專利名稱：新的β-木糖苷酶和編碼該酶的核苷酸序列以及該酶的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的具有β-木糖苷酶活性的肽、編碼這種肽的核苷酸序列和這種類β-木糖苷酶肽的用途。
背景β-木糖苷酶(1，4-β-D-木聚糖-木糖水解酶；EC 3.2.1.37)是一種木聚糖裂解酶。木聚糖是植物細(xì)胞壁的一種主要成分，僅次于纖維素。它們大量存在于大多數(shù)陸生植物中，特別是農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品(如稻草、小麥糠、玉米穗軸、棉花種子等等)中。木聚糖是一種由β-1，4鍵連接的木糖聚合物組成，并含有阿拉伯呋喃糖、葡萄糖醛酸、甲基葡萄糖醛酸和乙酰側(cè)鏈基團(tuán)的復(fù)雜聚合物。內(nèi)切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)隨機(jī)切割木聚糖骨架中的β-1，4-鍵，產(chǎn)生寡糖、木乙糖和木糖。β-木糖苷酶切割由內(nèi)切木聚糖酶活性而形成的木糖寡聚物的非還原末端的末端木糖單元。α-葡萄糖醛酸酶切割木糖單元骨架的葡萄糖醛酸側(cè)鏈基團(tuán)，而α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)切割木聚糖骨架上的阿拉伯糖單元，乙酰酯酶(EC 3.1.1.6)除去乙酰側(cè)鏈基團(tuán)。
β-木糖苷酶在將單糖或乙醇連接到木糖單元或從木糖單元中切割下來(lái)的葡基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中也是有效的。β-木糖苷酶在木聚糖水解中是限制速率的酶(Dekker 1983，Poutanen和Puls 1988)。
β-木糖苷酶的水解反應(yīng)和葡基轉(zhuǎn)移反應(yīng)在降解和利用農(nóng)業(yè)廢物中具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，例如在木糖、木糖寡聚物和木糖醇的產(chǎn)生過(guò)程中(這些物質(zhì)在食品、蜜餞和藥物中作為增甜劑，特別是作為糖替代品是有用的)。并且，此酶或其產(chǎn)物可以用作面包改進(jìn)劑并可用于啤酒釀制工業(yè)中。
已經(jīng)從各種來(lái)源(包括細(xì)菌和真菌)中分離了β-木糖苷酶。例如，Rodionova等(1983)已報(bào)道了從黑曲霉純化β-木糖苷酶；據(jù)報(bào)道以凝膠過(guò)濾進(jìn)行測(cè)定其分子量為253,000，以SDS電泳測(cè)定其分子量為122,000，此肽的等電點(diǎn)為pH4.9。
Kormelink等(1993)從泡盛曲霉中分離了三種內(nèi)切木聚糖酶和一種β-木糖苷酶；β-木糖苷酶的分子量為110,000，最適pH值為6.5，最適溫度為70℃。
Garcia-Campayo和Wood(1993)已經(jīng)報(bào)道了瘤胃真菌Neocallimastix frontalis的β-D-木糖苷酶，這種蛋白質(zhì)的表觀分子量為150,000(通過(guò)凝膠過(guò)濾測(cè)定)，最適pH6.4，最適溫度為37℃。Utt等(1991)報(bào)道了編碼反芻細(xì)菌溶纖維丁酸弧菌的β-木糖苷酶和α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的xylB的序列。
已有的β-木糖苷酶的活性模式不是總能適應(yīng)于工業(yè)需要。特別是經(jīng)常需要此酶具有高的木糖苷酶特異性，而對(duì)其它底物(如葡糖苷和半乳糖苷)具有低的特異性。尤其是真菌β-木糖苷酶在它們的活性水平和特異性模式方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。
為了從所需要的產(chǎn)酶生物體提供具有所需要的酶活性模式的類β-木糖苷酶，應(yīng)該知道β-木糖苷酶的序列信息。然而，到目前為止，還沒(méi)有有關(guān)真菌β-木糖苷酶序列信息的報(bào)道。
發(fā)明描述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種新的β-木糖苷酶，并確定了它的氨基酸序列以及編碼它的核苷酸序列。本文稱此蛋白質(zhì)為xylD，而稱此編碼基因?yàn)閤lnD。新的β-木糖苷酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)似乎與已知的β-木糖苷酶類酶不同。另外，它的活性模式與已知的β-木糖苷酶類酶不同，它的β-木糖苷酶活性比Rodionova等(見上文)報(bào)道的β-木糖苷酶活性高大約2倍。
因此，本發(fā)明涉及一種核苷酸序列或者本發(fā)明涉及這種核苷酸序列的一部分，所說(shuō)的核苷酸序列編碼具有β-木糖苷酶活性并與SEQID NO.1所示的氨基酸序列顯示出至少30％的氨基酸等同性的肽，或者在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列雜交，所說(shuō)的核苷酸序列的一部分具有編碼SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的至少15個(gè)，優(yōu)選的是至少21個(gè)，更優(yōu)選的是至少24個(gè)并且更優(yōu)選至少30個(gè)核苷酸。本文的氨基酸同源性的意思是指氨基酸在一級(jí)結(jié)構(gòu)上的等同性。氨基酸相似性通常高于所給定的等同性數(shù)值。
在本文中，異源雜交條件如下在6×SSC(1000毫升20×SSC溶液含有175.3g NaCl，107.1g檸檬酸鈉-5H20，pH7.0)，0.1％SDS，0.05％焦磷酸鈉，5×Denhardt溶液(500ml 100×Denhardt溶液包含10g Ficoll-400、10g聚乙烯吡咯烷酮、10g牛血清清蛋白(PentaxFraction V))和20μg/ml變性鯡精DNA中于56℃雜交18-24小時(shí)，接著在5×SSC、0.1％SDS中于56℃洗滌兩次，每次30分鐘，然后在2×SSC、0.1％SDS中于56℃洗滌兩次，每次30分鐘。
本發(fā)明的核苷酸序列編碼實(shí)質(zhì)上具有β-木糖苷酶活性的肽，即這種肽以β-木糖苷酶活性作為其主要酶活性，因此可以用于產(chǎn)生β-木糖苷酶或它的突變體。所說(shuō)的編碼序列可以包含用于改變表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和/或活性的突變(插入、缺失或兩者都有)。作為這樣一種活性表達(dá)產(chǎn)物應(yīng)該優(yōu)選地保持以上限定的最小等同性和/或雜交特征。這樣的核苷酸也可以相當(dāng)于β-木糖苷酶調(diào)節(jié)序列或信號(hào)序列。為此，核苷酸序列實(shí)質(zhì)上含有β-木糖苷酶的編碼序列或調(diào)節(jié)序列。在另一方面，此核苷酸序列可以用作檢測(cè)β-木糖苷酶編碼序列的引物或探針。為此，這種序列包含至少15個(gè)，多達(dá)例如60個(gè)SEQ ID NO.1序列的連續(xù)的核苷酸。
本發(fā)明也涉及一種具有β-木糖苷酶活性并與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列顯示出至少30％氨基酸同源性的分離的肽，所說(shuō)的肽不具有β-葡糖苷酶和/或不具有β-半乳糖苷酶活性；基本上不具有β-葡糖苷酶或β-半乳糖苷酶活性的意思是這些活性不到β-木糖苷酶活性的2％，特別是不到1％。與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列顯示出至少40％，優(yōu)選的是至少60％，最優(yōu)選的是至少75％的氨基酸等同性的肽構(gòu)成本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案。含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的一系列至少8個(gè)鄰接的氨基酸的肽也是本發(fā)明的一部分。可以通過(guò)翻譯以上所述的核苷酸序列產(chǎn)生這些肽。優(yōu)選地，所說(shuō)的肽具有至少10個(gè)，最優(yōu)選的是至少12個(gè)SEQ ID NO.1中所示的鄰接的一系列氨基酸。
本發(fā)明的肽尤其來(lái)源于真菌，特別是絲狀真菌，如曲霉屬的菌株(尤其是黑曲霉、黑曲霉tubigensis變種、黑曲霉awamori變種、黑曲霉kawachii變種、米曲霉、聚多曲霉、日本曲霉、棘孢曲霉、赭曲霉、土曲霉、煙曲霉、雜色曲霉、黃曲霉、海棗曲霉、構(gòu)巢曲霉、臭曲霉和炭黑曲霉)、木霉屬(尤其是Trichoderma reesei、綠色木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma harzianum、Trichodermakongingii、Trichoderma pseudokongii)的菌株、青霉屬(瓦克青霉、嗜松青霉、微紫青霉、桔青霉、膠囊青霉、草酸青霉、疣孢青霉、產(chǎn)黃青霉)的菌株、腐質(zhì)霉屬(Humicola thermophilium＝Scytalidiumthermophilium)的菌株和鐮孢屬(尖鐮孢、腐皮鐮孢)的菌株。
并且，本發(fā)明也涉及抗以上所述的肽產(chǎn)生的抗體，這種抗體用于例如純化β-木糖苷酶和檢測(cè)β-木糖苷酶的存在。使用技術(shù)人員熟知的雜交瘤技術(shù)用以上所述的肽免疫接種產(chǎn)生這種抗體。
本發(fā)明也要求了在同源或異源啟動(dòng)子控制下的含有以上所述的核苷酸序列的表達(dá)載體和質(zhì)粒。
此外，本發(fā)明也涉及使用這些序列通過(guò)不同的宿主細(xì)胞在其自身調(diào)節(jié)序列或者異源調(diào)節(jié)序列控制下產(chǎn)生β-木糖苷酶或使用β-木糖苷酶啟動(dòng)子序列產(chǎn)生其它肽的用途。表達(dá)載體和宿主細(xì)胞可以含有編碼xylD序列(改變的或沒(méi)有改變的SEQ ID NO.1)和其它基因的多個(gè)拷貝。
宿主生物體可以是同源的生產(chǎn)菌株或另外的異源宿主。合適的宿主生物體包括真菌、細(xì)菌和植物。宿主生物體的例子是曲霉屬物種、木霉屬物種、芽孢桿菌屬物種、克魯維屬物種、酵母屬物種和鐮孢屬物種。特別優(yōu)選的是曲霉屬、黑曲霉tubigensis變種、黑曲霉awamori變種、米曲霉、日本曲霉、炭黑曲霉、棘孢曲霉、Trichoderma reesei、綠色木霉、Trichoderma harzianum、尖鐮孢、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸克魯維酵母和啤酒糖酵母。宿主生物體優(yōu)選地是食物級(jí)的生物體。
自身調(diào)控區(qū)和異源調(diào)節(jié)區(qū)的例子包括真菌的組成型和/或者誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如丙酮酸酯激酶啟動(dòng)子(pkiA)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(gpd)啟動(dòng)子。強(qiáng)酵母啟動(dòng)子的例子是乙醇脫氫酶、3-磷酸甘油酯激酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子。細(xì)菌啟動(dòng)子的例子是α-淀粉酶、spo2和細(xì)胞外蛋白質(zhì)酶基因的啟動(dòng)子。
本發(fā)明還涉及SEQ ID NO.1的5’非編碼區(qū)中含有的調(diào)節(jié)序列(1-854個(gè)核苷酸或它的一部分)在表達(dá)同源或異源基因上的用途，所述基因例如木聚糖酶、淀粉酶、葡聚糖酶、氧化還原酶(己糖氧化酶)、α-葡糖苷酸酶、脂酶、酯酶、阿魏酸酯酶、蛋白酶或人類白細(xì)胞介素-6、牛(原)凝乳酶、人類乳鐵蛋白質(zhì)、真菌肌醇六磷酸酶基因。xlnD的信號(hào)序列和合適的終止子(如xlnD或trpC)也可以用于這種結(jié)構(gòu)中。
本發(fā)明還涉及使用上述的核苷酸序列以一種方法破壞宿主生物體的β-木糖苷酶基因。為達(dá)到此目的，將含有能導(dǎo)致β-木糖苷酶基因失去功能的突變的核苷酸序列引入宿主細(xì)胞。這種突變可以是缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸、插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸或者是它們的組合。
有利的是宿主細(xì)胞(不論是改變了以產(chǎn)生或過(guò)量產(chǎn)生β-木糖苷酶或者不產(chǎn)生其β-木糖苷酶的宿主細(xì)胞)表達(dá)或者過(guò)量表達(dá)其它的相關(guān)蛋白質(zhì)，所說(shuō)的蛋白質(zhì)包括酶，特別是其它的木聚糖裂解酶(如內(nèi)切木聚糖酶)和/或其它的酶(例如淀粉酶、葡聚糖酶、氧化還原酶(如己糖氧化酶)、α-葡糖苷酸酶、脂酶、酯酶、阿魏酸酯酶和/或蛋白酶。相應(yīng)的基因可以是在同源控制區(qū)或存在于上述的核苷酸序列中的β-木糖苷酶基因的控制區(qū)的控制下。
由本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞表達(dá)的一種特異性的蛋白質(zhì)是命名為xylR的木聚糖裂解途徑的激活調(diào)節(jié)物。這種調(diào)節(jié)物的靶基因包含xlnA、xlnB、xlnC(所有三種內(nèi)切木聚糖酶編碼基因)、xlnD和axeA。因此，本發(fā)明的含有xlnR(即能夠表達(dá)xylR或其活性等同物)的宿主細(xì)胞，在這些細(xì)胞包含活性xlnD基因時(shí)是β-木糖苷酶的有效的產(chǎn)生者；或者在xlnD基因已經(jīng)失去功能的情況下，是其它木聚糖裂解酶(包括內(nèi)切木糖苷酶，但不包括β-木糖苷酶)的有效的產(chǎn)生者。在SEQ ID NO.2中示出了xlnR基因的核苷酸序列。
本發(fā)明也包括所說(shuō)的肽的酶活性在面包生面團(tuán)和其它的烘烤產(chǎn)品中所包含的底物的葡糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中的用途，結(jié)果產(chǎn)生改進(jìn)的面包特性。這種用途包括以有關(guān)面包酶促改進(jìn)劑的公知的方式用作面包改進(jìn)劑。
由本發(fā)明的序列編碼的β-木糖苷酶在用于從樹木、植物廢物、廢紙漿產(chǎn)生木糖和木糖寡聚物方面也是有利的，所說(shuō)的木糖和寡聚物適于用作增甜劑。也可以將它們還原成木糖醇(也是有效的主要增甜劑)。
本發(fā)明的其中的β-木糖苷酶基因已被破壞的宿主細(xì)胞可以用于，例如，生產(chǎn)例如加入到動(dòng)物飼料中的酶和酶制劑。很多動(dòng)物(包括家禽和豬)不能代謝木糖(Schutte，1991)。腸壁吸收的木糖占據(jù)泌尿系統(tǒng)，這樣木糖的吸收對(duì)這些動(dòng)物是不利的。并且，已知木糖的大量攝入導(dǎo)致白內(nèi)障、腹瀉和食欲不振。另一方面，可以將木糖和木糖寡聚物發(fā)酵成非常有用的短鏈脂肪酸。因此，飼料中的半纖維素酶應(yīng)產(chǎn)生木糖寡聚物并且不產(chǎn)生木糖單體，這樣此酶應(yīng)具有內(nèi)切木聚糖酶活性，不具有β-木糖苷酶活性或其水平降低。這樣，本發(fā)明也涉及包含失去功能的β-木糖苷酶基因但能夠有效地產(chǎn)生內(nèi)切木聚糖酶及任選的其它的尤其是木聚糖裂解酶的宿主細(xì)胞(如真菌、細(xì)菌、酵母和植物)在產(chǎn)生不含β-木糖苷酶的酶制劑方面的用途。本發(fā)明也包括所說(shuō)的不具有α-木糖苷酶活性的木聚糖裂解酶。
由SEQ ID NO.1的核苷酸序列編碼的β-木糖苷酶與Rodionova等(1993)報(bào)道的黑曲霉的β-木糖苷酶有很大不同，表A列出了它們的不同。
表A本發(fā)明的β-木糖苷酶(X-I和X-II)與按照Rodionova等(1983)的β-木糖苷酶的活性及抑制作用的比較底物 本發(fā)明本發(fā)明 β-xyl活性(U/m) 的X-I 的X-II(Rodionova)對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷 60.2 60.935.2對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷0.20.3 7.9對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷0.00.0 0.6對(duì)硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷 2.83.4 5.8抑制作用Ki(mM木糖) 9.813.22.9表A概括了本發(fā)明的兩種β-木糖苷酶X-I和X-II(可能只在糖基化模式上不同，氨基酸序列沒(méi)有差異)及Rodionova等報(bào)道的β-木糖苷酶的特異性模式及木糖對(duì)它們的抑制作用。表B列出了這些β-木糖苷酶的氨基酸組成。
表B按照SEQ ID NO.1的β-木糖苷酶與按照Rodionova等報(bào)道的β-木糖苷酶的氨基酸組成的比較氨基酸 數(shù)目 摩爾百分比 摩爾百分比(％)(％) (Rodionova)Ala8611.18.2Arg273.5 2.1Asn+Asp 9512.25.6Cys7 0.9 1.1Gln+Glu 749.5 12.4Gly638.0 11.3His131.7 1.4Ile395.0 4.8Leu698.9 8.8Lys243.1 2.9Met6 0.8 3.3Phe243.1 2.9Pro395.0 8.6Ser536.8 8.7Thr587.5 7.0Trp152.0 2.6Tyr415.3 3.4Val455.8 6.1實(shí)施例1黑曲霉β-木糖苷酶的純化在添加了1.5％粗制的小麥阿拉伯木聚糖，10mM L-精氨酸，10μM煙酰胺的曲霉屬基本培養(yǎng)基(MM)(每升包含6.0g NaNO3，1.5g KH2PO4，0.5g MgSO4.7H2O，0.5g KCl，指定的碳源，pH6.0和1毫升Vishniac溶液(Vishniac，W.和Santer，M.，1957，每升包含10g EDTA，4.4gZnSO4.7H2O，10g MnCl2.4H2O，0.32g CoCl2.6H2O，0.32g CuSO4.5H2O，0.22g(NH4)6Mo7O24.4H2O，1.47g CaCl2.2H2O，1.0g FeSO4.7H2O，pH4.0))中培養(yǎng)如在1996年6月24日申請(qǐng)的共同未決PCT申請(qǐng)(以及在EP 95201707.7和EP 95202346.3)中所述構(gòu)建的突變株黑曲霉NW147，其是菌株NW205∷130#2(cspA1，pyrA6，nicA1，argBI3，∷pIM130)的去阻遏衍生突變菌株。以1×106個(gè)孢子/升接種此培養(yǎng)基，30℃下菌絲體在250rpm的有軌New Brunswick搖床中生長(zhǎng)96小時(shí)。在使用Bchner漏斗和溫和抽吸的Myracloth(尼龍紗布)中過(guò)濾菌絲體后，收集培養(yǎng)物濾液。在培養(yǎng)物濾液由加入2倍體積的Millipore水稀釋后，用0.1M NaOH將培養(yǎng)物濾液的pH調(diào)至6.0。
在50mM醋酸鈉(pH5.0)中平衡DEAE-交聯(lián)葡聚糖A-50，并將其加入到培養(yǎng)物濾液中。4℃下振蕩30-60分鐘后，使DEAE-交聯(lián)葡聚糖與培養(yǎng)物濾液一起通過(guò)帶有玻璃濾器夾具的漏斗，并將DEAE-交聯(lián)葡聚糖A-50轉(zhuǎn)移到一個(gè)柱中。首先以50mM醋酸鈉緩沖液(pH5.0)洗脫此柱，然后以50mM醋酸鈉緩沖液(pH5.0)+0.5M NaCl洗脫。合并含有β-木糖苷酶活性的組分(通過(guò)使用生色底物4-甲基傘形花內(nèi)酯基-β-D-木糖苷(檢測(cè)β-木糖苷酶和內(nèi)切木聚糖酶)(Sigma#M7008)檢測(cè))，通過(guò)在Millipore水中透析進(jìn)行脫鹽，然后在20mM哌嗪-HCl緩沖液(pH5.0)中透析。透析后，將樣品加入到DEAE-瓊脂糖凝膠快流柱中，此柱先以3倍體積的20mM哌嗪-HCl緩沖液(pH5.0)洗脫，然后以溶解在20mM哌嗪-HCl緩沖液(pH5.0)中的0.5M NaCl的線性梯度洗脫。通過(guò)在280nm下UV吸收的連續(xù)測(cè)定來(lái)檢測(cè)洗脫下來(lái)的蛋白質(zhì)(

圖1)。收集10毫升組分，用來(lái)在對(duì)硝基-苯基-β-D-吡喃木糖苷(PNP-X)(Sigma# N2132)上測(cè)定β-木糖苷酶活性。在組分11-27中發(fā)現(xiàn)β-木糖苷酶，合并這些組分，接下來(lái)將其在20mM哌嗪-HCl緩沖液(pH6.0)中透析(圖2)。將5毫升透析的樣品加入到Mono Q HR5/5柱(Pharmacia)上，使用59毫升溶解在20mM哌嗪-HCl緩沖液(pH6.0)中的1M NaCl的線性梯度洗脫蛋白質(zhì)。通過(guò)在280nm下UV吸收的連續(xù)測(cè)定來(lái)檢測(cè)洗脫下來(lái)的蛋白質(zhì)(圖3)。發(fā)現(xiàn)2個(gè)含有β-木糖苷酶活性的峰；β-木糖苷酶I以0.19M NaCl洗脫下來(lái)，而峰II以0.29M NaCl洗脫下來(lái)。這兩個(gè)峰組分的SDS-PAGE表明相當(dāng)于這兩個(gè)峰的組分每一個(gè)都包含單一的蛋白質(zhì)帶，兩種蛋白質(zhì)具有相同的表觀分子量110kDa。如Rodionova等(1983)的描述測(cè)定這兩種β-木糖苷酶I和II對(duì)人工底物PNP-X的比活性，分別為60.2和60.9U/mg蛋白質(zhì)。此外，測(cè)定了它們對(duì)PNP-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma# N7006)的活性，分別為0.2和0.3U/mg；對(duì)PNP-β-D-吡喃半乳糖苷(Sigma# N1252)的活性為0.0和0.0U/mg；β-木糖苷酶I和II對(duì)PNP-α-L-阿拉伯呋喃糖苷(Sigma# N3641)的活性分別是2.8和3.4U/mg。
實(shí)施例2cDNA表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建在含有2％小麥阿拉伯木聚糖的MM培養(yǎng)基上將黑曲霉NW147培養(yǎng)69小時(shí)和81小時(shí)，之后通過(guò)過(guò)濾收獲菌絲體，并且用無(wú)菌鹽水洗滌，隨后在液氮中冷凍菌絲體，其后使用Microdismembrator(Braun)將菌絲體粉碎。按照Sambrook等(1989)所描述的硫氰酸胍/CsCl方案(只是使用CsCl梯度將RNA離心兩次)從菌絲體粉末中分離出總RNA。通過(guò)寡(dT)纖維素層析(Aviv和Leder，1972，Sambrook等，1989)(但要作如下變動(dòng)從各種溶液中除去SDS，并且向上樣緩沖液中補(bǔ)充9％(v/v)的二甲基亞砜)從5μg的總RNA中分離出Poly A+mRNA。
從7μg的Poly A+mRNA合成cDNA，并且使用ZAPTM-cDNA合成試劑盒(Stratagene)按照廠商的說(shuō)明將cDNA連接到噬菌體λ上。將cDNA連接到Uni-ZAP XR載體臂上后使用PackageneTM提取物(Promega)按照廠商的說(shuō)明包裝噬菌體DNA。將120μg cDNA連接到1.2g的載體臂上，隨后包裝反應(yīng)混合物產(chǎn)生由3.5×104個(gè)重組噬菌體構(gòu)成的初級(jí)文庫(kù)。使用大腸桿菌XLl-Blue MRF(Stratagene)擴(kuò)增初級(jí)文庫(kù)，滴定并在4℃下保存文庫(kù)。
實(shí)施例3β-木糖苷酶抗體的制備用1mM磷酸緩沖液(pH7.0)透析各250μg的β-木糖苷酶I和β-木糖苷酶II并且冷凍干燥。在100μg的無(wú)菌PBS(0.136M NaCl、2.7mMKCl、8mM Na2HPO4、1.75mM KH2PO4、pH7.4)中懸浮蛋白質(zhì)。將100μl的弗氏完全佐劑加入到蛋白質(zhì)混合物中，并且渦旋30分鐘以獲得穩(wěn)定的乳劑。將這兩種蛋白質(zhì)的混合物皮下注射到小鼠體內(nèi)。四周后將溶解在100μl無(wú)菌PBS中的25μg的β-木糖苷酶(向其中加入100μl弗氏不完全佐劑)注射到小鼠體內(nèi)。第7周從小鼠體內(nèi)取血并且進(jìn)行血清檢驗(yàn)。第13周進(jìn)行第二次25μg的加強(qiáng)免疫，接著第14周取血。間隔6周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，然后取血，這個(gè)過(guò)程可以進(jìn)行幾次。
37℃下將收集到的血清培養(yǎng)30分鐘，接著在4℃保存16小時(shí)。用Sorvall高速離心機(jī)以5000rpm離心后，收集血清并在-20℃保存。
實(shí)施例4用β-木糖苷酶II的抗體對(duì)黑曲霉NW147的cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫篩選為了篩選如實(shí)施例3描述的方法構(gòu)建的用于表達(dá)β-木糖苷酶的黑曲霉NW147 cDNA文庫(kù)，使用大腸桿菌BB4(Stratagene)作為接種細(xì)菌，按照Maniatis等(1982，pp.64)描述的方法將cDNA克隆以5×103pfu/平板接種在含有0.7％瓊脂糖的NZYCM的優(yōu)質(zhì)瓊脂糖的NZYCM(1.5％瓊脂)平板(平板直徑為85mm)上。主要按照Young和Davies(1983)描述的方法對(duì)所獲得的cDNA表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選，簡(jiǎn)而言之，使用大腸桿菌BB細(xì)胞作為宿主在0.7％優(yōu)質(zhì)瓊脂糖中將5000pfu擴(kuò)增的原液接種在NZYCM培養(yǎng)基上。將平板在37℃培養(yǎng)5小時(shí)，其后用預(yù)先浸泡在10mM IPTG中然后風(fēng)干的硝化纖維濾膜覆蓋此平板。然后將平板在37℃下另外培養(yǎng)6小時(shí)。將平板冷卻到4℃，在將濾膜除去之前標(biāo)記其在平板的位置。將濾膜在0.5M NaCl，0.05％Tween 20(Biorad)，20mM Tris/HCl，pH7.5中溫育15分鐘，同時(shí)輕微振蕩，重復(fù)一次以上操作。用手(帶上手套)輕微振蕩以除去細(xì)菌碎片，通過(guò)用抗β-木糖苷酶II抗血清檢測(cè)濾膜，其后用堿性磷酸酶綴合物按照在Biorad操作指南中相應(yīng)的Western雜交部分描述的方法進(jìn)行檢測(cè)來(lái)鑒定表達(dá)含有一部分β-木糖苷酶蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的噬菌體。在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中篩選5×103和5×104pfu擴(kuò)增文庫(kù)的β-木糖苷酶cDNA的表達(dá)；發(fā)現(xiàn)4個(gè)陽(yáng)性克隆。使用巴氏吸管從平板中挑取每個(gè)陽(yáng)性噬菌斑，并且在含有20μl氯仿的SM緩沖液中按照Maniatis等(1982)描述的方法從瓊脂填料中洗脫噬菌斑。使用影印濾膜通過(guò)重復(fù)上述方法從含有分離的噬菌體的50-100噬菌斑的平板上純化獲得的噬菌體。
實(shí)施例5表達(dá)β-木糖苷酶的cDNA克隆的分析按照廠商的說(shuō)明，用絲狀輔助噬菌體ExAssistTM(其包含在Stratagene的ZAPTM-cDNA合成試劑盒中)通過(guò)超感染將表達(dá)β-木糖苷酶的cDNA克隆轉(zhuǎn)移到Bluescript噬菌粒中。
接下來(lái)如Sambrook等(1989)的描述分離噬菌粒DNA。使用限制酶EcoRI和XhoI對(duì)4個(gè)cDNA克隆分離的DNA進(jìn)行限制性分析37℃下將所說(shuō)的DNA在包含下列溶液的反應(yīng)混合物中消化2小時(shí)2μl(≈1μg)DNA溶液；2μl合適的10×反應(yīng)緩沖液(LifeTechnologies)；每種限制性內(nèi)切酶10U(Life Technologies)；無(wú)菌蒸餾水定容至20μl。加入4μl DNA上樣緩沖液后，將此樣品加入到0.7％TAE-瓊脂糖凝膠上。通過(guò)在80V下電泳分離所說(shuō)的DNA片段。限制性分析表明cDNA克隆已經(jīng)插入了不同大小的片段，分別為1.4，1.5，2.4和2.5kb。使用Pharmacia T7 DNA聚合酶測(cè)序試劑盒通過(guò)雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger等，1977)確定每一個(gè)cDNA的部分核苷酸序列。獲得的序列表明這些cDNA的4個(gè)片段相當(dāng)于同一基因。
實(shí)施例6篩選黑曲霉基因組文庫(kù)的編碼β-木糖苷酶的xlnD基因并分離此基因?yàn)榱撕Y選如Harmsen等(1990)的描述構(gòu)建的黑曲霉N100基因組文庫(kù)的xlnD基因，使用大腸桿菌LE392作為接種細(xì)菌以3×103pfu/平板如Maniatis等(1982)的描述接種在5個(gè)直徑為85mm的NZYCM(1.5％瓊脂)平板上的含有0.7％瓊脂糖的NZYCM優(yōu)質(zhì)瓊脂糖上。平板在37℃下過(guò)夜培養(yǎng)后，如Maniatis等(1982)的描述將平板轉(zhuǎn)移到HybondN+濾膜(Amersham)上，每個(gè)平板重復(fù)兩次。濾膜在3×SSC中浸濕后，室溫下將此濾膜在3×SSC中洗滌60分鐘。使用如Sambrook等(1989)描述的方法制備的32P標(biāo)記的cDNA克隆#4的2.5kb EcoRI/XhoI片段按照下列方法(Sambrook等，1989)進(jìn)行雜交68℃下在6×SSC(1000毫升20×SSC含有175.3g NaCl，107.1g檸檬酸鈉.5.5H2O，pH7.0)，0.1％SDS，0.05％焦磷酸鈉，5×Denhardt溶液(500毫升100×Denhardt溶液含有10g Ficoll-400，10g聚乙烯吡咯烷酮，10g牛血清清蛋白(Pentax組分V))，20μg/ml變性鯡精DNA中預(yù)雜交3-5小時(shí)；68℃下在相同的含有變性的標(biāo)記探針的緩沖液中雜交15-18小時(shí)，然后68℃下在2×SSC，0.1％SDS中洗滌兩次，0.2×SSC，0.1％SDS中洗滌兩次。用Saran包裝膜覆蓋此膜，并在-70℃下使用Konica X-射線膠片和帶有常規(guī)增感屏的X-Omatic盒進(jìn)行過(guò)夜放射自顯影。
此篩選得到了大約50個(gè)陽(yáng)性噬菌體，純化了其中的10個(gè)。使用巴氏吸管從此平板上挑取每一個(gè)陽(yáng)性噬斑，并如Maniatis等(1982)的描述在含有20μl三氯甲烷的1ml SM緩沖液中將所說(shuō)的噬斑從瓊脂填料中洗脫下來(lái)。使用影印濾膜通過(guò)重復(fù)上述的方法從包含50-100個(gè)分離噬菌體之噬斑的平板上純化得到的噬菌體。
純化后，通過(guò)在NZYCM培養(yǎng)基上接種5×103個(gè)噬菌體來(lái)繁殖這些噬菌體。37℃下過(guò)夜培養(yǎng)后，得到鋪滿的平板，通過(guò)加入5毫升SM緩沖液并將平板在4℃下間歇搖動(dòng)貯存2小時(shí)來(lái)從平板中洗脫這些噬菌體。使用吸管收集上清液后，通過(guò)4℃下以4,000×g離心10分鐘從此溶液中除去細(xì)菌。向上清液中加入0.3％三氯甲烷，并確定pfu數(shù)值。這些噬菌體原液含有大約109pfu/ml。
經(jīng)Southern分析方法分析如Sambrook等(1989)描述的方法分離的4個(gè)選中的噬菌體G15-G18的DNA。37℃下在含有下列溶液的反應(yīng)混合物中將DNA消化5小時(shí)5μl(≈1μg)DNA溶液；2μl合適的10×反應(yīng)緩沖液(Life Technologies)；限制性內(nèi)切酶10U(LifeTechnologies)；無(wú)菌蒸餾水定容至20μl。65℃下將樣品保溫10分鐘，在加入到溶解在1×TAE緩沖液中的0.6％瓊脂糖凝膠中之前，在冰上快速冷卻。在25V下通過(guò)電泳15-18小時(shí)分離這些DNA片段。
在電泳后，通過(guò)堿性真空印跡法(VacuGene XL，Pharmacia LKB)如VacuGene XL操作說(shuō)明(pp.25-26)的描述將所說(shuō)的DNA變性并轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Hpbond N，Amserham)上，接下來(lái)使用標(biāo)記的cDNA克隆#4的2.5kb EcoRI/XhoI片段進(jìn)行預(yù)雜交和雜交，雜交條件如上所述。在-70℃下通過(guò)使用增感屏在Kodak XAR-5 X-射線膠片上曝光18小時(shí)獲得雜交圖式。在所有的4個(gè)克隆中，發(fā)現(xiàn)了來(lái)源于同一個(gè)基因組區(qū)的片段，并構(gòu)建了這些片段的限制圖譜(圖4)。
以限制圖譜為基礎(chǔ)，篩選3.6kb PstI片段用于亞克隆。將100ngpEMBL19 PstI消化的片段與250ng 3.8kb PstI片段混合，并向混合物中加入4μl 5×連接緩沖液(組成500mM Tris-HCl，pH7.6；100mMMgCl2；10mM ATP；10mM二硫蘇糖醇；25％PEG-6000)和1μl(1.2U/μl)T4DNA連接酶(Life Technologies)，混合物的最終體積為20μl。14℃下保溫16小時(shí)后，用無(wú)菌水將混合物稀釋到100μl。用10μl稀釋的混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(如Sambrook等(1989)的描述進(jìn)行制備)。得到的6個(gè)克隆在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(每1000毫升的LB培養(yǎng)基含有10g胰酶化蛋白胨(BBL)，5g酵母抽提物(BBL)，10g NaCl，0.5mM Tris-HCl pH7.5)中過(guò)夜生長(zhǎng)。通過(guò)如Maniatis等(1982)描述的堿裂解法從培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA，在限制性分析中使用此質(zhì)粒篩選含有所需要的質(zhì)粒pIM200的克隆。在真菌菌種保藏中心，Baam，NL以保藏號(hào)CBS 677.96保藏含有質(zhì)粒pIM200的菌株。從生長(zhǎng)在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中的500毫升包含pIM200的大腸桿菌DH5α培養(yǎng)物中大規(guī)模分離質(zhì)粒DNA(Maniatis等，1982)。通過(guò)CsCl離心，乙醇沉淀純化質(zhì)粒，并溶解在400μl TE中。所得的產(chǎn)量大約為500μg。此質(zhì)粒用于構(gòu)建詳細(xì)的限制性圖譜(圖5)。
實(shí)施例7使用質(zhì)粒pIM200轉(zhuǎn)化黑曲霉以1×106個(gè)孢子/ml在250ml由MM組成的培養(yǎng)基(添加了2％葡萄糖，0.5％酵母抽提物，0.2％酪蛋白氨基酸(不含維生素)，2mM亮氨酸，10μM煙酰胺，10mM尿苷)中接種NW155菌株(cspAl，argBl3，pyrA6，nicA1，leuA1，prtF28)(來(lái)源于NW228，Van den Hombergh等，1995)的孢子，30℃下在250rpm有軌New Brunswick搖床中培養(yǎng)菌絲體16-18小時(shí)。使用Bchner漏斗和溫和抽吸在Myracloth(尼龍紗布)上收集菌絲體，并且用SP6(SP60.8％NaCl，10mM磷酸鈉緩沖液，pH6.0)洗滌幾次。將150ml的Novozyme 234溶解在已加入1g菌絲體(濕重)的20ml SMC(SMC1.33M山梨醇，50mM CaCl2，20mMEMS緩沖液，pH5.8)中，并且小心地懸浮。30℃下用溫和振蕩器培養(yǎng)懸浮液1-2小時(shí)，每隔30分鐘將菌絲體小心地懸浮，取樣后用血細(xì)胞測(cè)定儀計(jì)數(shù)原生質(zhì)體以檢測(cè)原生質(zhì)體的形成。當(dāng)存在足夠的原生質(zhì)體(大于1×108)時(shí)，小心地懸浮并通過(guò)無(wú)菌玻璃棉管塞過(guò)濾除去菌絲體碎片。使用臺(tái)式離心機(jī)在4℃以3000rpm離心10分鐘收集菌絲體，除去上清液，將沉淀物小心地懸浮在5ml STC(STC1.33M山梨醇，50mM CaCl2，10mM Tris/HCl，pH7.2)中。洗滌步驟重復(fù)兩次，最后將原生質(zhì)體以1×108/ml密度懸浮在STC中。
通過(guò)以下步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化將20μg的pIM200 DNA和含有黑曲霉pyrA基因的5μg pGW635(溶解在10-20μl的TE中)與5μl的PEG緩沖液(PEG緩沖液25％PEG-6000，50mM CaCl2，10mM Tris/HCl，pH7.2)一起加入到200μl的原生質(zhì)體懸浮液中，然后使用移液管上下移動(dòng)多次慢慢地將上述液體混合，并在室溫下溫育20分鐘。此后，加入2μl的PEG緩沖液，將溶液慢慢混合并在室溫下溫育5分鐘，接下來(lái)加入4ml的STC并在渦旋混合器中慢慢混合。然后將1ml的懸浮液加入到4ml含有0.95M蔗糖滲透穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)瓊脂中，然后倒入滲透穩(wěn)定的平板中。另外使用pGW635轉(zhuǎn)化黑曲霉作為對(duì)照。
實(shí)施例8轉(zhuǎn)化體的分析通過(guò)將在實(shí)施例7中獲得的pIM200轉(zhuǎn)化體接種在含有1％燕麥二粒小麥木聚糖和1mM 4-甲基傘形花內(nèi)酯基-β-木糖苷的MM培養(yǎng)基上來(lái)分析其表型。檢驗(yàn)了26個(gè)轉(zhuǎn)化體，其中5個(gè)顯示出增加了的熒光。將這些轉(zhuǎn)化體和轉(zhuǎn)化體PYR+(作為參考)一起培養(yǎng)在含有1％燕麥二粒小麥木聚糖的MM上，培養(yǎng)20、27和42小時(shí)。此后測(cè)量β-木糖苷酶對(duì)PNP-X的活性。結(jié)果列于表C中。
在全部5個(gè)選擇的轉(zhuǎn)化體中都發(fā)現(xiàn)了β-木糖苷酶活性水平的增加，最高水平比野生活性多30多倍。使用如實(shí)施例3中的描述制備的抗β-木糖苷酶的抗體通過(guò)Western印跡和使用Bio-Rad免疫印跡GAR-AP測(cè)定試劑盒按照供應(yīng)商的說(shuō)明證實(shí)了這些結(jié)果。
表C在下述保溫時(shí)間后的黑曲霉轉(zhuǎn)化體的β-木糖苷酶活性(mU/ml培養(yǎng)物濾液)20hr 27hr 42hrpGW635151617XlsA1 828651XlsA4 90 11278XlsA8211 239 384XlsA9 63 11074XlsA1296 295 527
實(shí)施例9xlnD基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)9.1黑曲霉xlnD基因的序列分析通過(guò)在pEMBL18/19中亞克隆這些片段和使用特異性的寡核苷酸作為測(cè)序反應(yīng)中的引物測(cè)定黑曲霉xlnD基因、它的啟動(dòng)子/調(diào)節(jié)區(qū)、基因的結(jié)構(gòu)部分和終止區(qū)的序列。
為分析核苷酸序列，分離出限制性片段，然后將其克隆到pEMBL18/19 DNA載體中，并用適當(dāng)?shù)南拗泼赶?。通過(guò)雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger等，1977)使用Pharmacia T7 DNA聚合酶測(cè)序試劑盒測(cè)定核苷酸序列。使用PC/GENE程序(Intelligenetics)進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析。在SEQ ID NO.1中給出了測(cè)定的序列。
9.2 xlnD基因的描述包含xlnD結(jié)構(gòu)基因的序列(SEQ ID NO1)的前端是一個(gè)854個(gè)核苷酸長(zhǎng)的上游區(qū)。在787-794位發(fā)現(xiàn)推定的TATA框。xlnD基因的結(jié)構(gòu)部分從855到3266位，并且不含有內(nèi)含子，這一點(diǎn)已由cDNA片段測(cè)序和pIM200基因組片段測(cè)序證實(shí)。
xlnD基因編碼一種804個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。N-末端氨基酸序列的前端是一個(gè)26個(gè)氨基酸長(zhǎng)的疏水區(qū)序列，其可能相當(dāng)于信號(hào)序列。成熟的β-木糖苷酶蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度為778個(gè)氨基酸，并且具有84,727Da的推導(dǎo)分子量。
實(shí)施例10篩選塔賓曲霉基因組文庫(kù)的編碼β-木糖苷酶的xlnD基因?yàn)榱撕Y選如De Graaff等(1994)所述的方法構(gòu)建的塔賓曲霉基因組文庫(kù)的塔賓曲霉相應(yīng)的基因，如實(shí)施例6所描述的方法，以3×103pfu/平板在5個(gè)直徑為85mm的NZYCM(1.5％瓊脂)平板的含有0.7％瓊脂糖的NZYCM優(yōu)質(zhì)瓊脂糖上接種。平板在37℃下過(guò)夜培養(yǎng)后，如Maniatis等(1982)的描述將平板轉(zhuǎn)移到HybondN+濾膜(Amersham)上，每個(gè)平板重復(fù)兩次。濾膜在3×SSC中浸濕后，室溫下將此濾膜在3×SSC中洗滌60分鐘。使用如Sambrook等(1989)描述的方法制備的32P標(biāo)記的pIM200的3.6kb pstI片段按照下列方法(Sambrook等，1989)進(jìn)行雜交65℃下在6×SSC，0.1％SDS，0.05％焦磷酸鈉，5×Denhardt溶液(參見實(shí)施例6)，20μg/ml變性鯡精DNA中預(yù)雜交3-5小時(shí)；65℃下在相同的含有變性的標(biāo)記探針的緩沖液中雜交15-18小時(shí)，然后65℃下在2×SSC，0.1％SDS中洗滌兩次，0.2×SSC，0.1％SDS中洗滌兩次。用Saran包裝膜覆蓋此膜，并在-70℃下使用Konica X-射線膠片和帶有常規(guī)增感屏的X-Omatic盒進(jìn)行過(guò)夜放射自顯影。
此篩選得到了大約10個(gè)全部純化了的陽(yáng)性噬菌體。使用巴氏吸管從此平板上挑取每一個(gè)陽(yáng)性噬斑，并如Maniatis等(1982)的描述在含有20μl三氯甲烷的1ml SM緩沖液中將所說(shuō)的噬斑從瓊脂填料中洗脫下來(lái)。使用影印濾膜通過(guò)重復(fù)上述的方法從包含50-100個(gè)分離噬菌體之噬斑的平板上純化得到的噬菌體。
純化后，通過(guò)在NZYCM培養(yǎng)基上接種5×103個(gè)噬菌體來(lái)繁殖這些噬菌體。37℃下過(guò)夜培養(yǎng)后，得到鋪滿的平板，通過(guò)加入5毫升SM緩沖液并將平板在4℃下間歇搖動(dòng)貯存2小時(shí)從平板中洗脫這些噬菌體。使用吸管收集上清液后，通過(guò)4℃下以4,000×g離心10分鐘從此溶液中除去細(xì)菌。向上清液中加入0.3％三氯甲烷，并確定pfu數(shù)值。這些噬菌體原液含有大約109pfu/ml。
實(shí)施例11黑曲霉xlnD基因的破壞11.1破壞(disruption)質(zhì)粒pIM203和pIM204的構(gòu)建通過(guò)經(jīng)PCR產(chǎn)生xlnD基因的內(nèi)部片段來(lái)構(gòu)建此基因的破壞質(zhì)粒pIM203和plM204。使用衍生于xlnD序列(SEQ ID NO1)的寡核苷酸產(chǎn)生所說(shuō)的片段。xylos001是從1157至1176的位置上產(chǎn)生的，xylos004是從3147至3164位置上產(chǎn)生的。通過(guò)包含10μl 10×反應(yīng)緩沖液(100mM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl2，0.01％明膠)，4種脫氧核苷三磷酸各16μl 1.25mM，1ng質(zhì)粒pIM200 DNA，每種寡核苷酸各1μg(定容到100μl)的PCR產(chǎn)生此片段?；旌戏磻?yīng)混合物，并加入1μlTAQ聚合酶(5U/μl)(Life Technologies)。通過(guò)在92℃下溫育3分鐘使此DNA變性，接下來(lái)進(jìn)行25個(gè)循環(huán)(92℃，1分鐘；52℃，1.5分鐘；72℃，1.5分鐘)。25個(gè)循環(huán)后，將混合物在72℃下溫育5分鐘。經(jīng)瓊脂糖電泳的反應(yīng)產(chǎn)物分析顯示出一個(gè)大約2000bp的片段，基于此基因的序列，此片段的大小在預(yù)料之內(nèi)。將所得的片段亞克隆到載體pGEM-T(Promega)中，形成質(zhì)粒pIM202。在EcoRV/PstI消化的pIM202載體中通過(guò)連接pILJ16的SmaI/PstI片段(Johnstone等，1985)(包含構(gòu)巢曲霉的argB基因(Upshall等，1986))構(gòu)建質(zhì)粒pIM203。在SpeI/NsiI消化的pIM202載體中通過(guò)連接pIM130(EP 95202346.3)的NsiI/XbaI片段(包含在塔賓曲霉xlnA啟動(dòng)子UAS控制之下的pyrA基因)構(gòu)建質(zhì)粒pIM204。
11.2黑曲霉xlnD基因的破壞如實(shí)施例11.1中所述的包含xlnD內(nèi)部片段和argB基因(pIM203)或pyrA基因(pIM201)的質(zhì)粒作為在轉(zhuǎn)化中的選擇標(biāo)記用于破壞黑曲霉xlnD基因。為此，如實(shí)施例7中所述，分別利用選擇精氨酸或尿苷原養(yǎng)型的質(zhì)粒pIM203和pIM204轉(zhuǎn)化黑曲霉N902(argB15、cspA1、fwnA1、metB10、pyrA5)。如實(shí)施例8所述在1％木聚糖平板上篩選得到的轉(zhuǎn)化體對(duì)甲基傘形花內(nèi)酯基-β-木糖苷的活性。在這兩組轉(zhuǎn)化體中篩選了20個(gè)轉(zhuǎn)化體。生長(zhǎng)24小時(shí)后，在這些轉(zhuǎn)化體中每一組的MUX活性水平都有明顯減少。選擇的轉(zhuǎn)化體的Southern分析表明pIM203轉(zhuǎn)化體在同源的xlnD位點(diǎn)有多拷貝的整合。pIM204轉(zhuǎn)化體在xlnD位點(diǎn)發(fā)生單一同源整合。如實(shí)施例8中所述的，分析這些轉(zhuǎn)化體的PMP-X的活性表明β-木糖苷酶降低至少100倍。
11.3xlnD基因的過(guò)量表達(dá)和失活對(duì)黑曲霉木聚糖裂解系統(tǒng)表達(dá)的作用為了確定xlnD表達(dá)對(duì)木聚糖裂解系統(tǒng)(spectrum)表達(dá)的作用效應(yīng)，將黑曲霉N902、兩個(gè)在N902中的xlnD多拷貝轉(zhuǎn)化體、xlnD基因破壞菌株在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在1％果糖上預(yù)培養(yǎng)18小時(shí)后，轉(zhuǎn)移到2％燕麥二粒小麥木聚糖或3％D-木糖作為碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在培養(yǎng)物濾液中按照PNP-X活性測(cè)定方法確定β-木糖苷酶活性。在這兩種碳源中，對(duì)于pIM200轉(zhuǎn)化體能夠發(fā)現(xiàn)明顯的過(guò)量表達(dá)，而對(duì)于兩種(pIM203和pIM204)失活轉(zhuǎn)化體幾乎沒(méi)有PNP-X活性。xlnD基因破壞轉(zhuǎn)化體表明最初內(nèi)切木聚糖酶表達(dá)水平降低，然而在16小時(shí)后其活性最終增加，結(jié)果相對(duì)于黑曲霉野生型其活性增加，因此，所形成的木聚糖制劑中不含β-木糖苷酶。
接下來(lái)使用Dionex系統(tǒng)和脈沖Amperometric檢測(cè)通過(guò)HPLC分析方法分析培養(yǎng)物濾液。為此，收獲后立即煮沸1ml培養(yǎng)物濾液，以便失活木聚糖裂解酶，然后將樣品離心10分鐘(14,000rpm，4℃，Eppendorf離心機(jī))。將得到的上清液用bidest稀釋5倍，使用DionexCarbofac 100柱通過(guò)HPLC分析20μl上清液。分析結(jié)果表明在野生型和過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)化體中僅在最初階段能夠在培養(yǎng)物濾液中檢測(cè)到木糖寡聚物的存在。在破壞突變體中，在培養(yǎng)物濾液中積累木乙糖，而很少積累木丙糖，所以得到木寡聚物尤其是木乙糖和木丙糖的源。
實(shí)施例12黑曲霉xlnD基因在構(gòu)巢曲霉中的表達(dá)使用黑曲霉pyrA基因(位于質(zhì)粒pGW635中)作為選擇標(biāo)記和質(zhì)粒pIM200作為共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，通過(guò)共轉(zhuǎn)化構(gòu)巢曲霉G191(Balance和Turner，1985)將質(zhì)粒pIM200引入到構(gòu)巢曲霉中。如實(shí)施例7的描述制備原生質(zhì)體，并使用1.2M山梨醇作為滲透穩(wěn)定劑、1μg pGW635和25μg的pIM200進(jìn)行轉(zhuǎn)化。然后使用實(shí)施例8描述的平板測(cè)定方法篩選獲得的PYR+的xylD表達(dá)。
從此篩選中，選擇5個(gè)轉(zhuǎn)化體確定β-木糖苷酶的活性。37℃下將構(gòu)巢曲霉野生型菌株和選擇的轉(zhuǎn)化體在含有2％的Birchwood木聚糖(Roth)或3％D-木糖作為誘導(dǎo)碳源的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)26小時(shí)。除去菌絲體后，確定培養(yǎng)物濾液中相對(duì)于PNP-X的β-木糖苷酶活性。表D概括了所得的結(jié)果。結(jié)果表明xylD能夠在構(gòu)巢曲霉中使用天然表達(dá)信號(hào)表達(dá)。
表D構(gòu)巢曲霉菌株對(duì)2％木聚糖的活性對(duì)3％D-木糖的活性(mU/ml) (mU/ml)WG096(Wt) 16 0G191∷200-5725 48G191∷200-7 96 11G191∷200-9249 40G191∷200-13 520 33G191∷200-15 1525 210
實(shí)施例13篩選絲狀真菌的xlnD基因?yàn)榱朔治鍪欠衲軌蚴褂脁lnD基因的2.5bp PstI/NsiI片段作為探針，通過(guò)異源雜交從其它真菌中分離xlnD的對(duì)等部分，從下列菌株中分離DNA黑曲霉N902(argB15，cspA1，fwnA1，metB10，pyrA5)、塔賓曲霉NW184(cspA1，fwnA1，pyrA22)、FGSC 187的構(gòu)巢曲霉WG096(pabaA1，yA2)、CBS 101.43的棘孢曲霉NW240(pyrA3)、CBS 115.80的棘孢曲霉NW217(fwnA1，cspA1，pyrA4，lysA1)、CBS115.52的臭曲霉(awamori)NW183(cspA1，fwnA1，pyrA13，lysA1)和Trichoderma reesei QM9414。用BamHI或XhoI消化1-2μgDNA，接下來(lái)通過(guò)Southern分析方法進(jìn)行分析。所用的雜交條件是56℃下在6×SSC(1000毫升20×SSC含有175.3g NaCl，107.1g檸檬酸鈉.5.5H2O，pH7.0)，0.1％SDS，0.05％焦磷酸鈉，5×Denhardt溶液(參見實(shí)施例6)，20μg/ml變性鯡精DNA中雜交18-24小時(shí)，然后在56℃下5×SSC，0.1％SDS中洗滌兩次，每次30分鐘；56℃下在2×SSC，0.1％SDS中洗滌兩次，每次30分鐘。雜交后用Saran包裝膜覆蓋此膜，并在-70℃下使用Konica X-射線膠片和帶有常規(guī)增感屏的X-Omatic盒進(jìn)行過(guò)夜放射自顯影。
結(jié)果，在所有分析的真菌中現(xiàn)雜交片段，在黑曲霉、塔賓曲霉、棘孢曲霉、日本曲霉和臭曲霉發(fā)現(xiàn)非常強(qiáng)烈的雜交信號(hào)，而在構(gòu)巢曲霉和Trichoderma reesei中發(fā)現(xiàn)較強(qiáng)的雜交信號(hào)。
實(shí)施例14 xlnR基因的劑量對(duì)黑曲霉木聚糖裂解系統(tǒng)表達(dá)的作用如實(shí)施例11的描述使用19μg的包含xlnR的質(zhì)粒pIM230和2μg包含構(gòu)巢曲霉argB基因(Johnstone等，1985)的質(zhì)粒pIM650在共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中將含有編碼β-木糖苷酶的多拷貝(大約6個(gè))的黑曲霉xlnD基因的菌株N902∷200-18轉(zhuǎn)化成精氨酸原養(yǎng)型。在含有1％燕麥二粒小麥木聚糖的MM平板中篩選獲得的增加了內(nèi)切木聚糖酶表達(dá)的轉(zhuǎn)化體。選擇4個(gè)暈輪形成最快最大的菌落確定xlnR拷貝數(shù)。為此，分離這些轉(zhuǎn)化體和受體菌株的DNA，并將系列稀釋液點(diǎn)到Hybond N膜上。使用跨越xlnR基因的編碼序列的標(biāo)記的4.5kb SmaI/Xbal片段，從雜交后獲得的信號(hào)計(jì)算拷貝數(shù)?；谂c受體菌株比較，確定N902∷200-18-R14中的xlnR拷貝數(shù)為8，而N902∷200-18-R16中的拷貝數(shù)為32。對(duì)于這兩種轉(zhuǎn)化體，在菌株在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后，通過(guò)Northern分析方法分析增加基因xlnR的劑量的效應(yīng)。在1％果糖上預(yù)培養(yǎng)18小時(shí)后，在轉(zhuǎn)移到2％燕麥二粒小麥木聚糖作為碳源的轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行此項(xiàng)分析。在轉(zhuǎn)移后8和24小時(shí)取樣(菌絲樣品)，使用TriZol(Life Technologies)按照廠商的說(shuō)明從中分離總RNA，并經(jīng)Northern印跡分析方法進(jìn)行分析(Sambrook等，1989)。在這些轉(zhuǎn)化體中，木聚糖酶B的表達(dá)水平相對(duì)于受體菌株明顯增加，這一點(diǎn)是在雜交后通過(guò)使用標(biāo)記的黑曲霉xlnB的1kb EcoRI/XhoI片段確定的(Kinoshita等，1995)。
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序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名Agricultural University Wageningen(B)街道Costerweg 50(C)城市Wageningen(E)國(guó)家荷蘭(F)郵碼6701 BH(ii)發(fā)明名稱新的β-木糖苷酶和編碼該酶的核苷酸序列以及該酶的用途(iii)序列數(shù)2(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4108個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)類型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義否(vi)最初來(lái)源(A)生物體黑曲霉(CBS 120.49)(B)菌株NW147(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵TATA_信號(hào)(B)位置787..794(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置855..3266(D)其它信息/EC_號(hào)＝3.2.1.37/產(chǎn)物＝“1，4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶”/基因＝＂xlnD＂/標(biāo)準(zhǔn)名稱＝＂β-木糖苷酶＂(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵信號(hào)肽(B)位置855..932(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵成熟肽(B)位置933..3266(ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵polyA_位點(diǎn)(B)位置3383(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵polyA_位點(diǎn)(B)位置3404(xi)序列描述SEQ ID NO1CTGCAGGCCA TGTATCCTGC GAAGATGGGT GAGTGGAAGA AAATCGTCAA GATTGAGGCG 60GAGATGGCGA GGGCCGCGAT GAAGAAGGGT GGCTGGGCAC CGGAGAAGCC AGCCACCGCC 120ACGGCGGCGC AGATGAGTAT ACCGTATGCG GTGGCGTTGC AGGTTCTGGA TGGGGAGATT 180GTGCCGGGGC AGTTTGCGCC GGGCATGTTG AATCGGGAGG AGTTATGGGA TGTGATTAGG 240CTGGTGGAAT GTCGGGAGGC CAAGGAGCTG GATAATACGT GGGCGCAGAG GGTCAAGATC 300ACGTTTGAGG ATGGGGAGGT GGTGGAGAAG TTGTTGAAGG CTCCGAAGGG AGTCCATCCT 360GGGGTGACGA ATGAGGAGGT GTTGCAGAAG TGGCGGGCTG TGACGAAGGG GGTAATTTCG 420GAAGAGAGGC AGAAGAAGAT CGAGGAGATT GTGTTGAATT TGGAAGAGGT GGAGGATGTG 480GCTGGTGTTT TGGGCGAGTT GTTGAGGGAA GAGACGGTGA ATGTGCTGCA GTAGACGGTT 540ACCCCATTTG GACGGGGATG GCTTCATATT TCCCAAGCGA TGTCACGCCA TAGAAAGGGC 600ACATTTACCC GGTGCCTGAG CGAAACTCTA CTTCGAAGAC AATGCCAATG TTTAACTATC 660TTGTTTTAAT TGCTAAATGC AAACATTCCA GGTTCTTCCT AATGCCGGCT AAATCATTCA 720GGCTAAACCC CCGCGATGAA GTCAATCGGT CATTCTCCGG CGCATCTCCG CATCTCCGCA 780AACCGCTATA AAATCTACCC CAGATTCAGT CCCCGGCCAC CTTTCTATCC CCCCCCCCAC 840AGACTGGCTC AACC ATG GCG CAC TCA ATG TCT CGT CCC GTG GCT GCC ACT 890Met Ala His Ser Met Ser Arg Pro Val Ala Ala Thr-26 -25 -20 -15GCC GCT GCT CTG CTG GCT CTG GCT CTT CCT CAA GCT CTT GCC CAG GCC 938Ala Ala Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu Pro Gln Ala Leu Ala Gln Ala-10 -5 1AAC ACC AGC TAC GTC GAC TAC AAC ATC GAA GCC AAC CCG GAC TTG TAT 986Asn Thr Ser Tyr Val Asp Tyr Asn Ile Glu Ala Asn Pro Asp Leu Tyr5 10 15CCT TTG TGC ATA GAA ACC ATC CCA CTG AGC TTC CCC GAC TGC CAG AAT 1034Pro Leu Cys Ile Glu Thr Ile Pro Leu Ser Phe Pro Asp Cys Gln Asn20 25 30GGT CCC CTG CGC AGC CAT CTC ATC TGT GAT GAA ACA GCC ACC CCC TAT 1082Gly Pro Leu Arg Ser His Leu Ile Cys Asp Glu Thr Ala Thr Pro Tyr35 40 45 50GAC CGA GCA GCA TCG CTC ATC TCG CTC TTC ACC CTG GAC GAG CTG ATC 1130Asp Arg Ala Ala Ser Leu Ile Ser Leu Phe Thr Leu Asp Glu Leu Ile55 60 65GCC AAC ACC GGC AAC ACC GGC CTC GGT GTC TCC CGA CTG GGC CTC CCT 1178Ala Asn Thr Gly Asn Thr Gly Leu Gly Val Ser Arg Leu Gly Leu Pro70 75 80GCA TAC CAA GTA TGG AGT GAA GCT CTT CAC GGC CTC GAC CGT GCC AAT 1226Ala Tyr Gln Val Trp Ser Glu Ala Leu His Gly Leu Asp Arg Ala Asn85 90 95TTC AGC GAC TCA GGA GCC TAC AAT TGG GCC ACC TCA TTC CCC CAG CCC 1274Phe Ser Asp Ser Gly Ala Tyr Asn Trp Ala Thr Ser Phe Pro Gln Pro100 105 110ATC CTG ACC ACC GCG GCC CTC AAC CGC ACC CTC ATC CAC CAA ATC GCC 1322Ile Leu Thr Thr Ala Ala Leu Asn Arg Thr Leu Ile His Gln Ile Ala115 120 125 130TCC ATC ATC TCT ACC CAA GGC CGC GCC TTC AAC AAC GCC GGC CGC TAC 1370Ser Ile Ile Ser Thr Gln Gly Arg Ala Phe Asn Asn Ala Gly Arg Tyr135 140 145GGC CTC GAC GTC TAC GCC CCC AAC ATC AAC ACC TTC CGC CAC CCC GTC 1418Gly Leu Asp Val Tyr Ala Pro Asn Ile Asn Thr Phe Arg His Pro Val150 155 160TGG GGT CGC GGA CAA GAA ACC CCA GGA GAG GAC GTC TCT CTC GCC GCC 1466Trp Gly Arg Gly Gln Glu Thr Pro Gly Glu Asp Val Ser Leu Ala Ala165 170 175GTC TAC GCC TAC GAA TAC ATC ACC GGC ATC CAG GGT CCC GAC CCA GAA 1514Val Tyr Ala Tyr Glu Tyr Ile Thr Gly Ile Gln Gly Pro Asp Pro Glu180 185 190TCA AAC CTC AAA CTC GCC GCC ACG GCC AAG CAC TAC GCC GGC TAT GAC 1562Ser Asn Leu Lys Leu Ala Ala Thr Ala Lys His Tyr Ala Gly Tyr Asp195 200 205 210ATC GAG AAC TGG CAC AAC CAC TCC CGC CTG GGC AAC GAC ATG AAC ATC 1610Ile Glu Asn Trp His Asn His Ser Arg Leu Gly Asn Asp Met Asn Ile215 220 225ACC CAG CAA GAC CTC TCC GAA TAC TAC ACG CCC CAA TTC CAC GTC GCC 1658Thr Gln Gln Asp Leu Ser Glu Tyr Tyr Thr Pro Gln Phe His Val Ala230 235 240GCC CGC GAC GCC AAA GTC GAG AGT GTC ATG TGC GCC TAG AAC GCC GTC 1706Ala Arg Asp Ala Lys Val Gln Ser Val Met Cys Ala Tyr Asn Ala Val245 250 255AAC GGC GTC CCT GCC TGC GCC GAC TCC TAC TTC CTC CAG ACC CTC CrC 1754Asn Gly Val Pro Ala Cys Ala Asp Ser Tyr Phe Leu Gln Thr Leu Leu260 265 270CGC GAC ACC TTC GGA TIT GTC GAC CAC GGA TAC GTC TCC AGC GAC TGC 1802Arg Asp Thr Phe Gly Phe Val Asp His Gly Tyr Val Ser Ser Asp Cys275 280 285 290GAT GCC GCC TAT AAC ATC TAC AAC CCC CAC GGC TAT GCC TCC TCC CAG 1850Asp Ala Ala Tyr Asn Ile Tyr Asn Pro His Gly Tyr Ala Ser Ser Gln295 500 305GCT GCC GCT GCC GCT GAG GCC ATC CTC GCC GGC ACC GAC ATC GAC TGC 1898Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Ile Leu Ala Gly Thr Asp Ile Asp Cys310 315 320GGT ACC ACC TAC CAA TGG CAC CTG AAC GAG TCC ATC GCT GCG GGA GAT 1946Gly Thr Thr Tyr Gln Trp His Leu Asn Glu Ser Ile Ala Ala Gly Asp325 330 335CTC TCT CGC GAT GAT ATT GAG CAG GGT GTG ATT CGT CTC TAC ACG ACC 1994Leu Ser Arg Asp Asp Ile Glu Gln Gly Val Ile Arg Leu Tyr Thr Thr340 345 350CTC GTG CAG GCC GGA TAC TTC GAC TCC AAC ACC ACA AAG GCG AAC AAC 2042Leu Val Gln Ala Gly Tyr Phe Asp Ser Asn Thr Thr Lys Ala Asn Asn355 360 365 370CCC TAC CGC GAC CTC TCC TGG TCC GAC GTC CTT GAG ACG GAC GCA TGG 2090Pro Tyr Arg Asp Leu Ser Trp Ser Asp Val Leu Glu Thr Asp Ala Trp375 380 385AAC ATC TCC TAC CAA GCC GCG ACG CAG GGC ATT GTC CTT CTC AAG AAC 2138Asn Ile Ser Tyr Gln Ala Ala Thr Gln Gly Ile Val Leu Leu Lys Asn390 395 400TCC AAC AAC GTC CTC CCC CTC ACC GAG AAA GCT TAC CCA CCA TCC AAC 2186Ser Asn Asn Val Leu Pro Leu Thr Glu Lys Ala Tyr Pro Pro Ser Asn405 410 415ACC ACC GTC GCC CTC ATC GGT CCC TGG CCC AAC GCC ACC ACC CAA CTC 2234Thr Thr Val Ala Leu Ile Gly Pro Trp Ala Asn Ala Thr Thr Gln Leu420 425 430CTG GGC AAC TAC TAC GGC AAC GCT CCC TAC ATG ATC AGC CCC CGC GCC 2282Leu Gly Asn Tyr Tyr Gly Asn Ala Pro Tyr Met Ile Ser Pro Arg Ala435 440 445 450GCC TTC GAA GAA GCC GGA TAC AAA GTC AAC TTC GCC GAG GGC ACC GGT 2330Ala Phe Glu Glu Ala Gly Tyr Lys Val Asn Phe Ala Glu Gly Thr Gly455 460 465ATC TCC TCC ACA AGC ACC TCG GGC TTC GCT GCC GCC TTA TCC GCC GCA 2378Ile Ser Ser Thr Ser Thr Ser Gly Phe Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala470 475 480CAA TCC GCC GAC GTG ATA ATC TAC GCC GGT GGT ATC GAC AAT ACC CTT 2426Gln Ser Ala Asp Val Ile Ile Tyr Ala Gly Gly Ile Asp Asn Thr Leu485 490 495GAA GCG GAG GCA CTG GAT CGA GAG ACT ATC GCG TGG CCG GGT AAC CAA 2474Glu Ala Glu Ala Leu Asp Arg Glu Ser Ile Ala Trp Pro Gly Asn Gln500 505 510CTG GAC TTG ATC CAG AAG CTC GCC TCG GCG GCC GGA AAG AAG CCG CTC 2522Leu Asp Leu Ile Gln Lys Leu Ala Ser Ala Ala Gly Lys Lys Pro Leu515 520 525 530ATC GTC CTC CAA ATG GGC GGC GGA CAG GTC GAT TCC TCT TCG CTC AAG 2570Ile Val Leu Gln Met Gly Gly Gly Gln Val Asp Ser Ser Ser Leu Lys535 540 545AAC AAC ACC AAT GTT TCT GCA CTT CTC TGG GGC GGA TAC CCC GGC CAA 2618Asn Asn Thr Asn Val Ser Ala Leu Leu Trp Gly Gly Tyr Pro Gly Gln550 555 560TCT GGC GGC TTC GCT TTG CGG GAT ATC ATC ACG GGG AAG AAG AAC CCC 2666Ser Gly Gly Phe Ala Leu Arg Asp Ile Ile Thr Gly Lys Lys Asn Pro565 570 575GCG GGT AGA CTA GTC ACG ACG CAG TAC CCT GCC AGC TAC GCG GAG GAG 2714Ala Gly Arg Leu Val Thr Thr Gln Tyr Pro Ala Ser Tyr Ala Glu Glu580 585 590TTC CCG GCG ACA GAT ATG AAC CTT CGT CCT GAG GGT GAT AAC CCT GGT 2762Phe Pro Ala Thr Asp Met Asn Leu Arg Pro Glu Gly Asp Asn Pro Gly595 600 605 610CAG ACG TAT AAA TGG TAC ACC GGC GAA GCC GTG TAC GAG TTC GGC CAC 2810Gln Thr Tyr Lys Trp Tyr Thr Gly Glu Ala Val Tyr Glu Phe Gly His615 620 625GGG TTA TTC TAC ACG ACC TTC GCC GAA TCC TCC AGC AAT ACC ACT ACA 2858Gly Leu Phe Tyr Thr Thr Phe Ala Glu Ser Ser Ser Asn Thr Thr Thr630 635 640AAG GAA GTT AAG CTC AAC ATC CAG GAC ATT CTT TCC CAG ACA CAC GAA 2906Lys Glu Val Lys Leu Asn Ile Gln Asp Ile Leu Ser Gln Thr His Glu645 650 655GAC CTG GCG TCG ATT ACC CAG CTC CCT GTG CT AAC TTC ACC GCC AAT 2954Asp Leu Ala Ser Ile Thr Gln Leu Pro Val Leu Asn Phe Thr Ala Asn660 665 670ATC AGG AAC ACT GGA AAG CTG GAA TCG GAT TAC ACC GCT ATG GTA TTC 3002Ile Arg Asn Thr Gly Lys Leu Glu Ser Asp Tyr Thr Ala Met Val Phe675 680 685 690GCC AAT ACC TCT GAT GCC GGG CCG GCG CCG TAT CCC AAG AAG TGG CTG 3050Ala Asn Thr Ser Asp Ala Gly Pro Ala Pro Tyr Pro Lys Lys Trp Leu695 700 705GTC GGG TGG GAT CGG CTT GGG GAG GTG AAG GTC GGG GAG ACG AGG GAG 3098Val Gly Trp Asp Arg Leu Gly Glu Val Lys Val Gly Glu Thr Arg Glu710 715 720TTG AGG GTC CCC GTT GAG GTG GGG AGC TTT GCG AGG GTG AAT GAG GAT 3146Leu Arg Val Pro Val Glu Val Gly Ser Phe Ala Arg Val Asn Glu Asp725 730 735GGC GAT TGG GTG GTG TTT CCG GGA ACG TTT GAG TTG GCG TTG AAT TTG 3194Gly Asp Trp Val Val Phe Pro Gly Thr Phe Glu Leu Ala Leu Asn Leu740 745 750GAG AGG AAG GTT CGG GTG AAG GTT GTT CTT GAG GGT GAG GAG GAA GTC 3242Glu Arg Lys Val Arg Val Lys Val Val Leu Glu Gly Glu Glu Glu Val755 760 765 770GTG CTG AAG TGG CCG GGG AAG GAG TAGAAAATAC TATTCTGTTG ATGGCTCTAG 3296Val Leu Lys Trp Pro Gly Lys Glu775GGGATGAGAG TCAGCCTATT ACTGGATATG CATAGTGGTG ATACGATGTA TATAGCTCTA 3356TGAAGTAATT AGTTCAAGTG GGAATACCCC TTTCACACAT ATAGTATGCT GTTATTCCGA 3416AATAGGGATC ATTTCTGATT AATAGTAGCG GTAGCGATGG TCACACACGA CTTAATGTTC 3476CCCATTGTAC CGGAAGTAAC AATTCCAGTG ACCTCTTAGA AGAAAGACAG CAAGAAAAAG 3536TAAGAAAGGG AAATTGATCA AAAAATAAGG CCATCTACAG CCTATTCACA TTTAGCCGGA 3596TCTGCAATAC AGCTACAGAA ATAAAGTTTC TTAGGCTGCT TGCTAGCATA GCTCCTACTA 3656TACTAAACCA ACACAATGGG ACAATACCCC AATTAACCAG CCCTCACTCA ACACAAGTGA 3716ATCCTACCGA CAACATGCAT AAACCACTGC TTCCCCACCC AGCACCCTTC TTCACGATCA 3776GATCACGGAG AATTACCAAC TACTCTTCGC ATAAAACGTA AACAACGGCC TCGGGCCAGG 3836ATCCGTCCGA CTCAAAAGCA ACAAATCCCT CGTTCGCATA CTAGCCACAT GAACCTGTTG 3896CTCCGAGACC TCCTCAACTG GGTCTTCAAA TGCCCAGAAG ACGCTTTCTT CTCGATATCC 3956ATCGGATACT CGCTGGCCGC TTAGACATAT GAACGATGAG TCTCGTCTGC CAAAGGAAAC 4016AACCGTGTTC CCGAATCCAG TGTCAAAGTC GTAGGTCTGG AATTTGAAAA GTGTTCGGGC 4076GTTTCCTTGG AGGGTCGGGA GTGCGACTGC AG 4108(2)SEQ IDNO2信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4173個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義否(vi)最初來(lái)源(A)生物體黑曲霉(B)菌株CRS 120.49(C)個(gè)體分離物N400(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置連接(948..1173，1238..3495，3550..3690)(C)鑒定方法通過(guò)實(shí)驗(yàn)(D)其它信息/功能＝＂木聚糖裂解基因的轉(zhuǎn)錄激活物＂/產(chǎn)物＝＂雙核鋅指DNA結(jié)合蛋白質(zhì)＂/基因＝＂xlnR＂/標(biāo)準(zhǔn)名稱＝＂XYL R＂(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵外顯子(B)位置948..1173(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵內(nèi)含子(B)位置1174..1237(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵外顯子(B)位置1238..3495(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵內(nèi)含子(B)位置3496..3549(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵外顯子(B)位置3550..3690(xi)序列描述SEQ ID NO2CCCGGGCTTG GTTGGTCTCC GTCTGGCTTC CCCGCCTTTT TCCCCTGCAA TTCTGCATCC60CCAATCCTTC TTTTTTCTTT GCCTCGCCAG GCTGTGTCTT TTTTCCCCCT CCCCCTCCTC 120CCTCGTCAGC TTCTCTTCGA CAGCATGCGT GAGGGTCTGC TACCAACTAC AATCCTTGTT 180CTCACTGTCT GATGGTCTGA CCCGACCGTG GTGTCTGTGG TGTGTGTGTG AGAGAGAAAG 240GAAAGCTAGT CAGTCCAGTC ACTCTTTCTC GTGGGTTCTT CACCTTCCCC GGACCTGCCC 300TCCGACACTA AAAAGCCACT TCCCCCCAAC TGGTTAGTTG CTGCTAGTCT CCTTAGTTCA 360TGGTCGGCCT TGTCGCTTCT CCGGCTGACA TTCTCCTCTT CTGCTGCCTT CTAGGTCCCT 420GTTTTTTAGT CCCTGTTTTA GTTGCCCCGC AGACTGAATC GGCAATGCCG TGGAGTTGAT 480CGTTCCGTGG TTTCCTTGCG ACCGCTCCTC TGCTTCATCA TCTTTTTCCT CCTGCCCTCC 540TGGTCTTGAA TCGCCTGGCC CTCGTCTAGG ATCTGTTGCG CCAGTGTCGC CTTAATCTCC 600TTTCCCGCTA GCGTAGTGCC CTTTCACGCT TGGGGCCTTA CGGCCCTTCC ATTCGCCAGC 660GGTCTGAATA CCTCACTTTC CCCCCCAACG ACCGGGGTCT TCATGACCCG CTGGGGTGAT 720TGTTCCGCCC GGTGAGGATG TCAACCCCCT CGATTCCTCA ATTCACCAGT CCTTTCTCTC 780CCTTCTCTTC CGGATCGCAC TCGACTGGCA TGGCGCCGTC TCAGACTGTC GGGTTGGATA 840CGCTCGCCGA GGGCTCGCAG TACGTCCTGG AACAATTGCA GCTGTCGCGA GACGCTGCGG 900GAACCGGTGC CGGCGATGGC GCGACCTCCA CTTCCTTGCG AAATTCC ATG TCG CAT 956Met Ser His1ACG AAG GAT CAA CCA CCC TTT GAT AAT GAG AAG AAC CAG AGC ACT GGC 1004Thr Lys Asp Gln Pro Pro Phe Asp Asn Glu Lys Asn Gln Ser Thr Gly5 10 15TCG GGT TTT AGG GAC GCT CTG CAA AGA GAT CCC CTC GTG GAG GCT CGC 1052Ser Gly Phe Arg Asp Ala Leu Gln Arg Asp Pro Leu Val Glu Ala Arg20 25 30 35TCT GCC GTC CGC AAA ACC TCG TCT TCA GCT CCG GTT CGC CGC CGA ATC 1100Ser Ala Val Arg Lys Thr Ser Ser Ser Ala Pro Val Arg Arg Arg Ile40 45 50AGC CGT GCG TGT GAC CAG TGT AAC CAA CTC CGA ACG AAA TGC GAC GGG 1148Ser Arg Ala Cys Asp Gln Cys Asn Gln Leu Arg Thr Lys Cys Asp Gly55 60 65CAG CAT CCG TGC GCT CAT TGC ATT G GTAGGCTTCC GCTCTTTCTC 1193Gln His Pro Cys Ala His Cys Ile70 75CGATGCCGGC GATGAGGCGG ACGCTTGACT GACCTGTTCT TAG AA TTC GGA CTG 1248Glu Phe Gly LeuACC TGC GAG TAT GCG CGA GAA CGC AAG AAG CGT GGA AAA GCG TCG AAG 1296Thr Cys Glu Tyr Ala Arg Glu Arg Lys Lys Arg Gly Lys Ala Ser Lys80 85 90 95AAG GAT CTG GCG GCG GCA GCT GCG GCG GCT ACC CAA GGG TGG AAT GGT 1344Lys Asp Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gln Gly Ser Asn Gly100 105 110CAT TCC GGG CAG GCC AAC GCG TCG CTA ATG GGC GAG CGA ACG TCG GAA 1392His Ser Gly Gln Ala Asn Ala Ser Leu Met Gly Glu Arg Thr Ser Glu115 120 125GAC AGC CGG CCA GGA CAA GAC GTG AAC GGC ACA TAC GAC TCG GCT TTT 1440Asp Ser Arg Pro Gly Gln Asp Val Asn Gly Thr Tyr Asp Ser Ala Phe130 135 140GAG AGC CAC CAT CTT AGC TCG CAG CCA TCG CAT ATG CAG CAT GCA AGC 1488Glu Ser His His Leu Ser Ser Gln Pro Ser His Met Gln His Ala Ser145 150 155ACT GCA GGG ATA TCC GGC CTG CAC GAG TCT CAG ACG GCA CCG TCG CAT 1536Thr Ala Gly Ile Ser Gly Leu His Glu Ser Gln Thr Ala Pro Ser His160 165 170 175TCG CAA TCA TCG CTA GGA ACG ACT ATC GAT GCG ATG CAT TTG AAT CAT 1584Ser Gln Ser Ser Leu Gly Thr Thr Ile Asp Ala Met His Leu Asn His180 185 190TTC AAC ACG ATG AAC GAT TCC GCT CGC CCG GCA ATG TCC ATA TCC GAT 1632Phe Asn Thr Met Asn Asp Ser Gly Arg Pro Ala Met Ser Ile Ser Asp195 200 205CTG CGT TCG CTA CCC CCG TCC GTC TTA CCA CCG CAA GGA CTA AGC TCC 1680Leu Arg Ser Leu Pro Pro Ser Val Leu Pro Pro Gln Gly Leu Ser Ser210 215 220GGG TAC AAC GCG AGC GCC TTC GCT TTG GTG AAC CCG CAA GAG CCG GGC 1728Gly Tyr Asn Ala Ser Ala Phe Ala Leu Val Asn Pro Gln Glu Pro Gly225 230 235TCA CCA GCT AAC CAG TTT CGC TTG GGA AGC TCA GCG GAA AAC CCA ACC 1776Ser Pro Ala Asn Gln Phe Arg Leu Gly Ser Ser Ala Glu Asn Pro Thr240 245 250 255GCA CCG TTT CTT GGT CTC TCG CCT CCA GGA CAG TCG CCT GGA TGG CTC 1824Ala Pro Phe Leu Gly Leu Ser Pro Pro Gly Gln Ser Pro Gly Trp Leu260 265 270CCT CTT CCC TCG CCA TCT CCT GCC AAC TTT CCT TCT TTC AGC TTG CAT 1872Pro Leu Pro Ser Pro Ser Pro Ala Asn Phe Pro Ser Phe Ser Leu His275 280 285CCG TTT TCC AGC ACT TTA CGA TAC CCT GTT TTG CAG CCG GTC CTG CCT 1920Pro Phe Ser Ser Thr Leu Arg Tyr Pro Val Leu Gln Pro Val Leu Pro290 295 300CAC ATC GCC TCC ATT ATT CCG CAG TCG CTA GCG TGT GAC CTT CTG GAT 1968His Ile Ala Ser Ile Ile Pro Gln Ser Leu Ala Cys Asp Leu Leu Asp305 310 315GTT TAC TTC ACT AGT TCC TCT TCG TCC CAC CTG TCT CCC TTG TCC CCA 2016Val Tyr Phe Thr Ser Ser Ser Ser Ser His Leu Ser Pro Leu Ser Pro320 325 330 335TAC GTG GTG GGC TAC ATC TTC CGC AAG CAG TCT TTC CTT CAC CCG ACA 2064Tyr Val Val Gly Tyr Ile Phe Arg Lys Gln Ser Phe Leu His Pro Thr340 345 350AAA CCC CGA ATA TGC AGC CCC GGT CTC CTG GCG AGT ATG CTC TGG GTA 2112Lys Pro Arg Ile Cys Ser Pro Gly Leu Leu Ala Ser Met Leu Trp Val355 360 365GCC GCA CAA ACG AGT GAA GCT GCG TTT CTG ACA TCG CCG CCC TCG GCT 2160Ala Ala Gln Thr Ser Glu Ala Ala Phe Leu Thr Ser Pro Pro Ser Ala370 375 380CGG GGG CGT GTA TGC CAG AAA CTG CTA GAA CTG ACC ATT GGT TTG CTC 2208Arg Gly Arg Val Cys Gln Lys Leu Leu Glu Leu Thr Ile Gly Leu Leu385 390 395CGA CCG TTG GTC CAT GGT CCT GCT ACC GGA GAA GCG TCG CCC AAC TAT 2256Arg Pro Leu Val His Gly Pro Ala Thr Gly Glu Ala Ser Pro Asn Tyr400 405 410 415GCG GCG AAT ATG GTC ATC AAT GGC GTC GCT CTG GGC GGA TTT GGG GTC 2304Ala Ala Asn Met Val Ile Asn Gly Val Ala Leu Gly Gly Phe Gly Val420 425 430TCC ATG GAT CAG CTG GGC GCG CAA AGT AGC GCC ACC GGC GCC GTG GAT 2352Ser Met Asp Gln Leu Gly Ala Gln Ser Ser Ala Thr Gly Ala Val Asp435 440 445GAT GTA GCA ACT TAT GTG CAT CTT GCG ACA GTA GTA TCC GCC AGC GAG 2400Asp Val Ala Thr Tyr Val Hls Leu Ala Thr Val Val Ser Ala Ser Glu450 455 460TAC AAG GCG GCC AGC ATG CGC TGG TGG ACT GCG GCC TGG TCT CTA GCG 2448Tyr Lys Ala Ala Ser Met Arg Trp Trp Thr Ala Ala Trp Ser Leu Ala465 470 475CGT GAG CTG AAG CTA GGC CGT GAG CTG CCA CCC AAT GTT TCC CAC GCA 2496Arg Glu Leu Lys Leu Gly Arg Glu Leu Pro Pro Asn Val Ser His Ala480 485 490 495CGG CAA GAT GGA GAG CGA GAT GGG GAT GGC GAG GCG GAC AAA CGA CAT 2544Arg Gln Asp Gly Glu Arg Asp Gly Asp Gly Glu Ala Asp Lys Arg His500 505 510CCT CCG ACC CTC ATC ACG TCA CTG GGT CAT GGA TCG GGA AGC TCC GGC 2592Pro Pro Thr Leu Ile Thr Ser Leu Gly His Gly Ser Gly Ser Ser Gly515 520 525ATT AAT GTC ACC GAA GAG GAG CGT GAG GAG CGT CGA CGC CTA TGG TGG 2640Ile Asn Val Thr Glu Glu Glu Arg Glu Glu Arg Arg Arg Leu Trp Trp530 535 540GTC TTA TAT GCG ACC GAT CGG CAC CTG GCG CTG TGC TAG AAC CGG CCC 2688Leu Leu Tyr Ala Thr Asp Arg His Leu Ala Leu Cys Tyr Asn Arg Pro545 550 555CrC ACG CTG CTG GAC AAG GAA TGT GCC GGG CTG CTG CAG CCG ATG AAC 2736Leu Thr Leu Leu Asp Lys Glu Cys Gly Gly Leu Leu Gln Pro Met Asn560 565 570 575GAT GAT CTG TGG CAG GTC GGC GAG TTT GCA GCG GCT GCC TAG CGC GAG 2784Asp Asp Leu Trp Gln Val G1y Asp Phe Ala Ala Ala Ala Tyr Arg Gln580 585 590GTC GGA CCG CCC GTC GAG TGT ACG GGT CAC AGC ATG TAT GGA TAC TTT 2832Val Gly Pro Pro Val Glu Cys Thr Gly His Ser Met Tyr Gly Tyr Phe595 600 605CTA CCG CTG ATG ACG ATT CTT GGA GGG ATC GTC GAT CTG CAC CAC GCT 2880Leu Pro Leu Met Thr Ile Leu Gly Gly Ile Val Asp Leu His His Ala610 615 620GAG AAT CAT CCG CGC TTT GGC CTG GCG TTC CGC AAT AGC CCG GAG TGG 2928Glu Asn His Pro Arg Phe Gly Leu Ala Phe Arg Asn Ser Pro Glu Trp625 630 635GAG CGT CAG GTA CTG GAC GTT ACG CGG CAG CTG GAC ACA TAT GGG CGC 2976Glu Arg Gln Val Leu Asp Val Thr Arg Gln Leu Asp Thr Tyr Gly Arg640 645 650 655AGC TTG AAG GAA TTC GAG GCC CGC TAC ACC AGC AAC TTG ACT CTG GGG 3024Ser Leu Lys Glu Phe Glu Ala Arg Tyr Thr Ser Asn Leu Thr Leu Gly660 665 670GCT ACG GAT AAC GAG CCT GTC GTC GAA GGT GCC CAC TTG GAT CAC ACG 3072Ala Thr Asp Asn Glu Pro Val Val Glu Gly Ala His Leu Asp His Thr675 680 685AGT CCT TCG GGG CGC TCC AGC AGC ACC GTG GGA TCG CGG GTG AGC GAG 3120Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ser Ser Thr Val Gly Ser Arg Val Ser Glu690 695 700TCC ATC GTC CAC ACG AGG ATG GTG GTC GCC TAC GGG ACG CAT ATC ATG 3168Ser Ile Val His Thr Arg Met Val Val Ala Tyr Gly Thr His Ile Met705 710 715CAC GTC CTG CAT ATT TTG GTC GCG GGA AAA TGG GAG CCG GTG AAT CTG 3216His Val Leu His Ile Leu Leu Ala Gly Lys Trp Asp Pro Val Asn Leu720 725 730 735TTG GAA GAT CAT GAT CTG TGG ATC TCC TCG GAG TCG TTT GTC TCG GCC 3264Leu Glu Asp His Asp Leu Trp Ile Ser Ser Glu Ser Phe Val Ser Ala740 745 750ATG AGC CAT GCG GTC GGT GCC GCA GAA GCA GCG GCA GAA ATC TTG GAG 3312Met Ser His Ala Val Gly Ala Ala Glu Ala Ala Ala Glu Ile Leu Glu755 760 765TAC GAC CCG GAT CTC AGC TTC ATG CCG TTC TTC TTC GGG ATT TAC CTA 3360Tyr Asp Pro Asp Leu Ser Phe Met Pro Phe Phe Phe Gly Ile Tyr Leu770 775 780CTA CAG GGC AGT TTC TTG CTG CTA CTG GCG GCG GAC AAG TTG CAG GGC 3408Leu Gln Gly Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala Ala Asp Lys Leu Gln Gly785 790 795GAT GCC AGT CCC AGT GTC GTG CGG GCA TGC GAG ACG ATC GTG CGG GCG 3456Asp Ala Ser Pro Ser Val Val Arg Ala Cys Glu Thr Ile Val Arg Ala800 805 810 815CAT GAA GCG TGC GTC GTG ACC TTG AAC ACG GAG TAC CAG GTAGGTTTTC 3505His Glu Ala Cys Val Val Thr Leu Asn Thr Glu Tyr Gln820 825TTGTTTCTCT CCCTAGCTTG GCAATAGTAG CTAACACAAT GTAG AGG ACA TTC CGC 3561Arg Thr Phe Arg830AAG GTC ATG CGA TCG GCG CTG GCA CAG GTT CGA GGA CGC ATC CCA GAG 3609Lys Val Met Arg Ser Ala Leu Ala Gln Val Arg Gly Arg Ile Pro Glu835 840 845GAC TTT GGG GAG CAG CAG CAG CGC CGA CGC GAA GTG CTT GCG CTA TAC 3657Asp Phe Gly Glu Gln Gln Gln Arg Arg Arg Glu Val Leu Ala Leu Tyr850 855 860CGC TGG AGC GGC GAT GGC AGT GGG CTG GCA CTG TAGTTTTGCA GTAACACGGC3710Arg Trp Ser Gly Asp Gly Ser Gly Leu Ala Leu865 870 875TGATGATGAG ATGCGATTTA TGGCGGTGCA TTGACCGGTC AATGGCTTCT TACATTCTGA3770TTTGATACTA CTTTTGGATT CGCTATTTCA CTCCGGGCTT ATGCTGGCTT CATTGTCAAG3830AGGGGTGGCA TGGCGAATGG AAATATGCTT ACTTCGTGTT GATACGGATT CGTACATATA3890CTTTGGTGAT ATATGTGGAT ATTTGTGGCA TGTACACTAT GCGTGATCTT TGGACATGAT3950ACTTTGATAC CAGGTCAATC TAATTGCGTT CTTTTCATTT GTTGCGCAAC AGCCGAGGTA4010TGACGCCATG GCTGAGATAA GCTGCCGATA AGCATTCGCA TTCCATCCTC CATCGAAGCA4070CCAAAATCTT CTTCATATAA CCAATCCATC AATTCAACAT TCGTAATGAC AATAGTATAA4130TCCCCAAAAT GCCCTCCCTA TTACACTCCC TCCGCACTTC CCC 417權(quán)利要求
1.一種核苷酸序列或者這種核苷酸序列的一部分，所說(shuō)的核苷酸序列編碼具有β-木糖苷酶活性并在一級(jí)結(jié)構(gòu)上與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列顯示出至少30％的氨基酸等同性的肽，或者在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列雜交，所說(shuō)的核苷酸序列的一部分具有編碼SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的至少15個(gè)核苷酸。
2.按照權(quán)利要求1的核苷酸序列，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)與SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列顯示出至少40％，優(yōu)選至少60％的氨基酸等同性。
3.按照前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的核苷酸序列，這種核苷酸序列包含至少一個(gè)位于SEQ ID NO.1序列1-854之內(nèi)的調(diào)節(jié)序列。
4.一種分離的肽，這種肽具有β-木糖苷酶活性并且基本上不具有β-葡萄糖苷酶或β-半乳糖苷酶活性，并由權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的核苷酸序列編碼。
5.一種肽，這種肽包含一系列SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的至少8個(gè)鄰接的氨基酸。
6.生產(chǎn)實(shí)質(zhì)上具有β-木糖苷酶活性的肽的方法，這種方法包括以公知的翻譯核苷酸序列的方法翻譯按照權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的核苷酸序列。
7.包含按照權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的核苷酸序列的表達(dá)載體。
8.重組宿主細(xì)胞，這種宿主細(xì)胞除了包含其基因組核酸外，還包含權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的核苷酸序列。
9.具有β-木糖苷酶基因的重組宿主細(xì)胞，其中所說(shuō)的β-木糖苷酶基因已由權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的核苷酸序列中的突變所破壞。
10.按照權(quán)利要求8或9的宿主細(xì)胞，這種宿主細(xì)胞能夠表達(dá)淀粉酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、氧化還原酶、α-葡糖苷酸酶、脂酶、酯酶、阿魏酸酯酶或蛋白酶和/或木聚糖裂解調(diào)節(jié)物xylR。
11.按照權(quán)利要求8-10之任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，這種宿主細(xì)胞是食品級(jí)的。
12.按照權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，這種細(xì)胞選自曲霉屬(特別是物種塔賓曲霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、日本曲霉、臭曲霉、炭黑曲霉或構(gòu)巢曲霉)、木霉屬和鐮孢屬。
13.權(quán)利要求8-11之任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞的用途，該用途是用于經(jīng)公知的從宿主細(xì)胞產(chǎn)生酶的方法生產(chǎn)木聚糖裂解酶制劑，特別是包含內(nèi)切木聚糖酶的制劑，這種制劑基本上不具有β-木糖苷酶活性。
14.權(quán)利要求4或5的肽或者按照權(quán)利要求6的方法獲得的肽的用途，該用途是用于以公知的方法生產(chǎn)木糖，包括向含有木糖前體的培養(yǎng)基中加入所說(shuō)的肽。
15.權(quán)利要求4或5的肽或者按照權(quán)利要求6的方法獲得的肽的用途，該用途是以有關(guān)面包改進(jìn)酶的公知的方式用作面包改進(jìn)劑。
16.可由權(quán)利要求13的用途獲得的酶制劑，該酶制劑基本上含有所有木聚糖裂解活性，包括內(nèi)切木聚糖酶活性、阿拉伯呋喃糖苷酶活性，但缺乏α-木糖苷酶活性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種核苷酸序列或者是這種核苷酸序列的一部分,所說(shuō)的核苷酸序列編碼具有β－木糖苷酶活性并與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列顯示出至少30%的氨基酸等同性的肽,或者在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列雜交,所說(shuō)的核苷酸序列的一部分具有編碼SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列的至少15個(gè)核苷酸。本發(fā)明也提供了具有β－木糖苷酶活性并與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列顯示出至少30%的氨基酸等同性的肽,或者這種肽的一部分(其具有SEQ ID NO.1所示的至少8個(gè)氨基酸)。SEQ ID NO.1來(lái)自黑曲霉。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1188510SQ96194959
公開日1998年7月22日 申請(qǐng)日期1996年6月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月24日
發(fā)明者倫德特·亨德里克·德格拉夫, 諾埃爾·尼古拉斯·瑪麗亞·伊麗莎白·范佩吉, 亨麗埃特·凱瑟琳娜·范登布勒克, 雅克·菲瑟 申請(qǐng)人:丹尼斯科成分公司(丹尼斯科公司)