專利名稱：：篩選ε-聚賴氨酸高產菌的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種S-聚賴氨酸高產菌的篩選方法。
背景技術：
：隨著人們生活水平的日益提高以及對食品安全性的認識和要求的逐步提高，化學防腐劑受到嚴峻挑戰(zhàn)，食品防霉防腐劑的天然化己成為今后的發(fā)展趨勢。天然食品防腐劑可分為微生物源防腐劑、動物源和植物源防腐劑。微生物食品防腐劑是指通過微生物發(fā)酵的方法，從發(fā)酵液中提取分離得到的有抑菌作用的物質。目前，國際上批準使用的微生物食品防腐劑僅有乳酸鏈球菌素、納他霉素和e-聚賴氨酸。乳酸鏈球菌素能有效抑制引起食品腐敗的許多革蘭氏陽性細菌，而對革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌無效；而pH值、溫度、光照、氧化物及重金屬對納他霉素的穩(wěn)定性影響較大，因此在一定程度上限制了它們的應用。s-聚賴氨酸Opolylysine)是由微生物合成的L-賴氨酸同聚物，由s，氨基與cc-羧基通過肽鍵連接而成，其聚合度一般為2535。它是日本酒井平一和島昭二兩位博士大量篩選有價值的放線菌時發(fā)現(xiàn)的一種新型聚合物，進一步研究發(fā)現(xiàn)其具有強烈的抑菌能力，可以作為防腐劑用于食品的保鮮。作為新型的天然防腐劑，s-聚賴氨酸已于2003年IO月被FDA批準為安全食品保鮮劑。除了作為食品防腐劑，e-聚賴氨酸的應用已拓展至醫(yī)學、化妝品及高吸水性材料等。日本窒素公司已將s-聚賴氨酸的微生物發(fā)酵實現(xiàn)工業(yè)化，年產千噸s-聚賴氨酸的現(xiàn)代化工業(yè)裝置已建成投產，市:4規(guī)模達數十億日元。但國內還處于實驗室研發(fā)階段，主要是進行s-聚賴氨酸產生菌的篩選及采取各種誘變方法選育得到高產菌。s-聚賴氨酸產生菌的篩選方法十分復雜，傳統(tǒng)的方法是從土壤中篩選，通過平板分離，獲得純培養(yǎng)物，然后對每個純培養(yǎng)物進行搖瓶發(fā)酵，從發(fā)酵液中檢驗是否成德拉根道夫(+)反應，再通過液相色譜的方法進一步驗證。這樣的篩選方法存在著篩選目標不確定、工作量大、周期長、篩選效率低等缺點。2002年；Nishikawa等人采用一種簡便的方法篩選土壤中s-聚賴氨酸產生菌，在SG培養(yǎng)基中加入0.002%堿性染料美藍，s-聚賴氨酸與染料通過靜電作用而在平板上形成肉眼可見的特殊透明圈，從而簡化了篩選過程。但這種方法仍存在很多不足，美蘭對s-聚賴氨酸產生菌有很大的抑制作用，而且周期長。而關于目測篩選高產菌的方法因各種菌而異，有的可通過抗生素耐受或敏感性來篩選，有的可通過氨基酸營養(yǎng)缺陷型篩選。聚賴氨酸高產菌的直接目測篩選方法報道的還有一種就是，通過在培養(yǎng)集中加入AEC進行篩選。因為s-聚賴氨酸的生物合成是以賴氨酸為前體物，再通過聚合酶的催化生成s-聚賴氨酸。因此增強賴氨酸代謝流將有助于提高s-聚賴氨酸的產量。天冬氨酸激酶(AK)是賴氨酸生物合成途徑中的關鍵酶，其活性受末端產物賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制。因此可以通過篩選賴氨酸的結構類似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)的抗性菌株來遺傳性地解除賴氨酸對天冬氨酸激酶的反饋抑制，進而積累大量賴氨酸，再由s-聚賴氨酸聚合酶聚合，從而達到高產s-聚賴氨酸的目的。但是AEC的價格十分昂貴,lg的價格就需要1000多元，而試驗的需要量也較大，因此成本太高。s-聚賴氨酸高產菌的篩選工作量很大，傳統(tǒng)的方法是將誘變處理后隨機挑取獲得的每個純培養(yǎng)物進行搖瓶發(fā)酵，篩選得到高產菌。這種方法隨機性很高，而且工作量大，篩選效率很低。
發(fā)明內容針對上述現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明提供一種直觀、簡單、快速的s-聚i賴氨酸高產菌的篩選方法，該方法能克服傳統(tǒng)篩選方法的不足，不但可高:效直觀地將s-聚賴氨酸產生菌與其他微生物區(qū)分開來，而且可以取代繁瑣的搖瓶發(fā)酵篩選方法，在平板上簡單直觀地篩選s-聚賴氨酸產生菌的高產菌。本發(fā)明工藝簡單、工作量小、周期短、篩選效率較高。本發(fā)明的技術方案如下提供一種篩選s-聚賴氨酸高產菌的方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中添加帶電荷的指示劑，根據所述指示劑與s-聚賴氨酸的特殊反應所形成的透明圈徑或聚集圈徑的大小，篩選S-聚賴氨酸高產菌。發(fā)明方法的原理是S-聚賴氨酸帶有很多正電荷，遇到帶負電荷的指示劑時，由于靜電作用異性相吸，因此形成色素聚集圈；而遇到帶正電荷的指示劑時，由于靜電作用同性排斥，因此形成色素透明圈，從而，通過在培養(yǎng)基中添加帶電荷的指示劑，可以選擇性地從不同土壤樣品中篩選S-聚賴氨酸產生菌，然后根據所述指示劑與s-聚賴氨酸的特殊反應所形成的透明圈徑或聚集圈徑的大小，選擇性地從平板上篩選s-聚賴氨酸高產菌。所述帶電荷的指示劑可以選自帶負電荷的莧菜紅、誘惑紅、亮藍、檸檬黃、溴酚蘭或帶正電荷的中性紅。上述指示劑中，最優(yōu)選的是中性紅。本發(fā)明方法中，所述帶電荷的指示劑優(yōu)選以配制成溶液的形式加入培養(yǎng)基中。指示劑的濃度要適宜。如果指示劑的濃度太低,形成的聚集圈或透明圈不清晰明顯；但如果濃度太高，又會因為一定的毒性作用而抑制菌體生長。因此須確定合適的指示劑濃度，以此形成的聚集圈或透明圈既清晰明顯又不會對菌體的生長造成很大的抑制。發(fā)明人根據試驗結果，確定帶負電荷的指示劑中，莧菜紅的濃度可以是0.002%0.012%;誘惑紅的濃度可以是0.002%0.010%;亮藍的濃度可以是0.002%0.010%;擰檬黃的濃度可以是0.002%0.010%;溴酚蘭的濃度可以是0.002%0.010%。而帶正電荷的中性紅的濃度可以是0.0005%0.0025%，優(yōu)選0.0015%。.本發(fā)明方法所得的e-聚賴氨酸粗品對細菌、放線菌和酵母菌都有明^的抑菌作用，其中對枯草芽孢桿菌的抑制最強。本發(fā)明方法的指示劑濃度確定過程如下SG固體培養(yǎng)基的組成是(g/L):甘油10，瓊脂20，酵母膏0.10，NaH2P04'2H200.884，MgS04'7H200.25，(NH4)2S040.66，痕量礦物溶液140ml，加水定容至1L，其中pH為7.0。所述痕量礦物溶液的組成是(g/L):NaCl1，F(xiàn)eS04'7H200.1，CaCl22H200.1，明磯0.01，CuS04'5H200.01，CoCl2.6H200.1，H3B030.01，ZnS04'7H200.1，NH4Mo7024-4H200.01。指示劑溶液的配制50.1%溴酚蘭準確稱取0.1克溴酚蘭溶于100ml20%乙醇；0.1%百里酚藍準確稱取O.l克百里酚藍溶于100ml20。/。乙醇；0.05%溴百里酚藍準確稱取0.05克溴百里酚藍溶于100ml20%乙醇；0.1%中性紅準確稱取0.1克中性紅溶于100ml60%乙醇；0.2%甲基紅準確稱取0.2克甲基紅溶于100ml60。/。乙醇；0.1%酚紅準確稱取0.1克酚紅溶于100ml20%乙醇；0.1%甲酚紅準確稱取O.l克甲酚紅溶于100ml50。/。乙醇；0.1%酚酞準確稱取0.1克酚酞溶于100ml60%乙醇；0.1%百里酚酞準確稱取0.1克百里酚酞溶于100ml90%乙醇；0.8%亮藍準確稱取0.8克亮藍溶于100ml無菌蒸餾水；0.8%檸檬黃準確稱取0.8克檸檬黃溶100ml于無菌蒸餾水；0.8%誘惑紅準確稱取0.8克誘惑紅溶于100ml無菌蒸餾水；0.8%莧菜紅準確稱取0.8克莧菜紅溶于100ml無菌蒸餾水。將SG固體培養(yǎng)基12rC滅菌20min，滅菌后，待溫度降至6(TC左右時加入上述各指示劑溶液，使其終濃度均達0.002%，混勻后倒入90mm平板，制成各指示劑平板。將s-聚賴氨酸標準品配制成濃度為lg/L，并用無菌過濾膜過濾。滅菌后的牛津杯放置各指示劑平板中，牛津杯中加入200ul濃度為lg/L的s-聚賴氨酸標準品溶液及對照無菌水。室溫下放置，l天后觀察平板。由于s-聚賴氨酸是聚陽離子化合物，帶有很多正電荷，可以與帶電荷的指示劑發(fā)生靜電作用，在平板上顯現(xiàn)特殊現(xiàn)象，如表1所列。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實驗結果表明在莧菜紅、誘惑紅、亮藍、檸檬黃、溴酚蘭平板上，裝有S-聚賴氨酸標準品的牛津杯周圍形成一個清晰明顯的色素聚集圈，因為S-聚賴氨酸帶有很多正電荷，而莧菜紅、誘惑紅、亮藍、檸檬黃、溴酚蘭帶負電荷，由于靜電作用異性相吸，故形成色素聚集圈；而在中性紅平板上，裝有s-聚賴氨酸標準品的牛津杯周圍形成一個十分清晰明顯的色素透明圈，因為s-聚賴氨酸帶有很多正電荷，而中性紅帶正電荷，由于靜電作用同性排斥，故形成色素透明圈。在所有指示劑平板中裝有無菌水的牛津杯周圍沒有聚集圈及透明圈的形成。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，采用例如百里酚藍、溴百里酚藍、甲基紅、酚紅、甲酚紅、酚酞或百里酚酞等指示劑，也能在平板上形成色素聚集圈，但不夠清晰，因為百里酚藍、溴百里酚藍、甲基紅、酚紅、甲酚紅、酚酞、百里酚酞的解離程度很小，帶負電荷少，因此形成的色素聚集圈不夠清晰。因此，本發(fā)明選擇覓菜紅、誘惑紅、亮藍、檸檬黃、溴酚蘭或中性紅作為篩選模型的指示劑。指示劑的濃度太低，形成的聚集圈或透明圈不清晰明顯，但濃度太高，又會因為一定的毒性作用而抑制菌體生長。因此須確定合適的指示劑濃度，以此形成的聚集圈或透明圈既清晰明顯又不會對菌體的生長造成很大的抑制。將SG固體培養(yǎng)基121'C滅菌20min，滅菌后，待溫度降至6(TC左右時分別加入莧菜紅、誘惑紅、亮藍、檸檬黃、溴酚蘭指示劑溶液，使其終濃度為0.0010.015%，加入中性紅指示劑溶液，使其終濃度為0.00020.0040%，混勻后倒入90mm平板，制成各濃度各指示劑的平板。將菌株&a/6w/wKCTC9669斜面孢子用無菌水洗滌，制成孢子懸浮:液，經一系列稀釋后涂布上述各濃度各指示劑平板。根據平板上的菌株生長情況以及菌落數確定添加指示劑的濃度。試驗結果如下表2、3、4、5、6所示。其中作為對照的0.002%美藍對菌的抑制率為91.8%，菌第九天生長。表2中性紅濃度的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>抑制率1.583.765.5413.2826.5937.5256.8167.4173.41(%)(其中作為對照的0.002%美藍對菌的抑制率為91.8%，菌第九天生長)結果表明當中性紅的濃度為0.0005%0.0025%時，透明圈清晰明顯，而且對菌體的毒性作用小。表3莧菜紅濃度的確定莧菜紅0.0010.0020扁0細0.0050.0070,0100.0120.015濃度(％)透明圈+-+++++++++++++++++++++++清晰程度菌體生第三第三第四第四第四第四第四第四第五長情況天生天生天生天生天生天生天生天生天生長長長長長長長長長抑制率2.785.618.4310.7515.9421.0328.4232.8958.47(%)結果表明當莧菜紅的濃度為0.002%0.012%時，透明圈清晰明顯，而且對菌體的毒性作用小。表4誘惑紅濃度的確定誘惑紅0.0010豫0扁0.0040.0050.0070.0100.0120.015濃度(％)透明圈+-+++++++++++++++++++++++清晰程度菌體生第三第三第四第四第四第四第四第四第五長情況天生天生天生天生天生天生天生天生天生長長長長長長長長長抑制率3.948.6714.6618.6120.4924.3030.7243.2657.11(%)結果表明當誘惑紅的濃度為0.002%0.010%時，透明圈清晰明顯，而且對菌體的毒性作用小。表5檸檬黃濃度的確定8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結果表明當亮藍的濃度為0.002%0.010%時，透明圈清晰明顯，而且對菌體的毒性作用小。表7溴酚蘭濃度的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結果表明當溴酚蘭的濃度為0.002%0.010%時，透明圈清晰明顯，而且對菌體的毒性作用小。本發(fā)明方法的具體操作過程如下(1)產正電物質菌株的篩選土壤樣品中加入滅菌蒸餾水，過濾后進行一系列稀釋。將SG固體培養(yǎng)基121'C滅菌20min，待溫度降至6(TC左右時加入配置好的指示劑溶液，混勻后制成平板。將稀釋后的土壤樣品涂至上述平板，3(TC培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后，由于指示劑可以和微生物分泌出來的正電聚合物在平板上形成獨特的聚集圈或透明圈，因此可以產正電物質的菌株周圍形成了一個聚集圈或透明圈，不產正電物質的菌株則沒有該現(xiàn)象，因此可以很靈敏地把產正電物質的菌株篩選出來，得到e-聚賴氨酸產生菌。(2)產生物堿菌株的確定分離得到的產正電物質的菌株接于斜面中，培養(yǎng)5天。取一環(huán)孢子接種到裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30。C培養(yǎng)3天。用Dragendorff試劑對發(fā)酵液進行檢測,有兩株菌對Dragendorff反應呈陽性。(3)產物組成成分的鑒定將2株生物堿呈陽性的菌株的發(fā)酵液進行提取，得到粗品，將粗品勸s-聚賴氨酸標準品裝入安瓿管中，加入6mol/LHCl密封，于121。C水解24小時，用薄層層析法分析組成成分。薄層層析條件為硅膠60鋪板,展開劑為正丁醇冰醋酸吡啶水=4:i:i:2(體積比)；顯色劑為茚三酮。菌株發(fā)酵液的粗品和s-聚賴氨酸標準品在此展開劑中停留在薄層原位點，，但與茚三酮反應呈陽性，而菌株發(fā)酵液的粗品和S-聚賴氨酸標品的鹽酸水解液，展開后只有一個斑點，其斑點位置與L-賴氨酸標品溶液的斑點一致，說明菌株發(fā)酵液的粗品為單一L-賴氨酸的聚合物。'(4)e-聚賴氨酸高產菌的篩選對篩選得到的s-聚賴氨酸產生菌進行誘變處理(NTG誘變過程為將產生菌的孢子混懸在tris緩沖液(pH6.0)中。向懸浮液中加入NTG至lmg/ml，孢子和NTG在37"C下接觸60min。所得孢子通過離心分離收集，用磷酸緩沖液(0.05M，pH7.0)洗滌，在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基+0.5。/。酵母提取物，pH6.8)中溫育過夜。然后離心收集細胞，用磷酸緩沖液(0.05M，pH7.0)洗滌。進行誘變后可得到高產菌株)，適當稀釋后涂至中性紅平板。培養(yǎng)直到單菌落長出。測量同一平板上菌落周圍形成的大小不一的透明圈徑，并將這些菌落挑至斜面，培養(yǎng)待孢子長出后，接一環(huán)孢子至M3G發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，培養(yǎng)后采用Itzhaki法測定s-聚賴氨酸含量，比較透明圈徑與s-聚賴氨酸產量之間的關系。由于同一平板上，透明圈徑大的菌株其s-聚賴氨酸產量就越高，因此，可以通過目測直觀地從中性紅平板上篩選出s-聚賴氨酸高產菌。本發(fā)明的篩選方法不但可高效直觀地將s-聚賴氨酸產生菌與其他微生物區(qū)分開來，而且可以取代繁瑣的搖瓶發(fā)酵篩選方法，在平板上簡單直觀地篩選s-聚賴氨酸產生菌的高產菌。本發(fā)明工藝簡單、工作量小、周期短、篩選效率較高。具體實施例方式實施例1將固體培養(yǎng)基121'C滅菌20min，待溫度降至6(TC左右時加入中性紅溶液，使其濃度達0.0015%，混勻后制成平板。將篩選得到的s-聚賴氨酸產生菌進行誘變處理，適當稀釋后涂至莧菜紅平板。30'C培養(yǎng)45天，單菌落長出。取兩個平板，測量同一平板上菌落周圍形成的大小不一的聚集圈徑，并將這些菌落挑至斜面，3(TC培養(yǎng)45天，待孢子長出后，接一環(huán)孢子至M3G發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，30'C培養(yǎng)4天，采用Itzhaki法測定s-聚賴氨酸含量，比較同一平板上聚集圈徑與s-聚賴氨酸產量之，的關系。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由上表可知同一中性紅平板上，透明圈徑大的菌株其S-聚賴氨酸產量就越高。因此，可以通過目測直觀地從中性紅平板上篩選出S-聚賴氨酸高產菌。實施例2將固體培養(yǎng)基121'C滅菌20min，待溫度降至6(TC左右時加入莧菜紅溶液，使其濃度達0.005%，混勻后制成平板。將篩選得到的s-聚賴氨酸產生菌進行誘變處理，適當稀釋后涂至莧菜紅平板。3(TC培養(yǎng)45天，單菌落長出。取兩個平板，測量同一平板上菌落周圍形成的大小不一的聚集圈徑，并將這些菌落挑至斜面，30'C培養(yǎng)45天，待孢子長出后，接一環(huán)孢子至M3G發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，3(TC培養(yǎng)4天，采用Itzhaki法測定s-聚賴氨酸含量，比較同一平板上聚集圈徑與s-聚賴氨酸產量之間的關系。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由上表可知同一莧菜紅平板上，聚集圈徑大的菌株其S-聚賴氨酸產量就越高。因此，可以通過目測直觀地從莧菜紅平板上篩選出S-聚賴氨酸高產菌。實施例3將固體培養(yǎng)基121。C滅菌20min，待溫度降至60'C左右時加入誘惑紅溶液，使其濃度達0.005%，混勻后制成平板。將篩選得到的s-聚賴氨酸產生菌進行誘變處理，適當稀釋后涂至誘惑紅平板。3(TC培養(yǎng)45天，單菌落長出。取兩個平板，測量同一平板上菌落周圍形成的大小不一的聚集圈徑，并將這些菌落挑至斜面，3(TC培養(yǎng)45天，待孢子長出后，接一環(huán)孢子至M3G發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，3(TC培養(yǎng)4天，采用Itzhaki法測定s-聚賴氨酸含量，比較同一平板上聚集圈徑與s-聚賴氨酸產量之間的關系。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>量就越高。因此，可以通過目測直觀地從擰檬黃平板上篩選出S-聚賴氨酸高產菌。實施例5將固體培養(yǎng)基121"滅菌20min，待溫度降至60。C左右時加入亮藍溶液，使其濃度達0.005%，混勻后制成平板。將篩選得到的e-聚賴氨酸產生菌進行誘變處理，適當稀釋后涂至亮藍平板。30'C培養(yǎng)45天，單菌落長出。取兩個平板，測量同一平板上菌落周圍形成的大小不一的聚集圈徑，并將這些菌落挑至斜面，3(TC培養(yǎng)45天，待孢子長出后，接一環(huán)孢子至M3G發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，30'C培養(yǎng)4天，采用Itzhaki法測定s-聚賴氨酸含量，比較同一平板上聚集圈徑與s-聚賴氨酸產量之間的關系。平板1菌編號123456789搖瓶發(fā)酵相對產量(％)100.091.2120.2118.495.196.9124.576.1118.6透明圈徑大小(cm)0.750.701.001.000.700.751.050.600.95平板2菌編號123456789搖瓶發(fā)酵相對產量(％)100.079.8108.4118.9128.1114.360.6128.6■1透明圈徑大小(cm)0.800.600.900.951.000.950.651.000.85由上表可知同一亮藍平板上，聚集圈徑大的菌株其S-聚賴氨酸產量就越高。因此，可以通過目測直觀地從亮藍平板上篩選出S-聚賴氨酸高產菌。實施例6將固體培養(yǎng)基12rC滅菌20min，待溫度降至60'C左右時加入溴酚蘭溶液，使其濃度達0.005%，混勻后制成平板。將篩選得到的s-聚賴氨酸產生菌進行誘變處理，適當稀釋后涂至溴酚蘭平板。3(TC培養(yǎng)45天，單菌落長出。取兩個平板，測量同一平板上菌落周圍形成的大小不一的聚集圈徑，并將這些菌落挑至斜面，30'C培養(yǎng)45天，待孢子長出后，接一環(huán)孢子至M3G發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，3(TC培養(yǎng)4天，采用Itzhaki法測定s-聚賴氨酸含量，比較同一平板上聚集圈徑與s-聚賴氨酸產量之間的關系。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由上表可知同一溴酚蘭平板上，聚集圈徑大的菌株其S-聚賴氨酸產量就越高。因此，可以通過目測直觀地從溴酚蘭平板上篩選出S-聚賴氨酸高產菌。權利要求1.一種篩選ε-聚賴氨酸高產菌的方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中添加帶電荷的指示劑，根據所述指示劑與ε-聚賴氨酸的特殊反應所形成的透明圈徑或聚集圈徑的大小，篩選ε-聚賴氨酸高產菌。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述帶電荷的指示劑是莧菜紅、誘惑紅、亮藍、檸檬黃、溴酚蘭或中性紅。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述帶電荷的指示劑是中性紅。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述帶電荷的指示劑是配制成溶液的形式加入培養(yǎng)基中。5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的莧菜紅的濃度是0.002%0.012%。6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的誘惑紅的濃度是0.002%0.010%。7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的亮藍的濃度是r0.002%0.010%。8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的檸檬黃的濃度是0.002%0.010%。9.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的溴酚蘭的濃度是0.002%0.010%。10.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的中性紅的濃度是0.0005%0.0025%。11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所添加的中性紅的濃度是0.0015%。全文摘要本發(fā)明提供一種篩選ε-聚賴氨酸高產菌的方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中添加帶電荷的指示劑，根據所述指示劑與ε-聚賴氨酸的特殊反應所形成的透明圈徑或聚集圈徑的大小，篩選ε-聚賴氨酸高產菌。本發(fā)明的篩選方法不但可高效直觀地將ε-聚賴氨酸產生菌與其他微生物區(qū)分開來，而且可以取代繁瑣的搖瓶發(fā)酵篩選方法，在平板上簡單直觀地篩選ε-聚賴氨酸產生菌的高產菌。本發(fā)明工藝簡單、工作量小、周期短、篩選效率較高。文檔編號C12Q1/04GK101580865SQ20081003748公開日2009年11月18日申請日期2008年5月15日優(yōu)先權日2008年5月15日發(fā)明者孫湘婷,巖王,陳少欣申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院