一種酶活提高的胰蛋白酶突變體及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種酶活提高的胰蛋白酶突變體及其構(gòu)建方法，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的突變體是在序列SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基礎(chǔ)上，將第1位的酪氨酸突變成了苯丙氨酸，同時(shí)將第123位的精氨酸突變成了異亮氨酸。本發(fā)明得到的突變體在畢赤酵母中表達(dá)，3L罐發(fā)酵酰胺酶(BAPNA)酶活為85.3U/mL,酯酶(BAEE)酶活為5954U/mL，相比突變前的菌株，酶活分別提高了3.3倍、2.7倍，解決了胰蛋白酶胞外酶活低的問(wèn)題。應(yīng)用該發(fā)明中的突變體生產(chǎn)胰蛋白酶，產(chǎn)量高、工藝簡(jiǎn)化、便于工業(yè)化應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種酶活提高的胰蛋白酶突變體及其構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶活提高的胰蛋白酶突變體及其構(gòu)建方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】
[0002] 胰蛋白酶作為絲氨酸蛋白酶中的較早被發(fā)現(xiàn)應(yīng)用的一種重要類型，最早被發(fā)現(xiàn)于 哺乳動(dòng)物的腸道消化液中。商品化的胰蛋白酶多從哺乳動(dòng)物胰臟提取，由于胰臟中含豐富 的蛋白酶，對(duì)胰蛋白酶分離提純帶來(lái)困難。另外，哺乳動(dòng)物來(lái)源的胰蛋白酶多為胰酶混合 物，在醫(yī)藥應(yīng)用上存在對(duì)人體的免疫原性危害。
[0003] 灰色鏈霉菌胰蛋白酶研究，Koo-Bon-Joon等利用鏈霉菌常用宿主Streptomyces lividansl326及鏈霉菌常用的pWHM3質(zhì)粒（Ermp，紅霉素啟動(dòng)子）獲得在同屬菌中分 泌表達(dá)的重組胰蛋白酶，Chi-Won-Jae等將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到能夠產(chǎn)胰蛋白酶的灰色鏈霉菌 StreptomycesgriseusIF013350 中表達(dá)，DaisukeNohara等人（1998)將鏈霉菌膜蛋白酶 以包涵體形式在E.coli系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)。前期研究在畢赤酵母中以成熟胰蛋白酶形式 表達(dá)了灰色鏈霉菌來(lái)源的胰蛋白酶。本發(fā)明采用單點(diǎn)突變技術(shù)，基于同源建模方法，通過(guò)選 擇特定氨基酸優(yōu)化胰蛋白酶分子結(jié)構(gòu)、提高酶活。
[0004] 異源表達(dá)胰蛋白酶突出的問(wèn)題是，蛋白表達(dá)量低、胰蛋白酶酶活低。因此，定點(diǎn)突 變改造胰蛋白酶，提高胞外酶活，對(duì)于滿足胰蛋白酶工業(yè)化成產(chǎn)需求和降低生產(chǎn)成本有重 要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種酶活提高的胰蛋白酶突變體及其構(gòu)建方法。
[0006] 本發(fā)明提供一種酶活提高的胰蛋白酶突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸 序列是SEQIDNO. 1所示的序列。
[0007] 所述突變體的核苷酸序列是SEQIDN0. 3所示的序列。
[0008] 所述突變體是在如序列SEQIDN0. 2所示的氨基酸的基礎(chǔ)上，將第1位的酪氨酸 突變成了苯丙氨酸（Y1F)，同時(shí)將第123位的精氨酸突變成了異亮氨酸（R123I)。
[0009] 前期研究工作中，本研究團(tuán)隊(duì)已獲得一種產(chǎn)熱穩(wěn)定性胰蛋白酶的重組畢赤酵母工 程菌，該酵母菌表達(dá)核苷酸序列如SEQIDN0. 4所示的胰蛋白酶。
[0010] 所述編碼SEQIDN0. 2所示氨基酸序列的核苷酸序列是SEQIDN0. 4所示的序列。
[0011] 本發(fā)明還提供一種表達(dá)所述胰蛋白酶突變體的基因工程菌。
[0012] 所述基因工程菌的制備方法，是在SEQIDN0. 4所示序列的基礎(chǔ)上，將第123位的 精氨酸突變成了異亮氨酸，得到突變體R123I，同時(shí)將第1位的酪氨酸突變成苯丙氨酸（以 Y1F表示），得到重組基因，將重組基因連接到表達(dá)載體得到重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵 母宿主菌中即得到酵母基因工程菌。
[0013]所述表達(dá)載體是以下任意一種：pGAPZA、pA0815、pGAPaA、pPIC9K、pPICZB。
[0014] 所述表達(dá)載體，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中是pPIC9K。
[0015]所述酵母宿主菌是以下任意一種：pichiapastorisGS115、pichiapastoris KM71、pichiapastorisX-33、pichiapastorisSMD1168。
[0016] 所述酵母宿主菌，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中是PichiapastorisGS115。
[0017] 所述的制備方法，具體是：
[0018] (1)以3￡〇10勵(lì).4所示核苷酸序列為模板，？讓1^11^(序列如5￡〇10勵(lì).5所 示）、Rlprimer(序列如SEQIDN0. 6所示）為引物，進(jìn)行PCR得到R123I突變體；
[0019] (2)以上一步得到的突變體的基因序列為模板，F(xiàn)2primer(序列如SEQIDN0. 7所 示）、R2primer(序列如SEQIDNO. 8所示）為引物，進(jìn)行PCR，即得到序列如SEQIDNO. 3 所示的重組基因。
[0020] (3)將上一步得到的重組基因序列，連接到PPIC9K表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒 PPIC9K-重組基因，重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化PichiapastorisGS115,獲得重組酵母工程菌株，命名 為FemiGS115。
[0021] 本發(fā)明在熱穩(wěn)定性胰蛋白酶基礎(chǔ)上，通過(guò)定點(diǎn)突變生物技術(shù)改造胰蛋白酶分子結(jié) 構(gòu)，得到一株高產(chǎn)胰蛋白酶畢赤酵母工程菌，發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單、酶活高，在3L罐發(fā)酵重組菌FemiGS115的胰蛋白酶酰胺酶酶活較突變前菌株提高了 3. 3倍，胰蛋白酶酯酶酶活提高了 2. 7倍。同時(shí)突變體酶ExmtlY1F的底物親和力提高1.3倍，催化效率提高35. 7%，同時(shí)比 酶活提高35.4%。R123I自降解位點(diǎn)的突變，避免了胰蛋白酶胞外成熟后的自降解作用， Y1F突變提高了胰蛋白酶的胞外分泌。本發(fā)明解決了胰蛋白酶異源表達(dá)酶活低得限制性問(wèn) 題，為胰蛋白酶分子改造提供了一條新的思路。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1 :定點(diǎn)突變改造的胰蛋白酶表達(dá)載體構(gòu)建圖；
[0023] 圖2:重組菌FemiGS115的胰蛋白酶酰胺酶酶活圖；
[0024] 圖3:重組菌FemiGS115與原始菌株（WT)酰胺酶酶活比較圖；
[0025] 圖4:重組菌FemiGS1153L罐發(fā)酵胞外胰蛋白酶SDS-PAGE圖；其中1代表CK(對(duì) 照菌株），2-7 分別代表FemiGS115 培養(yǎng) 0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h的情況。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 胰蛋白酶酰胺酶酶活測(cè)定方法：在37°C下，測(cè)定100yL粗酶液同900iiLBAPNA溶 液在光徑〇. 5cm的反應(yīng)池中，在410nm下10min內(nèi)的吸光值變化，得到A410nm/min。酶活定 義為：在37°C下，AA410nm/min升高0. 1所需要的酶量為1個(gè)酰胺酶水解單位。（酰胺酶 酶活是更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊鹊鞍酌该富疃x方式，因?yàn)榈孜餅橐鹊鞍酌柑禺愋缘孜?。?br> [0027] 胰蛋白酶酯酶酶活測(cè)定方法：在25°C下，測(cè)定200yL粗酶液同3mLBAEE底物溶 液在光徑lcm的反應(yīng)池中，在253nm下lmin內(nèi)的吸光值變化，得到AA253nm/min。酶活定 義為：在25°C下，AA253nm/min升高0. 001即為胰蛋白酶的1個(gè)酯酶水解單位。
[0028] 實(shí)施例1含胰蛋白酶突變體的重組載體的構(gòu)建
[0029] 采用圖1所示的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒載體。
[0030](1)R123I突變體獲得：以SEQIDN0. 4所示的序列為模板，以Flprimer(序列如 5￡010勵(lì).5所示）、1?讓1^11161'(序列如3￡0 10勵(lì).6所示）為引物，進(jìn)行？〇?得到編碼氨基 酸序列第123位精氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岬耐蛔凅w（R123I)基因序列。
[0031] (2)以上一步得到的突變體的基因序列為模板，用F2primer(序列如SEQIDN0. 7 所示）、1?2口1^11161'(序列如3￡0 10勵(lì).8所示）為引物，進(jìn)行？〇?，獲得序列如3￡0 10勵(lì).3 所示的重組基因（即編碼Y1F突變體的序列）。將重組基因連接到SampleT載體上。
[0032] (3)將上一步得到的含有重組基因的SampleT載體與pPIC9K分別用Notl、 EcoRI雙酶切，純化后T4連接酶16°C過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物化學(xué)法轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。 轉(zhuǎn)化液涂布含卡那霉素（50mg/L)LB平板，提取質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒，命名為 pPIC9K-ExmtIYlF。測(cè)序工作由上海生工完成。
[0033] 實(shí)施例2產(chǎn)成熟胰蛋白酶酵母工程菌構(gòu)建
[0034] 將實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒pPIC9K_ExmtIYlF用SalI線性化，電擊轉(zhuǎn)化 pichiapastorisGS115感受態(tài)細(xì)胞，具體方法如下：
[0035] 1)接種YPD平板活化的pichiapastorisGS115 于 25mL/250mL三角瓶，30°C過(guò)夜 培養(yǎng)；1%接種上述培養(yǎng)液于50mL/500mL三角瓶，培養(yǎng)菌體濃度0D600為1. 3?1. 5 ;
[0036] 2) 5000r/min，4°C離心10min收集菌體，分別用50mL、25mL無(wú)菌水懸浮細(xì)胞；
[0037] 3)5mLlM山梨醇重懸上述細(xì)胞，5000r/min，4°C離心10min收集菌體；
[0038] 4)500iiLlM山梨醇重懸上述細(xì)胞，分裝80iiL/1.5mLEP管用于電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì) 胞；
[0039] 5) 20iiL線性化質(zhì)粒與上述80iiL感受態(tài)細(xì)胞混合，冰上靜置15min ;
[0040]6)上述混合物加入預(yù)冷的無(wú)菌電轉(zhuǎn)化杯（0. 2cm)，1500V、25iiF、200Q電擊一次， 加入lmLIM山梨醇；
[0041] 7)取上述混合物150iiL涂布MD平板，30°C培養(yǎng)3天；
[0042] 8)挑取上述平板中白色菌落，驗(yàn)證正確的重組菌。分別點(diǎn)種在l、2、3、4mg/mL(遺 傳霉素）YPD平板中，挑選在4mg/mL遺傳霉素平板中的單菌落用于搖瓶發(fā)酵，測(cè)胰蛋白酶酶 活，挑選酶活最高的重組菌，命名為重組菌FemiGS115。
[0043] 實(shí)施例3重組畢赤酵母3L罐培養(yǎng)
[0044] 將實(shí)施例2構(gòu)建的重組菌FemiGS115作為生產(chǎn)菌株，在YPD平板活化。種子液培 養(yǎng)，接種50mL/250mL種子培養(yǎng)基，30°C，220r/min培養(yǎng)24h。10 %接種800mL/3L發(fā)酵培養(yǎng) 基，口冊(cè).5,301：分階段培養(yǎng)：0-1711，5001'11^/111111培養(yǎng)，00從100%下降至8%左右，然后上 升至60%左右；17-30h，轉(zhuǎn)速逐漸上升至1000rmp/min，指數(shù)流加50%甘油，D0開(kāi)始下降至 10%左右，隨后上升至70%;30-144h，流加1.8% (V/V)甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)胰蛋白酶。以表達(dá)核苷 酸序列如SEQIDN0. 4所示的胰蛋白酶的畢赤酵母菌為對(duì)照（即沒(méi)有發(fā)生突變的菌株）。
[0045] 種子培養(yǎng)基（g/L):蛋白胨20,酵母提取物10,葡萄糖20。
[0046] 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):甘油 40 ;K2S0418 ;K0H4. 13 ;MgS04 ? 7H2014. 9 ;H3P0427mL; CaS040. 948 ;微量元素離子液（PTM1)4. 4mL;121°C滅菌 15min。
[0047] PTM1(g?I/1) :CuS04 ? 5H206 ;KI0. 09 ;MnS04 ?H203 ;H3B030. 02 ;MoNa204 ? 2H200. 2 ; CoC120. 5 ;ZnC1220 ;FeS04 ? 7H2065 ;Biotin0. 2 ;H2S045mL;0? 22iim過(guò)濾除菌。
[0048] 補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基：50% (w/v)的甘油（含12ml?L-ipTMl)。
[0049] 發(fā)酵過(guò)程中，酵母工程菌的酶活如圖2所示。從圖2可以看出，在發(fā)酵40h開(kāi)始 誘導(dǎo)產(chǎn)酶，酶活隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加，發(fā)酵133h時(shí)胰蛋白酶酰胺酶酶活達(dá)85. 3U/mL。而突變 前的重組菌3L發(fā)酵酰胺酶酶活最高為19. 8U/mL，酶活提高了 3. 3倍。同時(shí)測(cè)定了重組菌 FemiGS115和對(duì)照菌株的胰蛋白酶酯酶酶活，結(jié)果顯示：重組菌FemiGS115的酯酶酶活高達(dá) 5954U/mL，相比對(duì)照菌株的1624U/mL，提高了 2. 72倍。
[0050] 分析純化后的重組胰蛋白酶（ExmtlY1F)酶學(xué)性質(zhì)，如表1，ExmtlY1F底物親和 力提高L3倍，催化效率提高35. 7%，同時(shí)比酶活提高35.4%。由于底物親和力及催化效率 的提高，增加了突變體ExmtIY1F的比酶活。這表明該發(fā)明通過(guò)突變的創(chuàng)新方式提高了胰蛋 白酶的酶學(xué)性質(zhì)。另一方面，由于第1位氨基酸發(fā)生Y1F的突變，在3L罐發(fā)酵時(shí)，突變體的 胰蛋白酶的胞外分泌表達(dá)提高了（如圖4)。突變后的ExmtlY1F蛋白表達(dá)量為44.55mg/ L，相對(duì)于突變前（14. 03mg/L)提高了2. 18倍。
[0051] 表lExmtlY1F突變體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)
[0052]

【權(quán)利要求】
1. 一種酶活提高的胰蛋白酶突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變體是在如序列SEQ ID NO. 2所 示的氨基酸的基礎(chǔ)上，將第123位的精氨酸突變成了異亮氨酸，同時(shí)將第1位的酪氨酸突變 成了苯丙氨酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變體的核苷酸序列是SEQ ID NO. 3所示的序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的突變體，其特征在于，所述編碼SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列 的核苷酸序列是SEQ ID NO. 4所示的序列。
5. -種含有權(quán)利要求1所述突變體的重組表達(dá)載體。
6. -種表達(dá)權(quán)利要求1所述胰蛋白酶突變體的基因工程菌。
7. -種權(quán)利要求5所述基因工程菌的制備方法，是在SEQ ID NO. 4所示序列的基礎(chǔ)上， 將第123位的精氨酸突變成了異亮氨酸，同時(shí)將第1位的酪氨酸突變成了苯丙氨酸，得到重 組基因，將重組基因連接到表達(dá)載體得到重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母宿主菌中即得到 酵母基因工程菌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述方法具體是：（1)以SEQ ID NO. 4 所示核酸序列為模板，序列如SEQ ID NO. 5所示的Flprimer、序列如SEQ ID NO. 6所示的 Rlprimer為引物，進(jìn)行PCR，即得到編碼的第123位氨基酸由精氨酸突變成了異亮氨酸的 R123I突變體基因序列；（2)以上一步得到的突變體基因序列為模板，序列如SEQ ID NO. 7 所示的F2primer、序列如SEQ ID NO. 8所示的R2primer為引物，進(jìn)行PCR，即得到序列如SEQ ID N0.3所示的重組基因；（3)將上一步得到的重組基因序列，連接到pPIC9K表達(dá)載體中， 得到重組質(zhì)粒PPIC9K-重組基因，重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115,獲得重組酵母 工程菌株FemiGS115。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的制備方法，其特征在于，所述表達(dá)載體是以下任意一種： pGAP ZA、pA0815、pGAP aA、pPIC9K、pPIC ZB。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的制備方法，其特征在于，所述酵母宿主菌是以下任意 一種：pichia pastoris GS115、pichia pastoris KM71、pichia pastoris X-33、pichia pastoris SMD1168。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK104328102SQ201410612164
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】康振, 陳堅(jiān), 張?jiān)曝S, 堵國(guó)成 申請(qǐng)人:江南大學(xué)