本發(fā)明涉及一種新的西紅花酸衍生物，具體涉及西紅花酸的可藥用酰胺及其制備方法，以及該衍生物在預(yù)防和治療心腦血管疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：西紅花(CrocussativusL.)又稱藏紅花，是鳶尾科番紅花屬植物番紅花CrocussativusL.的干燥柱頭。西紅花是一種名貴的中藥材，在治療或預(yù)防心腦血管疾病，以及腫瘤、炎癥、疼痛抑制及對(duì)肝臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用等方面臨床應(yīng)用廣泛，且療效顯著。西紅花的主要藥效物質(zhì)包括西紅花酸、藏紅花素、西紅花酸二甲酯、西紅花苦素等，此外還含有桉腦、蒎烯、多種維生素。國內(nèi)外現(xiàn)代研究表明，西紅花酸(crocetin)是西紅花在體內(nèi)發(fā)揮心腦血管療效的主要活性組分。西紅花酸具有多不飽和共軛烯酸結(jié)構(gòu)，屬類胡蘿卜素物質(zhì)，在抗心血管系統(tǒng)疾病、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、防治糖尿病并發(fā)癥等方面有明確的生物活性。近年來，西紅花酸在心血管系統(tǒng)疾病中的防治作用成為許多學(xué)者的研究熱點(diǎn)，大量研究成果也表明西紅花酸具有很好的心血管保護(hù)作用，且其作用是多靶點(diǎn)、多途徑的。這些研究成果預(yù)示著西紅花酸有良好的開發(fā)前景，很有希望開發(fā)成為新型的防治心血管系統(tǒng)疾病的藥物，值得深入研究。然而，西紅花酸的脂溶性和水溶性較差，極難溶于水以及除吡啶和與吡啶相似的有機(jī)堿以外的常用有機(jī)溶劑，難以達(dá)到較高的藥物濃度及給藥劑量，另外，由于藥物脂溶性較高才能容易被胃腸道上皮細(xì)胞黏膜所吸收，而西紅花酸由于其脂溶性極差，從而造成生物利用度低，臨床應(yīng)用受到極大的限制。同時(shí)，通過西紅花酸衍生物解決溶解性問題，仍有許多技術(shù)難點(diǎn)，比如衍生物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，活性降低等問題。為此，本研究以西紅花酸為基礎(chǔ)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，以期獲得到溶解性較好，且心腦血管活性與西紅花酸本體相當(dāng)甚至更優(yōu)的新藥先導(dǎo)化合物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種西紅花酸酰胺類衍生物以及其制備方法與用途。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種西紅花酸酰胺GX-E，其結(jié)構(gòu)式如下所示：一種制備西紅花酸酰胺GX-E的方法，包括下列步驟：(1)取西紅花酸、EDCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)、HOBt(1-羥基苯并三唑)于反應(yīng)瓶中；冰浴條件下，加入Et3N、CH2Cl2，再加入有機(jī)胺類化合物，在0℃下反應(yīng)2-8小時(shí)，室溫過夜；(2)反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)；將反應(yīng)液過濾，除去溶劑，加入EA溶解，洗滌；除去溶劑后，得到粗品；(3)將粗品用硅膠柱進(jìn)行分離，洗脫，得到產(chǎn)物。具體地，步驟(1)中有機(jī)胺類化合物為二乙胺。具體地，步驟(1)中反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為4小時(shí)。具體地，步驟(1)中的西紅花酸與二乙胺的摩爾比為1∶1-1∶8。優(yōu)選地，步驟(1)中的西紅花酸與二乙胺的摩爾比為1∶2。具體地，步驟(2)反應(yīng)中的洗滌方法為：依次用鹽酸、碳酸氫鈉、水洗滌，分別洗滌2-5次。優(yōu)選地，步驟(2)反應(yīng)中的洗滌方法為：依次用鹽酸、碳酸氫鈉、水洗滌，分別洗滌3次。具體地，步驟(3)中洗脫的方法為：先用CHCl3洗脫，再用CHCl3∶CH3OH＝10∶1進(jìn)行洗脫。目前，西紅花酸存在脂溶性極低的問題，0.1g西紅花酸不溶于1000ml乙醇、氯仿-乙醇等有機(jī)溶劑，導(dǎo)致西紅花酸生物利用度極低，臨床應(yīng)用受限。西紅花酸GX-1結(jié)構(gòu)如下所示：本發(fā)明通過篩選大量的西紅花酸衍生物，用以解決西紅花酸脂溶性低導(dǎo)致的生物利用度降低的問題。本發(fā)明合成了一系列西紅花酸衍生物，如GX-M、GX-N等。西紅花酸酰胺GX-M，其結(jié)構(gòu)式如下所示：西紅花酸酰胺GX-N，其結(jié)構(gòu)式如下所示：本發(fā)明涉及的西紅花酸酰胺衍生物GX-E，與同類西紅花酸衍生物GX-M、GX-N相比，在相同藥物濃度下，通過線粒體活性試劑檢測(cè)，GX-E活性明顯優(yōu)于GX-M、GX-N，甚至優(yōu)于西紅花酸GX-1，對(duì)缺氧小室誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞缺氧損傷有明顯的保護(hù)作用，可以有效預(yù)防或治療心腦血管疾病。本發(fā)明涉及的西紅花酸酰胺衍生物GX-E，脂溶性也遠(yuǎn)高于西紅花酸GX-1，更容易被胃腸道上皮細(xì)胞黏膜所吸收，生物利用度相比于西紅花酸而言得到極大提升。本發(fā)明涉及的西紅花酰胺衍生物GX-E通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證明該化合物安全有效，GX-E脂溶性提升的同時(shí)生物活性并沒有降低，甚至優(yōu)于西紅花酸，克服了西紅花酸脂溶極低導(dǎo)致的生物利用度低的問題，GX-E可以制備成片劑、緩釋片劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、注射劑等劑型用于預(yù)防或治療心腦血管疾病，其臨床應(yīng)用更為廣泛。附圖說明圖1、GX-E的高分辨MS圖譜：GX-EC28H42N2O2Found：[M+H]+439.3318Calcd：[M+H]+439.3319(0.24ppm)圖2、GX-E的高分辨NMR圖譜：GX-E：1HNMRspectrum圖3、GX-E的高分辨NMR圖譜：GX-E：13CNMRspectrum具體實(shí)施例實(shí)施例1：制備西紅花酸衍生物GX-E取西紅花酸GX-1(購自于Sigma公司)(0.5mmol，164mg)，EDCI(1.25mmol，239mg)，HOBt(1.25mmol，169mg)于100ml反應(yīng)瓶。在冰浴條件下，加入Et3N(2.5mmol，350μl)及CH2Cl220ml，最后加入二乙胺(1.0mmol，112μl)，在0℃條件下反應(yīng)4h，然后室溫反應(yīng)過夜。利用TLC和LC-MS檢測(cè)產(chǎn)物是否生成。停止反應(yīng)，將反應(yīng)液過濾，真空除去溶劑，加入10mlEA溶解，依次用2％HCl，5％NaHCO3，H2O各10ml分別洗滌3次，真空除去溶劑得到粗品。將粗產(chǎn)物GX-E用硅膠柱進(jìn)行分離，先4-5柱體積的CHCl3進(jìn)行洗脫，然后加大洗脫劑極性CHCl3∶CH3OH＝10∶1進(jìn)行洗脫。得到GX-E，并用NMR表征其結(jié)構(gòu)。黃色粉末，產(chǎn)率：72％。實(shí)施例2：制備西紅花酸衍生物GX-M：分別取西紅花酸GX-1(購自于Sigma公司)(0.5mmol，164mg)，EDCI(1.25mmol，239mg)，HOBt(1.25mmol，169mg)于25ml反應(yīng)瓶。在冰浴條件下，加入Et3N(2.5mmol，350μl)及CH2Cl220ml，最后加入4-氟苯甲胺(1.1mmol，125μl)，在0℃條件下反應(yīng)4h，然后室溫反應(yīng)過夜。利用TCL和LC-MS檢測(cè)產(chǎn)物是否生成，確定反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)。將反應(yīng)液過濾，真空除去溶劑，加入10mlEA溶解，依次用2％HCl，5％NaHCO3，H2O各10ml分別洗滌3次，最后真空除去溶劑EA得到粗品。將得到的粗產(chǎn)物用硅膠柱進(jìn)行分離，用三個(gè)柱體積的CHCl3進(jìn)行洗脫。得到產(chǎn)物GX-M粗品，然后再次硅膠柱分離，用兩個(gè)柱體積的溶劑(石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1)進(jìn)行洗脫，最終得到產(chǎn)物GX-M，并用NMR表征其結(jié)構(gòu)，產(chǎn)率：75％。實(shí)施例3：制備西紅花酸衍生物GX-N：分別取西紅花酸GX-1(購自于Sigma公司)(0.5mmol，164mg)，EDCI(1.25mmol，239mg)，HOBt(1.25mmol，169mg)于25ml反應(yīng)瓶。在冰浴條件下，加入Et3N(2.5mmol，350μl)及CH2Cl220ml，最后加入3，5-二氟芐胺(1.1mmol，130μl)，在0℃條件下反應(yīng)4h，然后室溫反應(yīng)過夜。利用TCL和LC-MS檢測(cè)產(chǎn)物是否生成，確定反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)。將反應(yīng)液過濾，真空除去溶劑，加入10mlEA溶解，依次用2％HCl，5％NaHCO3，H2O各10ml分別洗滌3次，最后真空除去溶劑EA得到粗品。將得到的粗產(chǎn)物用硅膠柱進(jìn)行分離，用三個(gè)柱體積的CHCl3進(jìn)行洗脫。得到產(chǎn)物GX-N粗品，然后再次硅膠柱分離，用兩個(gè)柱體積的溶劑(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)進(jìn)行洗脫。最終得到產(chǎn)物GX-N，并用NMR表征其結(jié)構(gòu)，產(chǎn)率：68％。實(shí)施例4：制備西紅花酸衍生物GX-E取西紅花酸GX-1(購自于Sigma公司)(0.5mmol，164mg)，EDCI(1.25mmol，239mg)，HOBt(1.25mmol，169mg)于100ml反應(yīng)瓶。在冰浴條件下，加入Et3N(2.5mmol，350μl)及CH2Cl220ml，最后加入二乙胺(1.5mmol)，在0℃條件下反應(yīng)2h，然后室溫反應(yīng)過夜。利用TLC和LC-MS檢測(cè)產(chǎn)物是否生成。停止反應(yīng)，將反應(yīng)液過濾，真空除去溶劑，加入10mlEA溶解，依次用2％HCl，5％NaHCO3，H2O各10ml分別洗滌3次，真空除去溶劑得到粗品。將粗產(chǎn)物GX-E用硅膠柱進(jìn)行分離，先4-5柱體積的CHCl3進(jìn)行洗脫，然后加大洗脫劑極性CHCl3∶CH3OH＝10∶1進(jìn)行洗脫。得到GX-E，并用NMR表征其結(jié)構(gòu)。黃色粉末，產(chǎn)率：68％。實(shí)施例5：制備西紅花酸衍生物GX-E取西紅花酸GX-1(購自于Sigma公司)(0.5mmol，164mg)，EDCI(1.25mmol，239mg)，HOBt(1.25mmol，169mg)于100ml反應(yīng)瓶。在冰浴條件下，加入Et3N(2.5mmol，350μl)及CH2Cl220ml，最后加入二乙胺(4mmol)，在0℃條件下反應(yīng)4h，然后室溫反應(yīng)過夜。利用TLC和LC-MS檢測(cè)產(chǎn)物是否生成。停止反應(yīng)，將反應(yīng)液過濾，真空除去溶劑，加入10mlEA溶解，依次用2％HCl，5％NaHCO3，H2O各10ml分別洗滌2次，真空除去溶劑得到粗品。將粗產(chǎn)物GX-E用硅膠柱進(jìn)行分離，先4-5柱體積的CHCl3進(jìn)行洗脫，然后加大洗脫劑極性CHCl3∶CH3OH＝10∶1進(jìn)行洗脫。得到GX-E，并用NMR表征其結(jié)構(gòu)。黃色粉末，產(chǎn)率：61％。實(shí)施例6：制備西紅花酸衍生物GX-E取西紅花酸GX-1(購自于Sigma公司)(0.5mmol，164mg)，EDCI(1.25mmol，239mg)，HOBt(1.25mmol，169mg)于100ml反應(yīng)瓶。在冰浴條件下，加入Et3N(2.5mmol，350μl)及CH2Cl220ml，最后加入-乙胺(0.5mmol)，在0℃條件下反應(yīng)8h，然后室溫反應(yīng)過夜。利用TLC和LC-MS檢測(cè)產(chǎn)物是否生成。停止反應(yīng)，將反應(yīng)液過濾，真空除去溶劑，加入10mlEA溶解，依次用2％HCl，5％NaHCO3，H2O各10ml分別洗滌5次，真空除去溶劑得到粗品。將粗產(chǎn)物GX-E用硅膠柱進(jìn)行分離，先4-5柱體積的CHCl3進(jìn)行洗脫，然后加大洗脫劑極性CHCl3∶CH3OH＝10∶1進(jìn)行洗脫。得到GX-E，并用NMR表征其結(jié)構(gòu)。黃色粉末，產(chǎn)率：57％。實(shí)施例7：制備西紅花酸衍生物GX-E取西紅花酸GX-1(購自于Sigma公司)(0.5mmol，164mg)，EDCI(1.25mmol，239mg)，HOBt(1.25mmol，169mg)于100ml反應(yīng)瓶。在冰浴條件下，加入Et3N(2.5mmol，350μl)及CH2Cl220ml，最后加入二乙胺(2.0mmol)，在0℃條件下反應(yīng)4h，然后室溫反應(yīng)過夜。利用TLC和LC-MS檢測(cè)產(chǎn)物是否生成。停止反應(yīng)，將反應(yīng)液過濾，真空除去溶劑，加入10mlEA溶解，依次用2％HCl，5％NaHCO3，H2O各10ml分別洗滌3次，真空除去溶劑得到粗品。將粗產(chǎn)物GX-E用硅膠柱進(jìn)行分離，先4-5柱體積的CHCl3進(jìn)行洗脫，然后加大洗脫劑極性CHCl3∶CH3OH＝10∶1進(jìn)行洗脫。得到GX-E，并用NMR表征其結(jié)構(gòu)。黃色粉末，產(chǎn)率：65％。實(shí)施例8：西紅花酸及其系列衍生物抗心肌細(xì)胞缺氧作用實(shí)驗(yàn)1、取GX-1、GX-E、GX-M、GX-N適量，制備方法如實(shí)施例1-3，用無水乙醇配制成1mM濃度，貯存于-20℃KRBculturalbuffer(NaCl115mM，KCl4.7mM，CaCl22.5mM，NaHCO324mM，KH2PO41.2mM，MgSO4·7H2O1.2mM，HEPES10mM，0.01％BSA)，KRBwashbuffer(KRBculturalbufferwithoutFBS)，使用前氮?dú)馄胶膺^夜；MTT，購自于Sigma公司；線粒體活性測(cè)定試劑盒，購自于Abcam公司；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清均購自與Gibco公司。RSE為人參提取物(澳門科技大學(xué)中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制)，該樣品已被證實(shí)在該模型上具有缺氧損傷心肌細(xì)胞保護(hù)作用。2、細(xì)胞培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)用心肌細(xì)胞選用大鼠成纖維心肌細(xì)胞，H9c2(CRL-1446)，購自于ATCC公司。取出培養(yǎng)中的細(xì)胞，傾去培養(yǎng)基，用PBS潤洗一遍，傾去PBS，加入1ml的胰蛋白酶，37℃消化1min，加入培養(yǎng)基中止消化，1000rpm離心5min，棄上清液，加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml，將細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔100μl，放入CO2培養(yǎng)箱(5％CO2，37℃)中培養(yǎng)48h。3、實(shí)驗(yàn)分組：將H9c2心肌細(xì)胞分為正常對(duì)照組、缺氧模型組(心肌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)損傷模型組)、RSE陽性對(duì)照組(人參提取物RSE作為陽性對(duì)照組)、GX-1組、GX-E組、GX-D組及GX-E組。正常對(duì)照組不做任何處理，其余各組傾去培養(yǎng)基，加入KRBwashbuffer潤洗一次，傾去KRBwashbuffer，加入含藥KRBculturalbuffer：RSE陽性對(duì)照組中RSE終濃度為200μg/ml，GX各組終濃度均為10nM。4、心肌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)損傷：各組給藥后，立即將96孔板置入缺氧小室(billups-rothenberg，Inc.)，用氮?dú)怙柡腿毖跣∈?min，密封缺氧小室，使其內(nèi)部形成低氧環(huán)境，并將其置入37℃CO2培養(yǎng)箱中，開始缺氧。3h后，將96孔板從缺氧小室中取出，傾去含藥KRBculturalbuffer，加入100μl培養(yǎng)基。5、細(xì)胞活性及線粒體活性檢測(cè)：細(xì)胞活性檢測(cè)：每孔加入10μlMTT，37℃避光孵育4h，再加入10％SDS-HCL(0.01M)過夜，570nm波長下檢測(cè)。線粒體活性檢測(cè)：每孔加入100μl線粒體活性測(cè)定試劑，37℃避光孵育4h，檢測(cè)熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長：550nm，發(fā)射波長590nm)。結(jié)論：通過檢測(cè)表明，與正常對(duì)照組(100％±0.04)相比，缺氧小室誘導(dǎo)缺氧顯著降低了H9c2心肌細(xì)胞存活率(18.9％±0.03，p＜0.001)；陽性對(duì)照RSE200μg/ml組H9c2心肌細(xì)胞存活率(33.5％±0.01)較缺氧損傷組有顯著提高(p＜0.001)。結(jié)果顯示缺氧損傷心肌細(xì)胞模型成功。GX-E對(duì)缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用具體如下表1所示：表1：GX四種化合物對(duì)缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用(線粒體活性試劑檢測(cè)結(jié)果)序號(hào)組別H9c2心肌細(xì)胞線粒體存活率1NORMAL(正常對(duì)照組)1.002HYPOXIA(缺氧模型組)0.423GX-10.654GX-E0.715GX-M0.296GX-N0.39結(jié)論：線粒體活性試劑檢測(cè)結(jié)果如表1所示，GX系列化合物在1μM劑量下分別呈現(xiàn)對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的不同作用，在相同藥物濃度下，GX-E活性明顯優(yōu)于藏紅花酸GX-1，同時(shí)與藏紅花酸衍生物GX-M、GX-N相比，GX-E的活性更優(yōu)，對(duì)缺氧小室誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞缺氧損傷有明顯的保護(hù)作用。實(shí)施例9：GX-1、GX-E溶解性實(shí)驗(yàn)比較取0.1g固體試樣(西紅花酸(GX-1)及其衍生物(GX-E))于試管中，加1mL乙醇/氯仿-甲醇(10∶1)振蕩后，如不溶解可加至100mL和1000mL觀察是否溶解，具體結(jié)果如下表2所示：表2溶解性實(shí)驗(yàn)比對(duì)表注：表中“+”表示溶解；“-”表示不溶解；若介于溶解和不溶解之間的現(xiàn)象，則用符號(hào)“±”表示；“/”表示不需試驗(yàn)的項(xiàng)目。結(jié)論：由上述表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾后的GX-E的脂溶性明顯優(yōu)于西紅花酸。當(dāng)前第1頁1 2 3