專利名稱：一種檢測無鱗魚致病菌溫和氣單胞菌的方法和檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚類致病菌的檢測技術(shù)，特別是無鱗魚致病菌溫和氣單胞菌的檢 測方法和檢測試劑盒以及相應(yīng)的引物。
背景技術(shù)：
隨著大口鯰、斑點(diǎn)叉尾鮰等名貴經(jīng)濟(jì)無鱗魚的高密度養(yǎng)殖，細(xì)菌性疾病的發(fā)生日 益嚴(yán)重，特別是苗種階段尤其明顯。因此，只有不斷地完善防治方法，認(rèn)真貫徹“全面預(yù)防， 積極治療”的方針，才能收到預(yù)期的防病效果。預(yù)防疾病的一個(gè)重要基礎(chǔ)是判斷養(yǎng)殖水體中 或魚體內(nèi)中是否存在某些特定的魚類致病菌以及已經(jīng)存在的致病菌的種類和數(shù)量，從而才 能夠采取合適的方法對(duì)癥下藥。因此，如何快速、準(zhǔn)確地檢測和判斷某些細(xì)菌的感染，以有 助于闡明其致病機(jī)理，及時(shí)治療和控制魚病的發(fā)生，一直就是眾人所努力攻克的難題。目前，針對(duì)致病菌的檢測和診斷技術(shù)多種多樣，包括選擇性培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng) 法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(D0T-ELISA)、單克隆抗體技術(shù) (Monoclonal Antibody Technique)等。這些方法各有其特點(diǎn)，但在生產(chǎn)應(yīng)用中多表現(xiàn)出 培養(yǎng)時(shí)間較長、只能用于粗略檢測，不甚精確、敏感性和特異性差等不足。而在檢測和診斷 技術(shù)中，聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChain Reaction, PCR)因其具有的簡便、快速、敏感、特 異、適于早期和大量樣品檢測的優(yōu)點(diǎn)，已在該研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但是對(duì)于無鱗魚中斑 點(diǎn)叉尾鮰和大口鯰主要致病菌柱狀黃桿菌和溫和氣單胞菌，目前國內(nèi)尚沒有相關(guān)的PCR檢 測技術(shù)方面的研究報(bào)告。為了及時(shí)監(jiān)控?zé)o鱗魚養(yǎng)殖中的魚病發(fā)生，迫切需要一種能快速檢測魚體內(nèi)或養(yǎng)殖 水體中是否存在致病菌的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種檢測無鱗魚致病菌的試劑盒，包含引物B，其核苷酸 序列如SEQ ID NO 1-2所示，擴(kuò)增來自溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)的基因。所述試劑盒還含有如SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的陽性對(duì)照物。本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測無鱗魚致病菌的方法，包括以下步驟1)提取待檢樣本中的DNA ；2)用引物對(duì)樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO :1 2所 示；3)用SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列制備標(biāo)準(zhǔn)陽性模板，并進(jìn)行稀釋和定量；4)對(duì)DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測。本發(fā)明方法步驟1)所述的待測樣本取自魚體或養(yǎng)殖水體。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種選自如SEQ ID NO :1 2所示寡核苷酸序列的用 途，其用于擴(kuò)增或檢測來自溫和氣單胞菌的基因。


圖1溫和氣單胞菌常規(guī)PCR測試引物及檢測體系11-19 引物對(duì) AS1F/AS1R，11-13 為空白對(duì)照；21-29 引物對(duì) AS2F/AS2R，21-23 為空白對(duì)照；31-39 引物對(duì) AS3F/AS3R，31-33 為空白對(duì)照；M :DNA marker I.圖2溫和氣單胞菌常規(guī)PCR檢測體系的特異性1-2 空白對(duì)照；3 豚鼠氣單胞菌ATCC 15468 ;4 嗜水氣單胞菌；5 熒光假單胞 菌；6 河弧菌；7 柱狀黃桿菌；8-9 溫和氣單胞菌；M =DNA markerI.圖3溫和氣單胞菌常規(guī)PCR檢測體系的靈敏度1-7 基因組DNA從50納克到50菲克的10倍梯度稀釋；8 空白對(duì)照；M =DNA marker I.圖4草魚樣品檢測結(jié)果(溫和氣單胞菌) 1 空白對(duì)照；2-14 魚池采集的樣品；15 陽性對(duì)照；M =DNA marker I.圖5鯉魚樣品檢測結(jié)果(溫和氣單胞菌)1 空白對(duì)照；2-8 待檢測樣品；9 陽性對(duì)照；M =DNA marker I.圖6水體中溫和氣單胞菌檢測結(jié)果1 空白對(duì)照；2-5 待測水樣，6 陽性對(duì)照；M =DNA marker I
具體實(shí)施例方式根據(jù)已有文獻(xiàn)資料報(bào)道，溫和氣單胞菌為常見的魚類致病菌，在養(yǎng)殖無鱗魚的發(fā) 病魚體和養(yǎng)殖水體中常常存在，因此，我們選取溫和氣單胞菌作為研究靶標(biāo)，以PCR作為技 術(shù)手段，以這些菌株的保守毒力基因序列作為靶標(biāo)序列，研究和建立PCR快速檢測技術(shù)體 系，從基因水平上，通過多學(xué)科的聯(lián)合研究，在魚致病性細(xì)菌的早期、快速、定量檢測方面進(jìn) 行一些積極的探索，加強(qiáng)魚病的預(yù)防和診斷。以下實(shí)施例是為了對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，并非對(duì)發(fā)明的限制。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法均參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F. M.奧斯伯等主編，科學(xué) 出版社2005年出版)所建議的實(shí)驗(yàn)條件。 實(shí)施例一弓I物的設(shè)計(jì)和陽性對(duì)照物的篩選合成1、從GeneBank上查找靶標(biāo)病原菌溫和氣單胞菌的保守基因序列，并根據(jù)這些序 列設(shè)計(jì)引物及探針。引物交由上海生工(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)合成。2、實(shí)驗(yàn)材料及試劑材料魚類常見致病菌柱狀黃桿菌、溫和氣單胞菌、河弧菌、熒光假單胞菌、豚鼠氣 單胞菌和嗜水氣單胞菌。前五個(gè)菌株均購自中科院武漢水生生物研究所，嗜水氣單胞菌由 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心提供。使用前均用相應(yīng)的培養(yǎng)基活化，并用細(xì)菌基因組DNA提 取試劑盒(Tiangen)提取基因組DNA。將提取的基因組DNA 10倍梯度稀釋，用于評(píng)價(jià)PCR 體系的靈敏度；試齊[J:5U/yL Taq DNA polymerase (Promega，含 IOXreaction buffer 禾口 25mM Mg2+) > IOmM dNTPs (Promega)、DNA marker I (Tiangen) ；MilliporeH2O 高壓滅菌后分裝， 于-20度保存?zhèn)溆谩?br> 3、引物、菌株測試用常規(guī)PCR測試所設(shè)計(jì)的引物和購買的菌株，PCR反應(yīng)體系根據(jù)各組分的濃度配 制，擴(kuò)增程序根據(jù)引物的TM值及產(chǎn)物的大小編寫。常規(guī)PCR擴(kuò)增在Bio-Rad Mycycler梯 度擴(kuò)增儀上進(jìn)行，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合凝膠成像系統(tǒng)檢測所得到的PCR產(chǎn)物。4、PCR體系性能測試PCR體系優(yōu)化好以后，測試該體系的檢測特異性及靈敏度。結(jié)果溫和氣單胞菌A.常規(guī)PCR測試購買的細(xì)菌及設(shè)計(jì)的引物我們設(shè)計(jì)的三對(duì)引物序列如下AS1F/AS1R、AS2F/AS2R、AS3F/AS3R從圖1可以看出，對(duì)于溫和氣單胞菌，我們所設(shè)計(jì)的三對(duì)引物均可擴(kuò)增出靶標(biāo)條 帶，表明購買的溫和氣單胞菌、自行設(shè)計(jì)的引物以及使用的PCR擴(kuò)增體系也均可用于后續(xù) 的實(shí)驗(yàn)?？紤]到常規(guī)PCR產(chǎn)物需要電泳等特點(diǎn)，我們根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選用AS3F/AS3R引物對(duì)(其 核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示，)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。B.常規(guī)PCR檢測體系的特異性對(duì)于常見的幾種非靶標(biāo)魚類致病菌，使用我們建立的常規(guī)PCR檢測體系均為檢測 陰性，對(duì)溫和氣單胞菌為檢測陽性，這表明我們所建立的常規(guī)PCR檢測體系具有極好的特 異性，可以用于溫和氣單胞菌的快速檢測(圖2)。C.常規(guī)PCR檢測體系的靈敏度將提取的溫和氣單胞菌基因組DNA作10倍梯度稀釋，用作模板測試所建立的常規(guī) PCR體系的檢測靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們所建立的常規(guī)PCR體系也可檢測到pg級(jí)的基 因組DNA，說明該體系具有較好的檢測靈敏度(圖3)。實(shí)施例2試劑盒的制備和組成成分組成1、PCR反應(yīng)液800 μ L (10 μ L/次，80次，含核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示的 引物、dNTPs、Mg2+、Taq酶緩沖液)2、Taq 酶20 μ L (0. 25 μ L/次，80 次)3,6% Chelex-100 16mL(DNA 提取液，200 μ L/次，80 次)4、DNA 陽性對(duì)照 160 μ L (2 μ L/次，80 次)5、滅菌超純水 2mL制備方法將Taq酶緩沖液(終濃度2X)、上下游引物(終濃度0.6 μ M)、 dNTPs (終濃度0. 4mM)、Mg2+(終濃度4mM)依次加入離心管，用無菌超純水補(bǔ)足總體積至 800 μ L0 Taq酶為商品酶，購于promega公司，-20度保存。DNA陽性對(duì)照制備方法見實(shí)施 案例3。滅菌超純水使用Millipore純水儀制備，高壓滅菌后分裝。以上成分均需_20°C保 存，使用時(shí)取出融化，短暫離心后使用。稱取6g Chelex-100粉末(Bio-Rad)，溶于IOOmL無 菌超純水中，即為6% Chelex-100溶液，4°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例3檢測待測病魚樣本1)提取疑似患病魚取樣組織的DNA采集了一些患病及疑似患病的草魚和鯉魚樣品，使用Chelex-IOO(Bi0-Rad)煮沸法快速提取DNA。方法如下取一小塊患病組織塊，加入200 μ L Millipore H2O,搗爛，取出 沒有搗爛的組織塊，剩余渾濁液12，OOOrpm離心lmin，棄上清，加入200 μ L Millipore H2O 重懸。充分混勻后取50 μ L加入到200 μ L 6%的chelex-100中，混勻，56°C保溫20min，劇 烈震蕩混勻后于100°C保溫8min，劇烈震蕩，并于12，000離心3min，取上清作為PCR的模 板，用建立的常規(guī)PCR檢測體系進(jìn)行檢測。常規(guī)PCR擴(kuò)增在Bio-Rad Mycycler梯度擴(kuò)增儀 上進(jìn)行，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合凝膠成像系統(tǒng)檢測分析得到的PCR產(chǎn)物。剩余的模板于_20°C 保存以備復(fù)檢。2)用實(shí)施例1制備的引物擴(kuò)增樣本中的DNA，使用實(shí)施例2的試劑盒 用以下程序做PCR反應(yīng)體系(終濃度)程序IXreaction buffer95"C 4min0. 3μΜ primer F/primer R 94"C 15s0. 2mM dNTPs56°C IOs X 382mM Mg2+72V 15s1. 25U Taq DNA polymerase 72°C 5min2μ L Template4°C holdAdd Millipore H2O to 20 μ L3)陽性對(duì)照物及標(biāo)準(zhǔn)模板的制備用建立的常規(guī)PCR體系擴(kuò)增溫和氣單胞菌基因組DNA，2%瓊脂糖凝膠電泳分離得 到特定的靶標(biāo)條帶。用干凈的手術(shù)刀切下包含靶標(biāo)條帶的凝膠，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑 盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收靶標(biāo)DNA。將回收的部分DNA加入到連接體系 中(10 μ L，含線性克隆載體、連接酶和連接酶buffer)，16°C連接過夜。次日，將全部的連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到制備好的大腸桿菌感受態(tài)，并涂布于含有氨芐青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)至長 出菌落。挑取菌落并制備成菌懸液，使用載體引物及菌落PCR驗(yàn)證并挑選陽性克隆子。將 陽性克隆子對(duì)應(yīng)的細(xì)菌于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，并取ImL提取質(zhì)粒DNA(普通質(zhì)粒小 提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司)，從而得到陽性對(duì)照物。測定提取的質(zhì)粒DNA 的濃度，稀釋到一定倍數(shù)作為陽性對(duì)照用于PCR檢測。4)檢測擴(kuò)增DNA (方法同實(shí)施案例3的樣品制備和PCR檢測)待測患病草魚的鰓糜爛，灰色或紫色，腹部充血漲腫，尾部有紅色或暗紅色條紋， 與柱狀黃桿菌感染引起的癥狀接近，但不排除有其它細(xì)菌的混合感染。待測患病鯉魚皮膚糜爛或充血，有的魚有白絨毛狀物質(zhì)附著，尾部及后腹部在水 中呈白色，死亡較快。溫和氣單胞菌檢測結(jié)果(草魚樣品)見圖4。在采集的13個(gè)草魚樣品中，樣品10的擴(kuò)增條帶大小與陽性對(duì)照的一致， 表明為溫和氣單胞菌檢測陽性；樣品8產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶不明顯，懷疑存在少量的溫和氣單 胞菌感染；其余樣品，包括空白對(duì)照無擴(kuò)增產(chǎn)物。說明溫和氣單胞菌是草魚的致病菌之一。溫和氣單胞菌檢測結(jié)果(鯉魚樣品)見圖5。在采集的7個(gè)鯉魚樣品中，樣品3、7及8有靶標(biāo)條帶產(chǎn)生，表明有溫和氣單胞菌的存在；其余樣品，包括空白對(duì)照均無擴(kuò)增條帶生成。說明溫和氣單胞菌是鯉魚的致 病菌之一，且在鯉魚的病魚中，溫和氣單胞菌檢出率較高。圖4和圖5顯示檢測結(jié)果較好。這表明我們建立的常規(guī)PCR檢測體系具有很好的 檢測效果，可以用于魚病的檢測和預(yù)測，為魚病的防治提供科學(xué)依據(jù)。實(shí)施例4 水體中溫和氣單胞菌的檢測1)細(xì)菌DNA的獲取從養(yǎng)殖水體中采樣，用無菌離心管取水樣lmL，12，OOOrpm離 心lmin，棄上清，加入200 μ L Millipore H2O重懸。充分混勻后取50 μ L加入到200 μ L 6% 的chelex-100中，混勻，56°C保溫20min，劇烈震蕩混勻后于100°C保溫8min，劇烈震蕩，并 于12，000離心3min，取上清作為PCR的模板，用建立的常規(guī)PCR檢測體系進(jìn)行檢測。常規(guī) PCR擴(kuò)增在Bio-Rad Mycycler梯度擴(kuò)增儀上進(jìn)行，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合凝膠成像系統(tǒng)檢測 分析得到的PCR產(chǎn)物。剩余的模板于_20°C保存以備復(fù)檢。2)用實(shí)施例1制備的引物擴(kuò)增樣本中的DNA，使用實(shí)施例2的試劑盒及實(shí)施例3 的PCR程序進(jìn)行檢測。3)結(jié)果見圖6。四個(gè)水樣本中，第二泳道也就是樣本1有溫和氣單胞菌檢出，產(chǎn) 物條帶大小與第六泳道的陽性對(duì)照一致，也與相應(yīng)水體中的魚的發(fā)病情況一致，表明該試 劑盒可以用于水體樣本的檢測。第一泳道為空白對(duì)照。也就是說在水體中檢測出了溫和氣單胞菌，可以大致推測該水體的病魚中的主要 致病菌與溫和氣單胞菌關(guān)系密切。本發(fā)明試劑盒能快速準(zhǔn)確地檢測病魚和養(yǎng)殖水體中的溫和氣單胞菌，方法簡便， 檢測樣本量大，為有針對(duì)性治療和有效預(yù)防魚病提供了可靠的診斷結(jié)果，避免了盲目施治 導(dǎo)致的農(nóng)藥濫用，為消費(fèi)者提供安全的水產(chǎn)品提供了保證。本發(fā)明核苷酸序列SEQ ID NO :1 3如下SEQ ID NO :1、2(引物對(duì))溫和氣單胞菌常規(guī)PCR特異性引物AS3F/AS3R擴(kuò)增片段的序列(131bp)SEQ ID NO 1 AS3F =Sense primer :5-GCAATCTAGCCATCCAAACG-320bpSEQ ID NO 2 AS3R :Anti_sense primer 5-CCAACGTAAGTACAGCTATGC-32Ibp擴(kuò)增產(chǎn)物Product :I3IbpSEQ ID NO 3溫和氣單胞菌常規(guī)PCR特 異性引物AS3F/AS3R擴(kuò)增片段的序列(131bp)995 gcaatc tagccatcca aacggctatt1021 ttggttacca taacagagcc atccactgcc gccaagcaat aaaccgctggttccacctca1081 tcacccttgc tgtcactccc gaatgcatag ctgtacttac gttgg
權(quán)利要求
1.一種檢測無鱗魚致病菌的試劑盒，其特征是包含引物B，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示，擴(kuò)增來自溫和氣單胞菌的基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是所述試劑盒還含有如SEQID NO 3所示 核苷酸序列的陽性對(duì)照物。
3.—種檢測無鱗魚致病菌的方法，其特征是1)提取待檢樣本中的DNA;2)用引物對(duì)樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物的核苷酸序列如SEQID NO :1 2所示；3)用SEQID NO 3所示的核苷酸序列制備標(biāo)準(zhǔn)陽性模板，并進(jìn)行稀釋和定量；4)對(duì)DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是步驟1)所述的待測樣本為魚體或養(yǎng)殖水體。
5.一種選自如SEQ ID NO :1 2所示寡核苷酸序列的用途，其特征是其用于擴(kuò)增或 檢測來自溫和氣單胞菌的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測無鱗魚致病菌溫和氣單胞菌的方法和檢測試劑盒，試劑盒包含引物B，其序列如SEQ ID NO1～2所示，擴(kuò)增來自溫和氣單胞菌的基因。用本發(fā)明的方法可以快速準(zhǔn)確地檢測無鱗魚體內(nèi)或養(yǎng)殖水體是否含有致病菌，做到有針對(duì)性的防治魚病。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102002523SQ201010180810
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月3日
發(fā)明者劉衍鵬, 康琦, 肖丹, 黃冠軍 申請(qǐng)人:通威股份有限公司