專利名稱：一株產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶的賴氨酸芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種梭形賴氨酸芽孢桿菌及其應用，特別是一種能合成耐高滲氨基甲酸乙酯水解酶的梭形賴氨酸芽孢桿菌及其應用。
背景技術：
氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate, EC)，在醫(yī)學上有重要用途，曾一度被用作治療多發(fā)性骨髓瘤及慢性骨髓性白血病，以及作為麻醉劑使用。近年研究發(fā)現(xiàn)，氨基甲酸乙酯是一種人類潛在致癌物質(zhì)，可導致肺癌、淋巴癌、肝癌等疾病，國際癌癥研究機構(gòu)在2007年把氨基甲酸乙酯列為2A類致癌物。氨基甲酸乙酯是一種伴隨發(fā)酵食品(如酒精飲料、豆醬、醬油等)的生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，對食品安全和生物體健康都有著嚴重的影響和危害。面對氨基甲酸乙酯所造成的食品安全問題，以微生物及酶降解實現(xiàn)食品中氨基甲酸乙酯的無危害化，是較理想的解決方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一株產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶的梭形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus fusiformis) SC02,已于2012年10月19日保藏于中國典形微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CCTCC N0:M2012414。菌落呈蠟樣不透明，邊緣不規(guī)則，菌落直徑2-4_，培養(yǎng)1-2天菌落為白色，3天后菌落顏色逐漸加深，最終顯暗棕色。好氧或兼性厭氧。菌體革蘭氏陽性，無莢膜，1000X顯微鏡下觀察細胞呈桿狀梭形，部分菌體頂端生有橢圓形芽孢。所述梭形賴氨酸芽孢桿菌分離自成年雌性小`鼠腸道，其保藏條件如下:從生長良好的平板上挑取單菌落轉(zhuǎn)接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm，培養(yǎng)16h，取500 μ L培養(yǎng)液移入含有500 μ L40%甘油的保藏管中，置于_80°C冰箱保存。上述的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為二形營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，配方為蛋白胨IOg,牛肉膏IOg,氯化鈉5g，蒸餾水1L，如需固體培養(yǎng)基，再添加2%瓊脂。本發(fā)明的另一個目的是提供上述梭形賴氨酸芽孢桿菌的應用，其合成的耐高滲氨基甲酸乙酯水解酶可以在NaCl濃度大于15%的條件下的條件下快速分解發(fā)酵食品中的副產(chǎn)物氨基甲酸乙酯并產(chǎn)生乙醇和氨氣。其在最適PH8.0時具有最高酶活40U/g，在NaCl濃度大于15%的條件下，梭形賴氨酸芽孢桿菌所產(chǎn)生的耐高滲氨基甲酸乙酯水解酶能夠保持20%的酶活。本發(fā)明提供的梭形賴氨酸芽孢桿菌能合成耐高滲氨基甲酸乙酯水解酶，在pH為
8.0時具有最高酶活，能在高滲條件下快速分解氨基甲酸乙酯。在pH為8.0的條件下，其氨基甲酸乙酯水解酶酶活為40U/g，在NaCl濃度大于15%的條件下，其能保持20%的氨基甲酸乙酯水解酶酶活。說明書附1梭形賴氨酸芽孢桿菌顯微照片
圖2pH對梭形賴氨酸芽孢桿菌氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影響圖3梭形賴氨酸芽孢桿菌氨基甲酸乙酯水解酶對NaCl的耐受性
具體實施例方式實施例1:梭形賴氨酸芽孢桿菌篩選方法將25g每只5周大雌性昆明小鼠進行五天的強飼氨基甲酸乙酯溶液(200mg/kgbody weight/day)后解剖，并用濃度為0.9%的生理鹽水沖洗小鼠腸道組織,取組織懸浮液ImL于1000 Xg下離心10分鐘，取上清液接種于富集培養(yǎng)基中(牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，NaC15g，氨基甲酸乙酯IOgjjC lOOOmL，pH7.0)，30°C下通氣培養(yǎng)20h。培養(yǎng)液于2000Xg離心5min,取上清涂布于篩選培養(yǎng)基(牛肉浸膏IOg,蛋白胨10g,NaC15g,氨基甲酸乙酯30g,瓊脂20g，水lOOOmL，pH5.0)中培養(yǎng)三天。挑選菌落形態(tài)較大的菌株轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h后進行保藏。挑取_80°C保藏的菌株在營養(yǎng)肉湯瓊脂固體培養(yǎng)基上劃線，于37°C培養(yǎng)24h后，挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37°C在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床培養(yǎng)24h，離心5min (12000rpm, 4°C )后收集菌體，再用ρΗ7.0的磷酸鹽緩沖液重懸浮菌體至0.lg/mL。通過超聲破碎進行酶粗提液的提取，對粗酶液進行氨基甲酸乙酯水解酶酶活測定檢測到一株具有氨基甲酸乙酯水解酶活性的菌株，通過16S rDNA序列分析可知該菌株為一株梭形賴氨酸芽孢桿菌，已于2012年10月19日保藏于中國典形微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CCTCC N0:M2012414，保藏地址為中國武漢武漢大學。實施例2:氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液的提取方法挑取_80°C保藏的菌株在營養(yǎng)肉湯瓊脂固體培養(yǎng)基上劃線,于37°C培養(yǎng)24h后,挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37°C在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床培養(yǎng)24h，收集菌液50mL于冷凍高速離心 機中低溫離心IOmin (10000rpm,4°C )后收集菌體，菌體沉淀中加入相同菌液體積的50mM PBS或50mM Tris_HCl(緩沖液pH應根據(jù)所篩選的蛋白穩(wěn)定范圍選取)重懸洗滌三次。再用PH7.0的磷酸鹽緩沖液懸浮菌體至0.lg/mL。將菌液在_80°C冰凍，室溫融解，反復凍融三次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎。將反復凍融的菌液，置于冰水浴中進行超聲破碎(可適當添加少量溶菌酶加快破碎速度)，超聲條件:25W，工作2S，間隔2S，重復工作30min，直至菌體溶液變清澈為止，大約花費時間60min。將菌體超聲破碎后于低溫離心機中離心IOmin (lOOOOrpm，4°C )，將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的Eppendorf管中，低溫保存。實施例3:氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液的酶活檢測方法氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液酶活檢測方法的原理是利用在一定條件下，氨基甲酸乙酯降解酶科將氨基甲酸乙酯分解生成乙醇，氨氣和二氧化碳。氨與苯酚-次氯酸鈉反應形成靛酚藍顯藍色，用分光光度計在630nm處測其吸光值，分析氨的生成量，從而得到氨基甲酸乙酯水解酶的酶活。酶活測定試劑的配制:顯色劑1:稱取15g苯酚和0.625g亞硝基鐵氰化鈉用超純水定容至250mL顯色劑I1:稱取13.125g氫氧化鈉和7.5mL次氯酸鈉用超純水定容至250mL終止劑:稱取IOg三氯乙酸用超純水定容至IOOmL
NH4+標準溶液制備:lmL氨水溶于超純水中并定容至145mL,配成0.lmol/L的NH4+溶液，并以此為母液，用超純水將之稀釋并配制成0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L 的 NH4+ 標準溶液。氨離子標準曲線的繪制:分別精確移取ImL NH4+標準梯度液置于順序編號的IOmL比色管中。37°C下恒溫保溫15min，立即吸取ImL終止劑于比色管中，振蕩混勻。再依次加入ImL顯色劑I和顯色劑II，強烈振蕩，使之充分混勻，反應20min。超純水定容至10mL，在630nm下比色測定OD值，以OD值為縱坐標，NH4+梯度為橫坐標作圖，得到標準曲線。酶活的測定取兩支IOmL比色管,分別加入ImL酶液和超純水。然后在兩管中分別加入ImL超純水，在37°C恒溫水浴箱中反應15min后，在兩管各加入ImL三氯乙酸終止劑，混勻后加入ImL的顯色劑I和ImL顯色劑II，強烈震蕩，繼續(xù)在37°C恒溫水浴箱中保溫20min后取出，用超純水稀釋到10mL,630nm處比色,并記錄OD值。酶活計算公式:酶活力=Δ OD630 XnXkX 10/15式中:Λ OD630:酶反應后樣品測定與空白試驗光密度值之差η:酶活測定液稀釋倍數(shù)k:標準曲線斜率的倒數(shù)10 :1mL樣品液稀釋至1OmL的倍數(shù)15:酶反應的時間(min)(酶反應的時間為15min)酶活定義酶活力定義:在常壓、37°C條件下每分鐘分解底物產(chǎn)生I μ mol氨為一個酶活力單位。實施例4:氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液最適pH的確定按下表配置緩沖溶液，其溶液pH值以酸度計測定值為準。
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶的梭形賴氨酸芽孢桿菌SC02 (Lysinibacillusfusiformis SC02)，于2012年10月19日保藏于中國典形培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No:M2012414。
2.權(quán)利要求1所述的梭形賴氨酸芽孢桿菌，其特征是能耐受3%(w/v)氨基甲酸乙酯。
3.權(quán)利要求1所述梭形賴氨酸芽孢桿菌，其能夠合成氨基甲酸乙酯水解酶。
4.權(quán)利要求1-3任一所述的梭形賴氨酸芽孢桿菌應用于氨基甲酸乙酯水解酶的生產(chǎn)。
5.權(quán)利要求1-3任一所述的梭形賴氨酸芽孢桿菌應用于氨基甲酸乙酯的降解。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶的賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus fusiformis)SC02，于2012年10月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2012414，該梭形賴氨酸芽孢桿菌SC02能夠在高滲環(huán)境(NaCl濃度大于15%)下快速降解氨基甲酸乙酯，對發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的消除起到了積極的作用，具有很好的應用前景。
文檔編號C12N1/20GK103074275SQ20121057842
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者陳堅, 堵國成, 方芳, 張繼冉 申請人:江南大學