專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)生胰蛋白酶(胰蛋白酶原)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用絲狀真菌產(chǎn)生胰蛋白酶的方法和在這些方法中使用的DNA序列。
背景技術(shù)：
在最近幾年，轉(zhuǎn)化包括黑曲霉、米曲霉和構(gòu)巢曲霉在內(nèi)的絲狀真菌的技術(shù)已經(jīng)得到了發(fā)展。美國(guó)4,885,249(Allelix)以引入攜帶編碼選擇性標(biāo)記之基因的質(zhì)粒為例，描述了轉(zhuǎn)化黑曲霉的一般方法。
這種方法一般用于來(lái)源于其它微生物源的蛋白質(zhì)的表達(dá)和產(chǎn)生，但是也用這樣的系統(tǒng)產(chǎn)生了哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)。
然而，得到的經(jīng)驗(yàn)是胰蛋白酶(尤其哺乳動(dòng)物的胰蛋白酶)僅以極低的水平得到表達(dá)。
發(fā)明概要已驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)編碼所選擇的胰蛋白酶原基因在曲霉菌種(Aspergillus sp.)中表達(dá)時(shí)，與那些明顯從其它微生物系統(tǒng)分泌的胰蛋白酶的水平相比，分泌的胰蛋白酶的水平增加了數(shù)倍。
因此，本發(fā)明涉及用絲狀真菌產(chǎn)生胰蛋白酶(胰蛋白酶原)或其衍生物的方法，該方法包括(a)用重組DNA載體轉(zhuǎn)化絲狀真菌宿主有機(jī)體，所述重組DNA載體包含編碼胰蛋白酶原或其衍生物的DNA序列，該序列N末端融合到編碼信號(hào)肽的DNA序列上；所述信號(hào)肽可以是得自真菌(如米曲霉TAKA淀粉酶基因)的天然序列或另一信號(hào)序列或這種信號(hào)肽的衍生物；(b)在有利于胰蛋白酶原表達(dá)以及胰蛋白酶原和胰蛋白酶分泌到培養(yǎng)基中的條件下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的絲狀真菌宿主有機(jī)體；以及，(c)從培養(yǎng)基中回收胰蛋白酶原或胰蛋白酶或其衍生物。
在本文的上下文中，術(shù)語(yǔ)″衍生物″用來(lái)指一種多肽，其是通過(guò)適當(dāng)修飾編碼天然胰蛋白酶/信號(hào)肽的DNA序列從天然胰蛋白酶或信號(hào)肽(當(dāng)情況可能如此時(shí))衍生而來(lái)，所述修飾的結(jié)果是在C末端或N末端之一或兩者上添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸、在天然氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)不同位點(diǎn)上取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸、在天然氨基酸序列的C或N末端之一或兩者上或在天然氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)不同位點(diǎn)上缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸、或者在天然氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸。這種DNA序列的修飾可以用本領(lǐng)域熟知的方法實(shí)現(xiàn)。
術(shù)語(yǔ)″絲狀真菌″旨在包括藻狀菌綱、接合菌綱、子囊菌綱、擔(dān)子菌綱和半知菌類(lèi)，其中包含如曲霉屬、青霉屬、木霉屬、鐮刀菌屬和腐質(zhì)霉屬之類(lèi)的絲孢菌類(lèi)。
信號(hào)序列的存在用于指導(dǎo)所表達(dá)的胰蛋白酶原或其衍生物有效地進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，以便胰蛋白酶原或胰蛋白酶能夠容易地從培養(yǎng)基中分離(至少一些回收的產(chǎn)物是成熟的胰蛋白酶，因?yàn)閺募?xì)胞分泌的胰蛋白酶原經(jīng)歷自動(dòng)成熟過(guò)程或者由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白酶使其成熟的過(guò)程)。
在本發(fā)明中，信號(hào)序列似乎不是關(guān)鍵的，已進(jìn)行了許多試驗(yàn)，如TAKA淀粉酶(參見(jiàn)EP 0 238 023)、PTRYP胰蛋白酶以及人HTRYPI胰蛋白酶和HTRYPII信號(hào)序列(Okayama等，酶學(xué)方法154，3-28(1987)，Emi等，基因41，305-310，(1986))。
用本發(fā)明方法產(chǎn)生的胰蛋白酶(胰蛋白酶原)是任何來(lái)源的胰蛋白酶，尤其是哺乳動(dòng)物的胰蛋白酶，如豬、牛和人胰蛋白酶。
本發(fā)明還包括某些編碼豬胰蛋白酶(胰蛋白酶原)的DNA序列和其能夠表達(dá)胰蛋白酶(具有保持的它們的生物學(xué)活性)的等位基因。
此外，本發(fā)明還涉及包含所說(shuō)的DNA序列的載體和以其轉(zhuǎn)化的宿主。
表和附圖簡(jiǎn)要描述參照實(shí)施例和附圖，說(shuō)明書(shū)的下列部分將更詳細(xì)地描述本發(fā)明，其中

圖1顯示有關(guān)pHW470構(gòu)建的步驟；圖2顯示有關(guān)pHW473構(gòu)建的步驟；以及，
圖3顯示有關(guān)pHW874構(gòu)建的步驟。
發(fā)明詳述正如已指出的一樣，本發(fā)明第一方面涉及用絲狀真菌產(chǎn)生胰蛋白酶(胰蛋白酶原)或其衍生物的方法，該方法包括(a)用重組DNA載體轉(zhuǎn)化絲狀真菌宿主有機(jī)體，所述重組DNA載體包含編碼胰蛋白酶原或其衍生物的DNA序列，該序列N末端融合到編碼信號(hào)肽的DNA序列上；所述信號(hào)肽可以是得自真菌(如米曲霉TAKA淀粉酶基因)的天然序列或另一信號(hào)序列或這種信號(hào)肽的衍生物；(b)在有利于胰蛋白酶原表達(dá)以及胰蛋白酶原和胰蛋白酶分泌到培養(yǎng)基中的條件下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的絲狀真菌宿主有機(jī)體；以及，(c)從培養(yǎng)基中回收胰蛋白酶原或胰蛋白酶或其衍生物。
所說(shuō)載體還可以包含編碼有利于基因表達(dá)之功能(典型地是啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化功能)的DNA序列。
其前面可以存在如本領(lǐng)域已知的上游激活序列和增強(qiáng)子序列的啟動(dòng)子可以是在曲霉菌種(如米曲霉和黑曲霉)中顯示出強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并且可以得自編碼細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)例如淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶或糖酵解酶。
合適的啟動(dòng)子的實(shí)例是那些得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨蛋白酶、黑曲霉的中性α-淀粉酶、黑曲霉的酸穩(wěn)定α-淀粉酶、黑曲霉的葡萄糖淀粉酶、Rhizomucor miehei的脂肪酶或米曲霉的堿性蛋白酶的基因的啟動(dòng)子。得自編碼糖酵解酶的基因的啟動(dòng)子的實(shí)例是米曲霉丙糖磷酸鹽異構(gòu)酶、ADH和PGK啟動(dòng)子。
用作宿主有機(jī)體的絲狀真菌優(yōu)選地選自曲霉菌種，例如黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉。
終止和聚腺苷酸化序列可以適當(dāng)?shù)貜呐c啟動(dòng)子相同的來(lái)源得到。
用于轉(zhuǎn)化宿主有機(jī)體的技術(shù)可以從轉(zhuǎn)化構(gòu)巢曲霉方法(在例如Yelton等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)81，1984，pp.1470-1474，或EP 0 215 594中描述)適當(dāng)?shù)匦薷牡玫?；從轉(zhuǎn)化黑曲霉方法(在例如Buxton等，基因37，1985，pp.207-215或US 4,885,249中描述)適當(dāng)?shù)匦薷牡玫?；或從轉(zhuǎn)化米曲霉方法(在EP 238023中描述)適當(dāng)?shù)匦薷牡玫?。在本發(fā)明的方法中，可以用包含編碼選擇性標(biāo)記的DNA序列載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化米曲霉或黑曲霉，所述選擇性標(biāo)記能夠在轉(zhuǎn)化時(shí)摻入宿主有機(jī)體的基因組中，但是，其既不能在轉(zhuǎn)化之前由宿主表達(dá)，也不能以允許在選擇性條件下生長(zhǎng)的足夠的量表達(dá)。然后，可以基于所摻入的選擇性標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)化體并與非轉(zhuǎn)化體分離。
合適的選擇性標(biāo)記可以來(lái)源于構(gòu)巢曲霉或黑曲霉argB基因、構(gòu)巢曲霉trpC基因、構(gòu)巢曲霉amdS基因、粗糙脈孢菌pyr4或DHFR基因、或者黑曲霉或米曲霉niaD基因。
用于本發(fā)明的優(yōu)選的選擇性標(biāo)記來(lái)源于構(gòu)巢曲霉或者黑曲霉amdS或argB基因。如果選擇argB作為選擇性標(biāo)記，那么ArgB-突變菌株(其不表達(dá)ArgB基因)必須用作宿主有機(jī)體。另一方面，amdS基因在野生型米曲霉或黑曲霉菌株(其不能以允許在選擇性條件下生長(zhǎng)的足夠的量表達(dá)這一基因)中可以用作選擇性標(biāo)記。
信號(hào)序列可以選自來(lái)源于胰蛋白酶原基因本身的信號(hào)序列，或選自編碼如米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨蛋白酶、黑曲霉的中性α-淀粉酶、黑曲霉的酸穩(wěn)定α-淀粉酶、黑曲霉的葡萄糖淀粉酶、Rhizomucor miehei的脂肪酶或米曲霉的堿性蛋白酶的基因。編碼糖酵解酶的基因的實(shí)例是米曲霉丙糖磷酸鹽異構(gòu)酶、ADH和PGK。也可以使用這些信號(hào)序列的組合體和/或變體。
編碼胰蛋白酶原(其融合進(jìn)信號(hào)序列以及啟動(dòng)子和終止序列)的基因可以插入到包含選擇性標(biāo)記的載體中，或者它可以插入到引入到宿主細(xì)胞中的單獨(dú)的載體中。所述載體可以是線性的或者是封閉的環(huán)形分子。
用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適于培養(yǎng)絲狀真菌的常規(guī)培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)化體通常是穩(wěn)定的且在缺少選擇壓力的情況下也可以培養(yǎng)。然而，如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化體是不穩(wěn)定的，那么引入細(xì)胞的選擇標(biāo)記可以用于選擇。
利用熟知的方法，可以方便地從培養(yǎng)基中回收由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的胰蛋白酶原或胰蛋白酶。這些方法包括通過(guò)離心或過(guò)濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞；借助于硫酸銨之類(lèi)的鹽沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)組分；接著采用離子交換色譜、親和性色譜等之類(lèi)的色譜分析方法。
本發(fā)明還包括某些編碼豬胰蛋白酶(胰蛋白酶原)的DNA序列和其能夠表達(dá)胰蛋白酶(具有保持的它們的生物學(xué)活性)的等位基因。
本發(fā)明的第二方面涉及包含所說(shuō)的DNA序列的載體。
本發(fā)明也包括用上述載體轉(zhuǎn)化過(guò)的宿主。所述宿主可以是動(dòng)物或微生物來(lái)源的，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、細(xì)菌、酵母或者真菌，尤其是絲狀真菌來(lái)源的。
最后，本發(fā)明涉及一種重組產(chǎn)生豬胰蛋白酶的方法，該方法包括(a)用重組DNA載體轉(zhuǎn)化宿主，所述重組DNA載體包含編碼豬胰蛋白酶原或其衍生物的DNA序列，該序列N末端融合到編碼信號(hào)肽的DNA序列上，所述信號(hào)肽可以是天然序列或另一信號(hào)序列或這種信號(hào)肽的衍生物；(b)在有利于豬胰蛋白酶原表達(dá)和分泌到培養(yǎng)基中的條件下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主；以及，(c)從培養(yǎng)基中回收豬胰蛋白酶原或胰蛋白酶或其衍生物。
用下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例決不構(gòu)成對(duì)所要求的本發(fā)明的范圍的限制。材料和方法實(shí)施例實(shí)施例1人胰蛋白酶原I和II eDNA的克隆從按照Okayama等(酶學(xué)方法154，3-28(1987))方法構(gòu)建的人胰的cDNA文庫(kù)中，我們分離出了編碼兩種主要的人胰蛋白酶原同工酶(TRYI和TRYII)的eDNA克隆。Emi等(基因41，305-310，(1986))的序列用來(lái)選擇用于分離的探針NOR 9485′GCCCCCAACGATCTTGTCATCATCATC 3′SEQ ID NO3NOR 9495′GTTCAGAGTCTTCCTGTCGTATTGGGG 3′SEQ ID NO4NOR 948是TRYI和TRYII共有的，NOR 949是對(duì)TRYII特異的。按照Emi等(基因41，305-310，(1986))的報(bào)道，分離出的全長(zhǎng)克隆具有Emi等公開(kāi)的序列。這兒將質(zhì)粒pHW468命名為T(mén)RYI，將質(zhì)粒pHW469命名為T(mén)RYII。實(shí)施例2豬胰蛋白酶原cDNA的克隆利用標(biāo)準(zhǔn)方法(Maniatis 1982)從豬胰腺中純化得到mRNA。從mRNA中制備eDNA，純化eDNA，并且利用cDNA的λgtll克隆系統(tǒng)(得自Amersham，英國(guó))將cDNA插入到λgtll。制備噬菌體、平板接種細(xì)胞、用λgtll感染、擴(kuò)增以及篩選按照制造者說(shuō)明和標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Maniatis 1982)進(jìn)行。如上所述，將寡核苷酸NOR 948用于噬斑篩選。
分離和擴(kuò)增陽(yáng)性噬斑。用EcoRl消化分離的λgtll DNA，利用大腸桿菌JM101轉(zhuǎn)化體的氨芐青霉素選擇，將插入的cDNA克隆進(jìn)EcoRI切割的pBluescript SK(Stratagene)。DNA測(cè)序分析(Sequenase，美國(guó)生物化學(xué)公司)顯示所選擇的質(zhì)粒包含與已知的豬胰蛋白酶氨基酸序列(Hermodson等，生物化學(xué)12，3146-3153(1973))相容的cDNA序列。從130bp(覆蓋N末端)和740bp(覆蓋C末端)的2個(gè)EcoRI片段獲得豬前胰蛋白酶原信號(hào)肽的缺乏頂N-末端的幾乎全部序列。所產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為p185，其序列在SEQ ID NO1中顯示。實(shí)施例3人胰蛋白酶原I和II在米曲霉中的表達(dá)在曲霉屬中表達(dá)人胰蛋白酶原I和II的載體如圖1和圖2的概述進(jìn)行構(gòu)建。BamHl-PvuII接頭NOR9715′GATCCACCATGAATCCACTCCTGATCCTTACCTTTGTGGCAG 3′N(xiāo)OR9723′GTGGTACTTAGGTGAGGACTAGGAATGGAAACACCGTC 5′SEQ ID NO 5將cDNA連接到真菌表達(dá)載體p777(其在EP 0 238 023中描述)中的BamH1位點(diǎn)上。普通的接頭覆蓋TRYI信號(hào)序列的頭11個(gè)氨基酸，僅在位置3與TRYII有區(qū)別，其以亮氨酸取代其天然序列中的脯氨酸。序列的余下部分是兩物種的天然部分。
用EP238023中描述的步驟，將胰蛋白酶原表達(dá)載體pHW470和pHW473轉(zhuǎn)化到米曲霉IFO4177或其蛋白酶的缺失衍生物A1560-T40中。如WO93/00426的描述通過(guò)采用pToC 186的共轉(zhuǎn)化實(shí)施在乙酰胺上的選擇。
使轉(zhuǎn)化體在YPD培養(yǎng)基(Sherman等，酵母遺傳學(xué)方法，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1981)中生長(zhǎng)3-4天，并采用抗豬胰蛋白酶產(chǎn)生的多克隆抗體用SDS-PAGE和Western印跡分析上清液中的新蛋白質(zhì)種類(lèi)，其沒(méi)有檢測(cè)出人胰蛋白酶種類(lèi)。然而，利用L-BAPNA(L-苯甲酰-精氨酰-對(duì)硝基苯胺)作為底物的活性測(cè)定令人信服地表明TRYI和TRYII從米曲霉表達(dá)，另外，所述兩種蛋白也從米曲霉的上清液純化得到。實(shí)施例4豬胰蛋白酶在米曲霉中的表達(dá)如圖3的概述構(gòu)建豬胰蛋白酶原在曲霉屬中表達(dá)的載體。為了將TAKA淀粉酶信號(hào)的頭18個(gè)氨基酸與豬胰蛋白酶信號(hào)的最后4個(gè)氨基酸連接，我們利用了Banl-EcoRI接頭226/2235′GCACCGGCCGCGGTGGCCTTCCCGACCGACGATGACGACAAGATCGTCGGCGGG3′ GCCGGCGCCACCGGAAGGGCTGGCTGCTACTGCTGTTCTAGCAGCCGCCC225/224TACACGTGTGCAGCGAACTCGATCCCTTACCAGGTCTCGCTG 3′ 96 bATGTGCACACGTCGCTTGAGCTAGGGAATGGTCCAGAGCGACTTAA 5′ 99 bSEQ ID NO 6上述融合體也具有TAKA淀粉酶啟動(dòng)子的一部分和胰蛋白酶基因的N末端。胰蛋白酶基因的C末端區(qū)在Sub2中連接到其上，保持所采取的方向。最終的表達(dá)載體(pHW874)具有作為功能性元件的TAKA淀粉酶啟動(dòng)子和AMG終止子。這些元件得自pHD414(其在EP 0 505 311中描述)。
如實(shí)施例3的描述，將豬胰蛋白酶表達(dá)載體pHW874轉(zhuǎn)化進(jìn)米曲霉。如實(shí)施例3的描述，使轉(zhuǎn)化體在YPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并用SDS-PAGE-Western和用L-BAPNA裂解分析該轉(zhuǎn)化體。在這種情況下，在Western印跡上可見(jiàn)預(yù)期大小的豬胰蛋白酶原和成熟胰蛋白酶的明顯帶，其相當(dāng)于用L-BAPNA的活性測(cè)量。說(shuō)明書(shū)中所引用的參考文獻(xiàn)美國(guó)4,885,249(Allelix)Okayama等，酶學(xué)方法154，3-28(1987)Emi等，基因41，305-310，(1986)Yelton等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)81，1984，pp.1470-1474EP 0 215 594Buxton等，基因37，1985，pp.207-215US 4,885,249EP 0 238 023Hermodson等，生物化學(xué)12，3146-3153(1973)WO 93/00426。Sherman等，酵母遺傳學(xué)方法，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1981EP 0 505 311
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名Novo Nordi sk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國(guó)家丹麥(F)郵政編碼(ZIP)DK-2880(G)電話+45 44448888(H)傳真+45 44493256(ii)發(fā)明名稱(chēng)產(chǎn)生胰蛋白酶(胰蛋白酶原)的方法(iii)序列數(shù)6(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，1.30版本(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度897個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)原始來(lái)源(A)有機(jī)體Sus scrofa(F)組織類(lèi)型胰(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞CDS(B)位置4..744(xi)序列描述SEQ ID NO1GGA ATT CCG AAC ACC TTT GTC TTG CTT GCG CTC CTG GGA GCT GCT GTT48Ile Pro Asn Thr Phe Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ala Ala Val1 5 10 15GCT TTC CCC ACG GAT GAT GAT GAC AAG ATC GTC GGG GGT TAC ACC TGT96Ala Phe Pro Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys20 25 30GCA GCA AAT TCC ATT CCC TAC CAG GTG TCC CTG AAT TCT GGC TCC CAC144Ala Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His35 40 45TTC TGT GGT GGG TCC CTC ATC AAC AGC CAG TGG GTG GTG TCT GCT GCT192Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala50 55 60CAC TGC TAC AAG TCC CGA ATC CAG GTG CGT CTG GGA GAA CAC AAC ATC240His Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile65 70 75GAC GTC CTT GAG GGC AAT GAG CAA TTC ATC AAT GCC GCC AAG ATC ATC288Asp Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile80 85 90 95ACC CAC CCC AAT TTC AAT GGA AAT ACC TTA GAT AAC GAC ATC ATG CTG336Thr His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu100 105 110ATT AAA CTG AGC TCA CCT GCC ACT CTC AAC AGT CGA GTA GCA ACT GTC384Ile Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu Asn Ser Arg Val Ala Thr Val115 120 125TCA CTG CCA AGA TCT TGT GCA GCT GCT GGT ACC GAG TGT CTC ATC TCT432Ser Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser130 135 140GGC TGG GGC AAC ACC AAA AGC AGT GGC TCC AGC TAC CCT TCG CTC CTG480Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu145 150 155CAA TGC CTG AAG GCC CCC GTC CTA AGT GAC AGT TCT TGC AAG AGT TCC528Gln Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser160 165 170 175TAC CCA GGC CAG ATC ACC GGA AAC ATG ATC TGT GTC GGC TTC CTG GAG576Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu180 185 190GGT GGT AAG GAT TCT TGC CAG GGA GAC TCT GGT GGC CCC GTG GTC TGC 624Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys195 200 205AAT GGA CAG CTC CAG GGT ATT GTC TCT TGG GGC TAT GGC TGC GCC CAG 672Asn Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln210 215 220AAA AAC AAG CCT GGG GTC TAC ACC AAG GTC TGC AAC TAT GTG AAC TGG 720Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp225 230 235ATT CAG CAG ACC ATC GCT GCC AAC TAAAGAATTT CATTTCTTCA TGACTCTTCC 774Ile Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn240 245CTTTAGTCAT CTTCACCTTC CTCCCATCCT GCGAACAGCA TCTAAATAAA AACATTTTGA834CCTGTACCAG CATCTAAATA AAAACATTTT GAGCTGTACC CAAAAAAAAA AAAAAGGAAT894TCC 897(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度247個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Ile Pro Asn Thr Phe Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ala Ala Val Ala1 5 10 15Phe Pro Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala20 25 30Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe35 40 45Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His50 55 60Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp65 70 75 80Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr85 90 95His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile100 105 110Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser115 120 125Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly130 135 140Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln145 150 155 160Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr165 170 175Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly180 185 190Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn195 200 205Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys210 215 220Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile225 230 235 240Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn245(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA探針(iii)假設(shè)是(iv)反義否GCCCCCAACG ATCTTGTCAT CATCATC(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA探針(iii)假設(shè)是(iv)反義否GTTCAGAGTC TTCCTGTCGT ATTGGGG(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA接頭(iii)假設(shè)是(iv)反義否GATCCACCAT GAATCCACTC CTGATCCTTA CCTTTGTGGC AG(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度96個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA接頭(iii)假設(shè)是(iv)反義否GCACCGGCCG CGGTGGCCTT CCCGACCGAC GATGACGACA AGATCGTCGG CGGGTACACGTGTGCAGCGA ACTCGATCCC TTACCAGGTC TCGCTG
權(quán)利要求
1.一種用絲狀真菌產(chǎn)生胰蛋白酶或其衍生物的方法，該方法包括(a)用重組DNA載體轉(zhuǎn)化絲狀真菌宿主有機(jī)體，所述重組DNA載體包含編碼胰蛋白酶原或其衍生物的DNA序列，該序列N末端融合到編碼信號(hào)肽的DNA序列上；(b)在有利于胰蛋白酶原表達(dá)和分泌到培養(yǎng)基中的條件下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的絲狀真菌宿主有機(jī)體；以及，(c)從培養(yǎng)基中回收胰蛋白酶原或胰蛋白酶或其衍生物。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的絲狀真菌是曲霉菌種(Aspergillus sp.)。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的曲霉菌種是黑曲霉或米曲霉。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的DNA載體還包含啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子選自由黑曲霉淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉TAKA淀粉酶啟動(dòng)子組成的組。
5.按照權(quán)利要求1至4之任一的方法，其中所說(shuō)的信號(hào)序列選自包括天然胰蛋白酶原信號(hào)序列、黑曲霉淀粉酶信號(hào)和米曲霉TAKA淀粉酶信號(hào)的組。
6.按照權(quán)利要求1至5之任一的方法，其中所說(shuō)的胰蛋白酶原是動(dòng)物來(lái)源的，尤其是哺乳動(dòng)物來(lái)源的。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所說(shuō)的哺乳動(dòng)物是人或豬。
8.按照權(quán)利要求1至5之任一的方法，其中所說(shuō)的胰蛋白酶原是微生物來(lái)源的，尤其是細(xì)菌或真菌來(lái)源的。
9.一種DNA序列，該序列編碼豬胰蛋白酶原并基本上具有在SEQ ID1中給出的序列。
10.一種包含按照權(quán)利要求9的DNA序列的載體。
11.一種用權(quán)利要求10的載體轉(zhuǎn)化的宿主。
12.權(quán)利要求11的宿主，其是哺乳動(dòng)物宿主。
13.權(quán)利要求11的宿主，其是微生物宿主。
14.權(quán)利要求13的宿主，其是酵母或真菌。
15.權(quán)利要求14的宿主，其是絲狀真菌。
16.一種重組產(chǎn)生豬胰蛋白酶的方法，該方法包括(a)用重組DNA載體轉(zhuǎn)化宿主，所述重組DNA載體包含編碼豬胰蛋白酶原或其衍生物的DNA序列，該序列N末端融合到編碼信號(hào)肽的DNA序列上，所述信號(hào)肽可以是天然序列或另一信號(hào)序列或這種信號(hào)肽的衍生物；(b)在有利于豬胰蛋白酶原表達(dá)和分泌到培養(yǎng)基中的條件下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主；以及，(c)從培養(yǎng)基中回收豬胰蛋白酶原或胰蛋白酶或其衍生物。
全文摘要
可以通過(guò)以下方法用絲狀真菌產(chǎn)生胰蛋白酶(胰蛋白酶原):用包含編碼胰蛋白酶原或其衍生物的DNA序列(其N(xiāo)末端融合到編碼信號(hào)肽的DNA序列上)的載體轉(zhuǎn)化絲狀真菌;在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的絲狀真菌以產(chǎn)生胰蛋白酶原;從培養(yǎng)物中回收胰蛋白酶原和/或胰蛋白酶。
文檔編號(hào)C12N15/57GK1187849SQ9619480
公開(kāi)日1998年7月15日 申請(qǐng)日期1996年6月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月10日
發(fā)明者H·F·沃爾迪科, T·B·克杰爾德森 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司