO :3，基因組編碼區(qū)序列1899bp，編 碼區(qū)包含2個(gè)內(nèi)含子，序列表如SEQ ID NO :4。根據(jù)cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)一對(duì)覆蓋ORF的特異引物，以海南隔指孢cDNA和DNA為 模板進(jìn)行該基因組編碼區(qū)的擴(kuò)增。特異引物為DhCSP基因全長(zhǎng)引物DhCSPHup 5' -ATGTTGAGCCAAGGTTTCATCT-3‘DhCSPHdown 5' -TCAAGCATAACCATTGTATCCAA-3‘DhSLP基因全長(zhǎng)引物DhSLPHup 5' -AAAATGAAGTTGACAAAGTCCTTGATGG-3‘DhSLPHdown 5' -GGCATTGTGGCAGTCAGGTGAAG-3‘PCR擴(kuò)增體系為(共50 μ 1)IOXEx Buffer5μ 1Ex Taq (5U/μ 1)0. 25 μ 1上游引物DhCSPHup/DhSLPHup(10ymol/L)1 μ 1下游引物DhCSPHdown/DhSLPHdown (10 μ mol/L) 1 μ 1dNTP (各 2. 5mmol/L)4 μ 1滅菌 ddH2035. 75 μ 1cDNA/DNA 模板1 μ 1PCR反應(yīng)程序 應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)克隆出的兩個(gè)絲氨酸基因部分序列IgCSP和IgSLP進(jìn) 行RNA水平上的表達(dá)情況的研究。選用RNA聚合酶II的第2亞基RPB2基因?yàn)閮?nèi)參。RT-PCR 的特異引物為IgCSP RT-PCR 特異引物DhCSPRTup3 5' -TTAGTAGCCGTCAAGGTTCTCAG-3‘DhCSPRTdown3 5' -GCACCCACCGTTATAGCATTT-3‘IgSLP RT-PCR 特異引物DhSLPRTup 5' -GCCGGTAAGAAGTACGGTGTC-3‘DhSLPRTdown 5' -TTGCCGTGGTTGGAGAAGTAG-3‘內(nèi)參RPB2基因RT-PCR特異引物RPB2RTup3 5' -CCCGCCCGCTTTATGTTATT-3‘RPB2RTdown3 5' -GGTGTTACGAGGAGACTGATTGTG-3‘PCR擴(kuò)增體系為(共50 μ 1)IOXEx Buffer5μ 1Ex Taq (5U/μ 1)0. 25 μ 1上游引物(10ymol/L)1μ 1下游引物(10ymol/L)Ιμ dNTP (各 2· 5mmol/L)4 μ 1滅菌ddH2035. 75 μ 1 cDNA/DNA 模板1 μ 1PCR反應(yīng)程序 結(jié)果顯示，在加入線蟲(chóng)后兩個(gè)基因的表達(dá)均隨時(shí)間的變化而變化，均在真菌捕捉 線蟲(chóng)的過(guò)程中表達(dá)量提高，加蟲(chóng)后48hr時(shí)出現(xiàn)表達(dá)最高峰，見(jiàn)附圖1和附圖2所示，表明這 兩個(gè)基因在菌株侵入線蟲(chóng)的過(guò)程中起作用。附圖1為兩個(gè)絲氨酸蛋白酶基因在線蟲(chóng)誘導(dǎo)下不同時(shí)間的表達(dá)情況電泳圖。附圖 2為利用軟件Alphalmager分析的基因表達(dá)量(基因表達(dá)量=目的基因表達(dá)量/內(nèi)參基因 表達(dá)量)。
權(quán)利要求
一種海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21-1)的絲氨酸蛋白酶基因，其特征在于具有如表SEQ ID NO1所示序列。
2.一種海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)的絲氨酸蛋白酶基因，其特征 在于具有如表SEQ ID NO 3所示序列。
3.—種權(quán)利要求1或2所述基因的克隆方法，其特征在于包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)二對(duì)兼并引物擴(kuò)增獲得兩個(gè)海南隔指孢絲氨酸蛋白酶基因的片段； 所述兼并引物為CSPdupl 5' -ATYRMBGRYAARTACATYGTCR-3‘； CSPdup2 5' -CAYGGHACHCACTGYGCHG-3‘； CSPddownl 5' -CCNG⑶GCVMARAYRTCRA-3‘； CSPddown2 5' -CATVGARGTRCCVGAGATG-3‘；簡(jiǎn)并堿基代碼:H = A/C/T，Y = C/T，W = Α/Τ, M = A/C，R = A/G，K = G/T ；(2)根據(jù)絲氨酸蛋白酶基因片段設(shè)計(jì)特異引物，從海南隔指孢cDNA—鏈中獲得基因 5'端和3'端序列，將三段序列進(jìn)行拼接得到cDNA全長(zhǎng)序列；(3)根據(jù)海南隔指孢cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)一對(duì)覆蓋ORF的特異引物，以海南隔指孢DNA 為模板，擴(kuò)增獲得海南隔指孢的絲氨酸蛋白酶基因序列；所述特異引物為 DhCSP基因全長(zhǎng)引物DhCSPHup 5‘ -ATGTTGAGCCAAGGTTTCATCT-3‘； DhCSPHdown 5‘ -TCAAGCATAACCATTGTATCCAA-3‘； DhSLP基因全長(zhǎng)引物DhSLPHup 5' -AAAATGAAGTTGACAAAGTCCTTGATGG-3‘； DhSLPHdown 5' -GGCATTGTGGCAGTCAGGTGAAG-3‘。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述克隆方法，其特征在于步驟(2)包括以下步驟(a)根據(jù)海南隔指孢絲氨酸蛋白酶基因片段設(shè)計(jì)特異上游引物DhCSP3’UO及 DhSLP3’ U0，與UPM配對(duì)，進(jìn)行3' RACE末端擴(kuò)增，獲得包含3‘端基因片段的序列；(b)根據(jù)步驟(a)所得3'端基因片段，設(shè)計(jì)特異下游引物DhCSP5，DO和DhSLP5，DO 分別與BD SMART RACE cDNA Amplication Kit中的UPM short接頭引物和巢式錨定引物 NUP配對(duì)，擴(kuò)增獲得包含5'端基因片段的序列；(c)將包含3'端基因片段和包含5'端基因片段進(jìn)行拼接，得到cDNA全長(zhǎng)片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述克隆方法，其特征在于步驟(a)所述特異上游引物為 DhCSP3‘ UO 5' -CAGGTGTCGTGAGTGGAATGAACTGGGTC-3‘；DhSLP3‘ UO 5' -ACCCTCGCTGACGACCGTGCCTACT-3‘。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述克隆方法，其特征在于步驟(b)所述特異下游引物為 DhCSP5‘ DO 5' -CCAGGTGGCATCGGTTTGTTCCGTATT-3‘；DhSLP5，DO 5 ‘ -TTGAAGCCCTTCTCGCTCTTGGATTTCT-3‘。并應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)克隆出的兩個(gè)絲氨酸基因進(jìn)行RNA水平上的表達(dá)情況的 研究，在加入線蟲(chóng)后兩個(gè)基因的表達(dá)均在真菌捕捉線蟲(chóng)的過(guò)程中提高，表明這兩個(gè)基因在 菌株侵入線蟲(chóng)的過(guò)程中起作用。
7.—種權(quán)利要求1或2所述基因的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于生防工程菌的改造。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于是應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)所述基因加入 線蟲(chóng)后檢測(cè)所述基因的表達(dá)量。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述半定量RT-PCR的特異引物為 IgCSP基因RT-PCR特異引物DhCSPRTup35‘ -TTAGTAGCCGTCAAGGTTCTCAG-3‘DhCSPRTdown3 5' -GCACCCACCGTTATAGCATTT-3‘； IgSLP基因RT-PCR特異引物 DhSLPRTup5‘ -GCCGGTAAGAAGTACGGTGTC-3‘DhSLPRTdown 5' -TTGCCGTGGTTGGAGAAGTAG-3‘； 內(nèi)參RPB2基因RT-PCR特異引物 RPB2RTup35‘ -CCCGCCCGCTTTATGTTATT-3‘RPB2RTdown3 5' -GGTGTTACGAGGAGACTGATTGTG-3‘。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了海南隔指孢的絲氨酸蛋白酶基因，基因的序列表如SEQID NO1或SEQ ID NO3所示。本發(fā)明同時(shí)公開(kāi)了所述海南隔指孢的絲氨酸蛋白酶基因的克隆方法。并應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)克隆出的兩個(gè)絲氨酸基因進(jìn)行RNA水平上的表達(dá)情況的研究，在加入線蟲(chóng)后兩個(gè)基因的表達(dá)均在真菌捕捉線蟲(chóng)的過(guò)程中提高，表明這兩個(gè)基因在菌株侵入線蟲(chóng)的過(guò)程中起作用。本發(fā)明為利用生物工程技術(shù)將海南隔指孢絲氨酸蛋白酶基因轉(zhuǎn)化其它的線蟲(chóng)生防真菌、實(shí)現(xiàn)該基因的異源表達(dá)、提高線蟲(chóng)生防真菌絲氨酸蛋白酶的表達(dá)量和對(duì)植物寄生線蟲(chóng)的生防能力提供重要的技術(shù)保證。
文檔編號(hào)C12N15/57GK101845448SQ20101018126
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者卓侃, 廖金鈴, 李玉中, 羅梅 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)