專利名稱：：可生產(chǎn)病毒顆粒的被囊化細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及可生產(chǎn)病毒顆粒(特別是含有攜帶有治療基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒)的被囊化細(xì)胞；制備這種被囊化細(xì)胞的方法；以及應(yīng)用這種被囊化細(xì)胞將基因(特別是治療基因)運送到靶器官/細(xì)胞。將有治療作用的基因運送到靶細(xì)胞中，是基因治療的關(guān)鍵所在。如果基因治療能成為一項常規(guī)工作的話，那么最為重要的是要建立能在體內(nèi)有效地將治療基因運送到靶細(xì)胞的體系。病毒載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，是基因治療最常用的運送載體(MorganandAnderson，1993)。目前已批準(zhǔn)的基因治療方案中，極大多數(shù)采用的是體外途徑，即將細(xì)胞從病人體內(nèi)取出來，在體外進(jìn)行遺傳學(xué)修飾，然后再回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。這種途徑操作復(fù)雜，費用昂貴，而且僅限于先進(jìn)的技術(shù)設(shè)備。此外，這種途徑僅限用于易于分離、培養(yǎng)和再植入的細(xì)胞(Gunzburg等，1995)。盡管治療基因的體內(nèi)運送可提供許多優(yōu)點，但在現(xiàn)階段，該途徑不僅無效，而且也問題重重。由于基因轉(zhuǎn)移的低效性，所以一個主要的問題是需要多次應(yīng)用病毒載體。而多次載體轉(zhuǎn)移的要求，不僅使操作繁瑣，而且也可能由于直接對病毒顆粒的免疫應(yīng)答導(dǎo)致失敗。解決這些問題的一條可能的途徑是直接植入能生產(chǎn)病毒顆粒的細(xì)胞。將能生產(chǎn)含有病毒載體基因組的病毒顆粒的細(xì)胞原位植入到靶器官或靶細(xì)胞附近，也可使得病毒載體能直接應(yīng)用到靶細(xì)胞/器官中。此外，如果所使用的病毒載體病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體病毒，那么這樣一種途徑比多次單獨高劑量應(yīng)用要好，因為靶細(xì)胞經(jīng)歷復(fù)制時載體病毒在場的機(jī)會增加了，因而載體病毒感染細(xì)胞的機(jī)會也增加了。此外，低水平但持續(xù)地釋放病毒顆粒，這種情況可能有利于逃避宿主對病毒顆粒的免疫應(yīng)答。為了有效地運送病毒載體，生產(chǎn)病毒顆粒的細(xì)胞應(yīng)能夠在植入宿主后在宿主內(nèi)存活較長的時間，并且必須在此期間生產(chǎn)出病毒顆粒并從細(xì)胞中釋放出來。當(dāng)不存在明顯的免疫應(yīng)答時，如植入大腦后，這些細(xì)胞能生存很長的時間(Culver等，1992；Ram等，1993)。但要在身體的其它部位植入獲得成功，則必須保護(hù)生產(chǎn)者細(xì)胞，使其免受免疫系統(tǒng)的影響。因而這種途徑的長期有效性取決于(1)。保護(hù)細(xì)胞免受宿主免疫系統(tǒng)的影響。正常情況下宿主免疫系統(tǒng)會清除能生產(chǎn)病毒顆粒的細(xì)胞，尤其是如果能生產(chǎn)病毒顆粒的細(xì)胞是來自不同的種(而這種細(xì)胞通常是這種情況)；(2).細(xì)胞在原位能存活很長的時間，這可能要求血管化(vascularisation)。將細(xì)胞包裹到具有通透性的結(jié)構(gòu)中，這種結(jié)構(gòu)允許某些生物學(xué)活性分子的釋放，但可保護(hù)生產(chǎn)這些分子的細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)的應(yīng)答，這項工作已取得一些成功(參見綜述Chang，1995)。已將經(jīng)遺傳學(xué)修飾可生產(chǎn)人生長激素(hGH)(Tai和Sun，1993)或分泌型人腺苷脫氨酶(Hughes等，1994)的細(xì)胞進(jìn)行了被囊化。在這兩項研究中，細(xì)胞均被包裹到多聚-L-賴氨酸-褐藻酸鹽囊中，并且試驗表明，這種細(xì)胞可在培養(yǎng)基中存活很長時間，同時伴隨酶或激素的長期生成。此外，研究表明(Tai和Sun，1993)，將這種囊移植入小鼠后，細(xì)胞能存活一年，并可繼續(xù)生產(chǎn)hGH，證明囊可保護(hù)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞免受宿主免疫系統(tǒng)的破壞。也已有文獻(xiàn)報道了用別的材料來包裹細(xì)胞。已將經(jīng)遺傳學(xué)修飾可生產(chǎn)神經(jīng)生長因子的大田鼠幼鼠腎細(xì)胞包裹在聚丙烯腈/氯乙烯內(nèi)，并植入鼠大腦中。該被囊化細(xì)胞至少存活了6個月，并可繼續(xù)生產(chǎn)NGF(Winn等，1994；Deglon等，1995)。此外，已將肝細(xì)胞成功地包裹到一種纖維素硫酸鹽和聚二甲基二烯丙基銨的多聚電解質(zhì)復(fù)合物中(Stange等，1993)。90％以上的被囊化肝細(xì)胞保持了它們的活性，并且與單層生長的肝細(xì)胞相比，被囊化細(xì)胞顯示出增強(qiáng)了的代謝活力。但這并不提示纖維素硫酸鹽/聚二甲基二烯丙基銨囊能支持其它類型的細(xì)胞(如能生產(chǎn)病毒顆粒的細(xì)胞)的生長，或允許病毒顆粒從這種囊中逸出。本發(fā)明中所采用的纖維素硫酸鹽囊的制備方法已在DE4021050A1中作了詳細(xì)描述。關(guān)于纖維素硫酸鹽的合成，也已在此專利申請中作了描述。對纖維素硫酸鹽囊的綜合鑒定方法已在＂H.Dautzenberg等，生物材料技術(shù)、細(xì)胞及其固定的生物技術(shù)(Biomat.，ArtCells&Immob.Biotech.)，21(3)，399-405(1993)＂中作了詳細(xì)的研究。其它的纖維素硫酸鹽囊已在GB2135954中作了描述。纖維素囊的特性，即囊的大小、孔的大小、壁的厚度以及機(jī)械特性，取決于幾個因素，如囊制備時的物理環(huán)境、沉淀浴(precipitationbath)的粘度、其離子強(qiáng)度、溫度、加入細(xì)胞/纖維素硫酸鹽懸浮液的速度、纖維素硫酸鹽的組成、以及Dautzenberg小組所描述的其它一些參數(shù)。令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)通過將細(xì)胞包裹到一種多聚電解質(zhì)復(fù)合物中，可使病毒顆粒不斷地從植入的細(xì)胞中生產(chǎn)出來。盡管這種囊的孔徑大到足以允許已知能滅活病毒的抗體和補(bǔ)體(Welsh等，1975；Cornetta等，1990)進(jìn)入囊，但我們并沒有發(fā)現(xiàn)有顯著的免疫或炎性應(yīng)答、或在植入的囊的鄰近區(qū)域壞死的證據(jù)。此外，另一個令人驚奇發(fā)現(xiàn)是，按本發(fā)明制備的囊，能很好地移入宿主，并迅速血管化。因此按照本發(fā)明的被囊化細(xì)胞，可長期地在體內(nèi)運送攜帶有治療基因的病毒載體。本發(fā)明特別包括以下單獨或組合內(nèi)容能生產(chǎn)病毒顆粒的被囊化細(xì)胞，包括一個內(nèi)含細(xì)胞的核心；以及圍繞在該核心周圍的一個多孔囊壁，該多孔囊壁可透過所述的病毒顆粒；上述的被囊化細(xì)胞，其中所述的多孔囊壁由一個由帶反電荷的多聚電解質(zhì)所形成的多聚電解質(zhì)復(fù)合物構(gòu)成；如上述的被囊化細(xì)胞，其中所述的多孔囊壁由一個由含有硫酸基的多糖或多糖衍生物或含有磺酸基的合成多聚體，和含有四元銨基的多聚體所形成的聚電解質(zhì)復(fù)合物構(gòu)成；如上述的被囊化細(xì)胞，其中的含有硫酸基的多糖或多糖衍生物是纖維素硫酸鹽、醋酸纖維素硫酸鹽、羧甲基纖維素硫酸鹽、葡聚糖硫酸鹽、或淀粉硫酸鹽；其中的含有磺酸基的合成多聚體是一種聚苯乙烯磺酸鹽；如上述的被囊化細(xì)胞，其中的含有四元銨基的多聚體是聚二甲基二烯丙基銨或聚乙烯基苯甲基-三甲基銨；如上述的被囊化細(xì)胞，其中的多孔囊壁由纖維素硫酸鹽和聚二甲基二烯丙基銨所形成的復(fù)合物構(gòu)成；如上述的被囊化細(xì)胞，具有一種囊的形狀，其直徑為0.01～5mm，優(yōu)選地為0.1～1mm；如上述的被囊化細(xì)胞，其中所述的囊由海綿質(zhì)的纖維素硫酸鹽基質(zhì)構(gòu)成其囊內(nèi)壁，外面圍以帶小孔的囊表層；所述的海綿質(zhì)基質(zhì)內(nèi)充滿著細(xì)胞；如上述的被囊化細(xì)胞，其中的多孔囊壁的表層小孔的孔徑為80～150nm，優(yōu)選地為100～120nm；如上述的被囊化細(xì)胞，其中的由被囊化細(xì)胞生產(chǎn)的病毒顆粒是一種含有一個逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；如上述的被囊化細(xì)胞，其中的可生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的被囊化細(xì)胞是一種轉(zhuǎn)染了表達(dá)載體的包裝細(xì)胞系，該表達(dá)載體攜帶有一個逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)，其能夠感染并引導(dǎo)該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)所攜帶的一個或多個編碼序列在靶細(xì)胞中的表達(dá)；所述的包裝細(xì)胞系至少包含著一種攜帶有編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)包裝所需的蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)載體；如上述的被囊化細(xì)胞，其中至少有一種所述的編碼序列是為編碼選自標(biāo)志基因、治療基因、抗病毒基因、抗腫瘤基因、和細(xì)胞因子基因的異源肽；如上述的被囊化細(xì)胞，其中所述的標(biāo)志基因選自編碼諸如β-半乳糖苷酶、新霉素、乙醇脫氫酶、嘌呤霉素、次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(HPRT)、潮霉素、以及分泌型堿性磷酸酶等蛋白質(zhì)的標(biāo)志基因組；其中所述的治療基因是選自編碼諸如單純性皰疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脫氨基酶、鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(gpt)、細(xì)胞色素P450等蛋白質(zhì)的基因，及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因諸如SDI，編碼諸如p53等蛋白質(zhì)的腫瘤抑制基因，或編碼諸如蜂毒肽、天蠶抗菌肽、或細(xì)胞因子(如IL-2)等蛋白質(zhì)的抗增殖基因；如上述的被囊化細(xì)胞，其中的包裝細(xì)胞系選自psi-2、psi-crypt、psi-AM、GP+E-86、PA317、和GP+envAM-12；如上述的被囊化細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞系的表達(dá)載體是pBAG、pLXSN、p125LX、pLX2B1、或pc3/2B1或其衍生物；一種制備上述的被囊化細(xì)胞的工藝，包括將能生產(chǎn)病毒顆粒的細(xì)胞懸浮在一種聚電解質(zhì)水溶液中，然后將預(yù)先加工成的顆粒懸浮液導(dǎo)入內(nèi)含一種帶相反電荷的聚電介質(zhì)水溶液的沉淀浴中；如上述的一種工藝，其中的顆粒是經(jīng)噴霧形成；如上述的一種工藝，其中細(xì)胞懸浮在一種含硫酸基的多糖或多糖衍生物、或一種含磺酸基的合成多聚體的水溶液中；如上述的工藝，其中含硫酸基的多糖或多糖衍生物選自纖維素硫酸鹽、醋酸纖維素硫酸鹽、羧甲基纖維素硫酸鹽、葡聚糖硫酸鹽、或淀粉硫酸鹽；其中含磺酸基的合成多聚體是一種聚苯乙烯磺酸鹽；如上述的一種工藝，其中沉淀浴內(nèi)有一種含四元銨基的多聚體的水溶液；如上述的一種工藝，其中含有四元銨基的多聚體是聚二甲基二烯丙基銨或聚乙烯基苯甲基-三甲基銨；如上述的一種工藝，其中細(xì)胞懸浮在一種纖維素硫酸鈉的水溶液中，并被導(dǎo)入含有一種聚二甲基二烯丙基氯化銨的水溶液的沉淀浴中；如上述的一種方法，其中的纖維素硫酸鹽水溶液由0.5-50％，優(yōu)選地為2-5％的纖維素硫酸鈉及2-10％，優(yōu)選地為5％的胎牛血清的緩沖鹽構(gòu)成；如上述的一種方法，其中在沉淀浴中的水溶液由0.5-50％，優(yōu)選地為2-10％，或更優(yōu)選地為3％的聚二甲基二烯丙基氯化銨的緩沖鹽構(gòu)成；通過上述的任何一種工藝所生產(chǎn)的被囊化細(xì)胞；利用任何上述的被囊化細(xì)胞將基因運送到靶器官/細(xì)胞的步驟，包括a)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)被囊化細(xì)胞，以及b)把被囊化細(xì)胞植入一活的動物(包括人類)體內(nèi)；如上述的應(yīng)用，其中的靶器官/細(xì)胞是乳腺或胰腺；以及如上述的應(yīng)用，其中的靶器官/細(xì)胞是圍繞動脈的平滑肌細(xì)胞和其它細(xì)胞類型。本發(fā)明的一個目的是提供可生產(chǎn)病毒顆粒的被囊化細(xì)胞，這種被囊化細(xì)胞在植入宿主后，能允許細(xì)胞所生產(chǎn)的病毒顆粒從囊中釋放，并且同時并不激發(fā)明顯的宿主免疫或炎性應(yīng)答反應(yīng)。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供生產(chǎn)這種可生產(chǎn)病毒顆粒的被囊化細(xì)胞的一種工藝。本發(fā)明的另一個目的是通過將這種可生產(chǎn)病毒顆粒的被囊化細(xì)胞植入到宿主內(nèi)，提供一種將基因(尤其是治療基因)運送到靶器官/細(xì)胞的方法，并由此提供在靶器官中或靶細(xì)胞附近病毒顆粒的持續(xù)生產(chǎn)和釋放。按照本發(fā)明，提供了能生產(chǎn)病毒顆粒的被囊化細(xì)胞，這種被囊化細(xì)胞在植入宿主后，可允許細(xì)胞所產(chǎn)生的病毒顆粒從囊中釋放，并且同時并不激發(fā)明顯的宿主免疫或炎性反應(yīng)。按照本發(fā)明，被囊化細(xì)胞可通過如下步驟制備而得將能生產(chǎn)病毒顆粒的細(xì)胞懸浮在一種聚電解質(zhì)(如選自含硫酸基的多糖或多糖衍生物或含磺酸基的合成多聚體)的水溶液中，然后將預(yù)先加工成顆粒的懸浮液導(dǎo)入內(nèi)含一種帶相反電荷的聚電解質(zhì)(諸如含四元銨基的多聚體)水溶液的沉淀浴中。含硫酸基的多糖或多糖衍生物包括纖維素硫酸鹽、醋酸纖維素硫酸鹽、羧甲基纖維素硫酸鹽、葡聚糖硫酸鹽、或淀粉硫酸鹽，是以一種鹽的形式，尤其是以一種鈉鹽的形式。其中含磺酸基的合成多聚體能是一種聚苯乙烯磺酸鹽，最好是一種鈉鹽。含四元銨基的多聚體包括聚二甲基二烯丙基銨或聚乙烯基苯甲基-三甲基銨，是以其鹽的形式，優(yōu)選地是一種氯鹽。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地的實施方案中，將能生產(chǎn)病毒顆粒的細(xì)胞包裹在一個由纖維素硫酸鹽和聚二甲基二烯丙基銨所形成的復(fù)合物構(gòu)成的復(fù)合物中。制備這種囊優(yōu)選地通過將能生產(chǎn)病毒顆粒的細(xì)胞懸浮在內(nèi)含0.5-50％，優(yōu)選地為2-5％的纖維素硫酸鈉及5％的胎牛血清的溶液中(可選地在緩沖液中)，然后用調(diào)劑系統(tǒng)(dispensingsystem)(如空氣噴霧或壓電系統(tǒng))在攪拌下將懸浮液滴加到內(nèi)含0.5-50％，優(yōu)選地為2-10％，或更優(yōu)選地3％左右的聚二甲基二烯丙基氯化銨(可任選地在緩沖液中)的沉淀浴中。在數(shù)毫秒內(nèi)即可形成囊，將這種內(nèi)含細(xì)胞的囊繼續(xù)置沉淀浴中30秒～5分鐘，然后清洗。這種方法非?？焖伲_保在整個流程中細(xì)胞不被過度地擠壓(Stange等，1993)。按照本發(fā)明的囊，其直徑是可變的，在0.01～5mm之間，但優(yōu)選地在0.1～1mm之間。因此，囊可包含不同數(shù)量的細(xì)胞。采用按照本發(fā)明的被囊化工藝，能將高達(dá)1010個，但最好為105-107個可生產(chǎn)病毒顆粒的細(xì)胞包裹到聚電解質(zhì)復(fù)合物中。由纖維素硫酸鹽和聚二甲基二烯丙基銨構(gòu)成的囊具有非常好的機(jī)械性能，并且生產(chǎn)出的囊大小和孔徑均一。囊的孔徑為80～150nm，優(yōu)選地為100～120nm。被囊化的細(xì)胞可在正規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基(其性能取決于被囊化細(xì)胞)中，在標(biāo)準(zhǔn)的濕度、溫度、和CO2等濃度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，可從囊中生產(chǎn)出病毒顆粒釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基中，這可利用RT-PCR得到證實，或通過將無細(xì)胞上清液(0.45μm濾膜濾過)轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞，然后通過測定由病毒顆粒內(nèi)所含的病毒載體結(jié)構(gòu)所攜帶基因所編碼的標(biāo)志蛋白的活性得到證實。如果病毒載體所攜帶的標(biāo)志基因是一種可使靶細(xì)胞具有耐受某一特定化合物的基因，則可確定該系統(tǒng)所生產(chǎn)的病毒的效價。培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r間(一般不少于1小時，不超過30天)后，這種內(nèi)含細(xì)胞的囊可直接手術(shù)植入或用注射器注射到身體的不同部位。由按照本發(fā)明的被囊化細(xì)胞所生產(chǎn)的病毒顆?？梢允腔趯蛑委熡杏玫娜魏蔚牟《?，包括(但不僅限于)腺病毒、腺病毒相關(guān)性病毒、皰疹病毒、或逆轉(zhuǎn)錄病毒?？蓞⒖淳C述“Gunzburg和Salmons，1995”。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，被囊化的細(xì)胞是一種可生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的包裝細(xì)胞系，該逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒內(nèi)含有一個攜帶有標(biāo)志和/或治療基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)的基因組。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)由兩個組分組成1)一種攜帶有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)的表達(dá)載體(載體質(zhì)粒)，這種載體質(zhì)粒是一種經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其編碼病毒蛋白質(zhì)的基因已被要轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中去的治療基因(任意地包括標(biāo)志基因)所替代。由于將編碼病毒蛋白的基因替換后會有效地?fù)p害病毒，因此必須用系統(tǒng)中的第二個組分來援救，第二個組分可為修飾后的逆轉(zhuǎn)錄病毒提供其缺失的病毒蛋白。第二個組分是2)一種能生產(chǎn)大量病毒蛋白，但缺乏生產(chǎn)可復(fù)制病毒的能力的細(xì)胞系。這種細(xì)胞系被稱為包裝細(xì)胞系，是由轉(zhuǎn)染了攜有能使修飾后的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組得以包裝的基因的質(zhì)粒的一種細(xì)胞系構(gòu)成。這些質(zhì)?？芍笇?dǎo)合成為病毒顆粒生成所必需的病毒蛋白質(zhì)。為生成包裝好的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞系中。在這種情況下，從載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄出內(nèi)含所插入的治療基因和選擇性的標(biāo)志基因的修飾后的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，并將所得的修飾后的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包裝到逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。感染了這種病毒顆粒的細(xì)胞是不能生產(chǎn)病毒顆粒的，因為在這些細(xì)胞中不存在病毒蛋白質(zhì)。不過存在著攜帶有治療基因和標(biāo)志基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)，且目前已能在感染的細(xì)胞中得到表達(dá)。WO94/29437、WO89/11539、和WO96/07748描述了對本發(fā)明的目的有用的其它類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)。由按照本發(fā)明的被囊化細(xì)胞生產(chǎn)的病毒顆粒，能被構(gòu)建成使其含有攜帶有編碼標(biāo)志基因和/或治療基因的一個病毒載體的基因組。由病毒載體攜帶的標(biāo)志基因或治療基因能是如下的基因，例如編碼諸如β-半乳糖苷酶、新霉素、乙醇脫氫酶、嘌呤霉素、次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(HPRT)、潮霉素、以及分泌型堿性磷酸酶等蛋白質(zhì)的基因，或編碼諸如單純性皰疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脫酰銨酶、鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(gpt)、細(xì)胞色素P450等蛋白質(zhì)的治療基因，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因諸如SDI，編碼諸如p53等蛋白質(zhì)的腫瘤抑制基因，或編碼諸如蜂毒肽、天蠶抗菌肽或細(xì)胞因子(如IL-2)等蛋白質(zhì)的抗增殖基因。在一特殊的實施方案中，本發(fā)明是涉及按照本發(fā)明的被囊化細(xì)胞在腫瘤治療中的應(yīng)用。許多惡性腫瘤對化學(xué)療法沒有很好的應(yīng)答。在大多數(shù)病例中，用于治療腫瘤的抗癌藥物是全身給藥，從而擴(kuò)散到病人的全身。癌癥治療所需的這種全身性的高劑量藥物常使病人伴有不舒服的副作用。解決抗癌藥物全身性高濃度問題的一個策略是，直接在腫瘤內(nèi)或腫瘤附近直接應(yīng)用或活化藥物。這可通過將按照本發(fā)明的被囊化細(xì)胞植入到腫瘤細(xì)胞內(nèi)或其鄰近細(xì)胞而達(dá)到，該被囊化細(xì)胞能生產(chǎn)含有一工程病毒(特別是一逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)基因組的病毒顆粒，該工程病毒攜帶有編碼抗癌藥物(例如能將一種前體藥物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性因子的活性酶)的基因。在本發(fā)明的一個實施例中，提供了可生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的被囊化細(xì)胞，該逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒內(nèi)含一個攜帶有腫瘤相并酶(如細(xì)胞色素P450)基因或自殺基因(如，但并不僅限于可將非-毒性藥物轉(zhuǎn)化為一種或多種毒性代謝物的胸苷激酶)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組?？蓪⒈景l(fā)明的這種被囊化細(xì)胞植入到腫瘤(胰腺或乳腺中的腫瘤)內(nèi)或其附近，從而可用來治療癌癥。也可利用可指導(dǎo)相連的治療基因表達(dá)的靶細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元和啟動子，對特定的細(xì)胞類型進(jìn)行其它的尋靶作用(targeting)。這種靶細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元和啟動子包括例如，胰腺特異性調(diào)節(jié)元和啟動子，包括碳酸酐酶II和β-葡糖激酶調(diào)節(jié)元和啟動子；淋巴細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元和啟動子，包括免疫球蛋白和MMTV淋巴細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元和啟動子；乳腺特異性調(diào)節(jié)元和啟動子，包括乳清酸性蛋白(WAP)、鼠乳腺瘤病毒(MMTV)β-乳球蛋白和酪蛋白特異性調(diào)節(jié)元和啟動子；以及可授予對糖皮質(zhì)激素應(yīng)答性或指導(dǎo)對乳腺表達(dá)的MMTV特異性調(diào)節(jié)元和啟動子。其它的啟動子包括例如，CD4、CD34、和IL2啟動子。所述的調(diào)節(jié)元和啟動子對所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的表達(dá)具有優(yōu)選的調(diào)節(jié)作用。也可利用誘導(dǎo)啟動子，如放射誘導(dǎo)啟動子，例如細(xì)胞間粘連分子-1(ICAM-1)啟動子，表皮生長因子受體(EGFR)啟動子和腫瘤壞死(TNF)啟動子。下面的實例將對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不能理解為局限于這些實施例1用pBAG脂轉(zhuǎn)染(1ipofection)PA317并分離G418耐受細(xì)胞基于兼嗜性NIH3T3的PA317包裝細(xì)胞(Miller和Buttimore，1986)培養(yǎng)于內(nèi)含10％胎牛血清的Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中。在脂轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞接種到一個10cm組織培養(yǎng)皿中，接種密度為3×105個細(xì)胞。然后將2μg攜帶有基于MLV(鼠白血病病毒)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的pBAG載體(Price等，1987)，用GIBCO/BRL公司的脂轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine)試劑盒按照廠家說明脂轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞中。然后將細(xì)胞稀釋1∶10，培養(yǎng)在添加了400μg/mlG418(GIBCO/BRL)的普通培養(yǎng)基中。培養(yǎng)14天后，將G418耐受細(xì)胞的克隆收集合并。實施例2被囊化將107個細(xì)胞懸浮于1ml內(nèi)含2-5％纖維素硫酸鈉和5％胎牛血清的緩沖鹽溶液中，然后用調(diào)劑系統(tǒng)(空氣噴霧系統(tǒng))將懸浮液滴加到內(nèi)含2-3％聚二甲基二烯丙基銨的緩沖液的沉淀浴中。在數(shù)毫秒內(nèi)即可出現(xiàn)囊的形成，然后是有較多孔的用于機(jī)械支持的內(nèi)層的進(jìn)一步形成，內(nèi)層基本上由纖維素硫酸鹽組成。將內(nèi)含細(xì)胞的囊繼續(xù)置沉淀浴中30秒～5分鐘，然后用DMEM洗滌(Stange等，1993)。不同參數(shù)(如上所述，即纖維素硫酸鈉的濃度、空氣噴霧系統(tǒng)的流速、以及沉淀浴中的時間)下取樣，用于進(jìn)行生物學(xué)研究。代表性條件的實例是如，2.5％纖維素硫酸鈉、2％聚二甲基二烯丙基銨、在沉淀浴中1分鐘，或1.5％纖維素硫酸鈉、2％聚二甲基二烯丙基銨、在沉淀浴中0.5分鐘，或3％纖維素硫酸鈉、3％聚二甲基二烯丙基銨、在沉淀浴中2分鐘。選擇確切的參數(shù)時，也應(yīng)將所需囊的確切大小、囊壁的厚度、以及其它特性考慮在內(nèi)。實例3將囊植入鼠乳腺中用＂匙孔＂(“kevhole”)手術(shù)將囊插入到2月齡BALB/c雌性小鼠的乳腺中，入口部位縫合一針。每一手術(shù)部位可插入多達(dá)6個直徑為0.5-2mm的囊。在從囊釋放病毒的體外研究中，對囊的結(jié)構(gòu)及將囊植入免疫活性小鼠中的效應(yīng)作了研究，方法如下A)β-半乳糖苷酶活性按文獻(xiàn)(Cepko，1989)所述的組織化學(xué)染色方法檢測被感染的細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞、囊或組織切片，然后根據(jù)標(biāo)本的厚度，用2％多聚甲醛溶液固定20分鐘～24小時。用PBS充分洗滌后，將細(xì)胞、囊或組織切片置一含有底物X-gal的溶液(20mMK3FeCN6，20mMK4FeCN6·3H2O，2mMMgCl2和1mg/mlX-gal)中于37℃下孵育至少2小時。B)感染感染前6小時，將4×104個靶細(xì)胞接種到6孔組織培養(yǎng)板中。將內(nèi)含病毒生成細(xì)胞的囊置于靶細(xì)胞的上面，并向培養(yǎng)基中加入聚凝胺(8μg/ml)。4小時后，更換培養(yǎng)基以去除殘余的聚凝胺。5天后，將其中的一些孔進(jìn)行如上所述的β-半乳糖苷酶活性染色，其余孔用胰酶消化，轉(zhuǎn)移至較大的組織培養(yǎng)皿中并培養(yǎng)于內(nèi)含400μg/mlG418的培養(yǎng)基中。16天后檢測G418耐受克隆。C)RT-PCR分析將5ml囊培養(yǎng)基上清液超速離心(240,000×g，1小時，4℃)以沉淀病毒顆粒。沉淀用裂解緩沖液(1％Triton-100，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％十二烷基磺酸鈉，PBS)懸浮，按文獻(xiàn)(Salmons等，1986)所述的方法，經(jīng)酚提取、乙醇沉淀以提取RNA。然后用Ready-To-GoT-primed第一鏈試劑盒(Pharmacia)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用的引物位于MLV衍生的BAG載體LTR的被膜區(qū)(env)和R區(qū)內(nèi)(圖2)。PCR擴(kuò)增在100μl反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系內(nèi)含500mMKCl、10mMTris-HCl(pH8.3)、1.5mMMgCl2、0.01％(w/v)明膠、100μM各種dNTP、40pM各種引物、及2.5單位Taq聚合酶(PerkinElmer)。反應(yīng)于PerkinElmer公司的9600型DNA擴(kuò)增儀中在如下條件下進(jìn)行94℃，1分鐘；53℃，2分鐘；72℃，3分鐘，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后按文獻(xiàn)所述(Indraccolo等，1995)將其轉(zhuǎn)移到Zeta探針膜(BIORAD)上，并將其按文獻(xiàn)(Indraccolo等，1995)所述方法與由相同的引物并用pBAG為模板生成的一種32P-標(biāo)記的612bp的MLV基因組的PCR片段雜交。用富士(Fuji)磷成像系統(tǒng)(BAS1000)顯示MLV特異性序列。D)PCR分析利用PCR對基因組DNA(1μg)進(jìn)行擴(kuò)增，所用的一個引物位于BAG載體的殘余env序列內(nèi)，第二個引物位于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體序列外的質(zhì)粒的多瘤(polyoma)區(qū)(圖3B)。如上所述進(jìn)行PCR反應(yīng)，采用如下的反應(yīng)條件94℃，1分鐘；50℃，2分鐘；68℃，3分鐘，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物與32P-標(biāo)記的來自pBAG的1.5kbXbalDNA片段(該探針對多瘤序列特異)進(jìn)行雜交。F)電子顯微鏡用于掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)試驗的標(biāo)本用PBS(pH7.35)漂洗，并在含1％戊二醛的PBS中預(yù)固定15分鐘，然后在2％OsO4中固定15分鐘。樣品用梯度等級系列的乙醇脫水，然后將其分為兩組。a)SEM樣品用CO2進(jìn)行臨界點(critical-point-dried)干燥，并用1-3nm的鉑(EmscopeSC500；Ashford，英格蘭)包裹。包裹好的標(biāo)本在10kV場發(fā)射掃描電子顯微鏡(JeolJSM-6300F；東京，日本)中檢測，在第二種方式中用5-10kV的加速電壓。b)TEM樣品包埋在Epon中，超薄切片用乙酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛進(jìn)行雙染色，并在ZeissEM-10C(Oberkochen，德國)透射電子顯微鏡中觀察。結(jié)果從囊中釋放病毒的體外研究如上面的＂β-半乳糖苷酶活性＂試驗中所述，從實例2獲得的囊用底物X-gal對囊中的細(xì)胞染色。結(jié)果表明，細(xì)胞可表達(dá)pBAG編碼的β-半乳糖苷酶基因(圖1)，未被囊化的載體生成細(xì)胞也可表達(dá)β-半乳糖苷酶基因(未顯示)。為了證實可從囊內(nèi)的細(xì)胞中釋放病毒顆粒到細(xì)胞培養(yǎng)基中，從培養(yǎng)不同時間的囊上清液中沉淀而得病毒粒子，制備RNA。然后如上面的＂RT-PCR分析＂中所述，將RNA進(jìn)行RT-PCR分析，所用引物互補(bǔ)于病毒的env區(qū)和R區(qū)。至少6周內(nèi)可在囊培養(yǎng)基中觀察到一條MLV特異的預(yù)期大小的PCR片段(612bp)(圖2B，泳道1-4)，6周以后未作繼續(xù)分析。這一片段不是由于污染了DNA，因為若在RT-PCR前用RNase預(yù)處理病毒RNA，結(jié)果則沒有信號(圖2C；泳道1-4)。為了證實從囊中能生產(chǎn)和釋放感染性病毒，將囊與靶細(xì)胞，如NIH3T3細(xì)胞(Jainchill等，1969)或CRFK細(xì)胞(Crandell等，1973)，如上面的＂感染＂試驗中所述，進(jìn)行共培養(yǎng)。共培養(yǎng)4天后，1份靶細(xì)胞試樣以及1份被囊化的包裝細(xì)胞試樣都進(jìn)行如上所述的β-半乳糖苷酶活性染色。剩下的靶細(xì)胞用于篩選其G418耐受性。許多共培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞和CRFK細(xì)胞均顯示出能表達(dá)β-gal基因(圖3A)。為了確證靶細(xì)胞已通過感染獲得了β-gal基因，對靶細(xì)胞進(jìn)行了PCR檢測?？缮a(chǎn)BAG的包裝細(xì)胞系是PA317細(xì)胞系(Miller和Buttimore，1986)，攜帶有單純皰疹病毒胸腺激酶(HSV-TK)基因，其產(chǎn)物可將前體藥物更昔洛韋(ganciclovir)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性藥物。NIH3T3或CFRK靶細(xì)胞正常情況下并不攜帶這一基因。在一個能證實有β-gal基因表達(dá)的共培育NIH3T3和CFRK靶細(xì)胞可耐受GCV的實驗中，為了證實在該實驗中并未發(fā)生BAG生成細(xì)胞的逸出，從靶細(xì)胞中提取基因組DNA，并用PCR分析其位于載體外部的質(zhì)粒序列(上面的PCR分析)。這些序列存在于包裝細(xì)胞中，因為BAG載體以質(zhì)粒pBAG的形式脂轉(zhuǎn)染到了這些細(xì)胞內(nèi)。不過由包裝細(xì)胞所生產(chǎn)的病毒則不攜帶這些序列，因此這些序列不會存在于感染的靶細(xì)胞中，圖3B顯示未檢測到這種質(zhì)粒序列，這與用BAG載體感染這些細(xì)胞相一致。囊的結(jié)構(gòu)制備囊切片并用電子顯微鏡分析其結(jié)構(gòu)。囊的內(nèi)部由海綿狀的基質(zhì)構(gòu)成，其內(nèi)充滿了細(xì)胞(圖4)。掃描電子顯微鏡顯示，囊表面存在著一些小孔，這些小孔大得足以允許逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒從囊中釋放，因為白色小棒代表的是逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的平均直徑(圖4)。在免疫活性小鼠中的體內(nèi)穩(wěn)定性為了確定囊的體內(nèi)穩(wěn)定性以及囊或其產(chǎn)生的病毒是否會激發(fā)顯著的免疫應(yīng)答，將囊植入二月齡BALB/c雌性小鼠的乳腺中。于植入后不同時間將小鼠處死，評定囊的命運以及是否生成了感染性病毒。植入后至少6周，可清晰地看到在乳腺脂墊中包埋有植入的囊(圖5A)。令人感興趣的是，在所分析的所有動物中，都在囊的附近發(fā)生了血管化(圖5A)，推測是包裝細(xì)胞產(chǎn)生血管原因子或生長因子的結(jié)果。穿過囊及其周圍的乳腺組織的切片證實了，在緊靠囊的鄰近區(qū)可發(fā)現(xiàn)血管(圖5B)。這些切片也顯示出在囊和乳腺細(xì)胞之間有一層連接組織。沒有對囊或?qū)ζ渌牟《旧杉?xì)胞發(fā)生顯著的炎性應(yīng)答或免疫應(yīng)答的證據(jù)。為了證實感染性的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒已從囊釋放并已感染了周圍的乳腺組織，用X-gal染色對其中的一些切片分析其β-gal的表達(dá)。染色結(jié)果可清晰地看到在囊的外面有表達(dá)β-gal基因的細(xì)胞(圖5C)。實施例4本實施例描述的是構(gòu)建一種用于瘤內(nèi)感染的含有鼠細(xì)胞色素P4502B1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。表達(dá)載體pLX2B1(見圖6)是將從pLX125質(zhì)粒和pSW1質(zhì)粒獲得的片段連接構(gòu)建而成(Kedzie等，1991)。用HpaI酶將pLX125質(zhì)粒線性化，所得的平端用小牛腸磷酸酶脫磷酸化。用1％瓊脂糖凝膠分離純化DNA，并用Qiaquick方案切割和制備DNA(Qiagen)。乙醇沉淀DNA，然后將DNA重懸于水中。pSW1克隆載體用SmaI和HindII消化，產(chǎn)生兩個平端片段。將消化混合液在1％瓊脂糖凝膠上分離。采用QiaquickDNA提取方案，將內(nèi)含鼠細(xì)胞色素P4502B1cDNA(Fuji-Kuriyama等，1982)的最短的片段(1.5kb)切割和洗脫，乙醇沉淀，然后重懸于水中。將7.6fMolspLXl25和24fMols經(jīng)Saml/HindII切割的pSW1片段混合，用T4-連接酶(Boehringer)在12℃下連接3天。65℃10分鐘以滅活連接酶。用10倍體積的丁醇沉淀DNA。將DNA沉淀重懸于水中，并將其電穿孔入DH10B-細(xì)菌(Gibco)。篩選氨芐青霉素耐受克隆，制備DNA，并用SspBI/SalI、BamHI/SspBI、PvuI、和BamHI進(jìn)行消化試驗。最終的正確質(zhì)粒稱為pLX2B1。脂轉(zhuǎn)染脂轉(zhuǎn)染前一天，將3×105個PA317逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞(Miller和Buttimore，1986)接種到6cm培養(yǎng)皿中。感染當(dāng)天，將2μgpLX2B1與100μl無血清培養(yǎng)基混合。同時將15μl脂轉(zhuǎn)染胺(Lipofectamine)(GibcoBRL)與100μl無血清培養(yǎng)基混合。將含質(zhì)粒的溶液加到脂轉(zhuǎn)染胺-混合液中，并孵育45分鐘。孵育35分鐘時，包裝細(xì)胞用2ml無血清培養(yǎng)基洗一次。將800μl無血清培養(yǎng)基加到脂轉(zhuǎn)染-混合液中，將所得的1ml加到制備好的包裝細(xì)胞上面。6小時后，加1ml內(nèi)含10％FCS的Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基。第二天細(xì)胞用胰酶消化，并作1∶10稀釋，然后接種到一個100mm的培養(yǎng)皿中。24小時后，用內(nèi)含新霉素類似物G418的培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。分離單個的細(xì)胞克隆或細(xì)胞群體，分析其細(xì)胞色素P450的表達(dá)。被囊化按上述實施例2中所述，將所得的能生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細(xì)胞包裝成囊。植入將所得的囊用＂匙孔＂手術(shù)導(dǎo)入到BALB/c或GR小鼠的移植的或自發(fā)的腫瘤內(nèi)或其附近。每一手術(shù)部位插入了大約6個直徑為1mm的囊。手術(shù)部位縫合1針。然后對該小鼠用環(huán)磷酰胺或ifophamide進(jìn)行局部治療，直接往腫瘤中注射100μl20mg/ml的藥物；或進(jìn)行全身治療，130mgCPA/kg體重，腹膜內(nèi)注射，以及40-60mgIFO/kg體重，腹膜內(nèi)注射，療程最長為10周。在此期間，每天監(jiān)測腫瘤的大小和外觀形狀。然后將小鼠處死，取出內(nèi)含插入囊的組織，制備成作光學(xué)和電子顯微鏡鏡檢的組織學(xué)切片。這些切片清晰地顯示了囊植入良好，血管化，并且沒有表示細(xì)胞免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞存在的證據(jù)。相反，腫瘤則顯示出壞死，從外觀上，試驗過程中腫瘤的大小有明顯的減小。實施例5本實施例描述的是一個可表達(dá)鼠細(xì)胞色素P4502B1的穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建。pc3/2B1表達(dá)載體是由從pcDNA3(Invitrogen)和pSW1質(zhì)粒(Kedzie等，1991)獲得的片段連接構(gòu)建而成。pcDNA3質(zhì)粒用XhoI/XbaI消化，所得的粘性末端片段用小牛腸磷酸酶去磷酸化。在1％瓊脂糖凝膠上分離，并用Qiaquick方案(Qiagen)切割、制備，從而純化載體主鏈DNA。經(jīng)乙醇沉淀，然后用水重懸DNA?？寺』d體pSW1用XhoI和XbaI消化而得兩個片段。消化混合物在1％瓊脂糖凝膠上分離。將內(nèi)含鼠細(xì)胞色素P4502B1cDNA(Fuji-Kuriyama等，1982)的最短片段(1.5kb)用QiaquickDNA提取方案切割和洗脫，經(jīng)乙醇沉淀，然后用水重懸。將8.3fMolspcDNA3主鏈和24.8fMolspSW1XhoI/XbaI-片段混合在一起，用T4-連接酶(Boehringer)在12℃下連接1天。65℃10分鐘以滅活連接酶，然后用10倍體積的丁醇沉淀DNA。將DNA沉淀重懸于水中，并將其電穿孔到DH10B-細(xì)菌(Gibco)中。篩選氨芐青霉素耐受克隆，制備DNA，并用EcoRI、BamHI、EcoRV和XhoI進(jìn)行消化試驗。最終的正確質(zhì)粒稱為pc3/2B1。脂轉(zhuǎn)染感染前一天，，將3×105個NIH3T3細(xì)胞接種到35mm培養(yǎng)皿中。感染當(dāng)天，將2μgpc3/2B1與100μl無血清培養(yǎng)基混合。同時將15μl脂轉(zhuǎn)染胺(Lipofectamine)與100μl無血清培養(yǎng)基混合。將含質(zhì)粒的溶液加到脂轉(zhuǎn)染胺-混合液中，并孵育45分鐘。孵育35分鐘時，細(xì)胞用2ml無血清培養(yǎng)基洗一次。將800μl無血清培養(yǎng)基加到脂轉(zhuǎn)染-混合液中，將所得的1ml加到制備好的細(xì)胞上面。6小時后，加1ml內(nèi)含10％FCS的DMEM(Glutamax)。第二天細(xì)胞用胰酶消化，并作1∶10稀釋，然后接種到一個100mm的培養(yǎng)皿中。24小時后，用內(nèi)含新霉素的培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。14天后，將新霉素耐受克隆分離，并檢測載體的存在和活性。按實施例2所述，制備內(nèi)含這些細(xì)胞的囊，并將其植入到小鼠的腫瘤部位附近。用環(huán)磷酰胺或ifosphamide治療，如上所述評價其療效。圖示圖1穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了pBAG的被囊化PA317細(xì)胞的組織學(xué)染色，證實有β-半乳糖苷酶的表達(dá)。圖2由囊釋放的病毒顆粒的RT-PCR分析。(2B；泳道1-4囊培養(yǎng)2、3、5、6周后的培養(yǎng)基)。非被囊化的BAG病毒生成細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基作為陽性對照(泳道5)，非轉(zhuǎn)染的PA317的培養(yǎng)基作為陰性對照(泳道6)。如果在進(jìn)行RT-PCR分析之前先用RNase消化病毒標(biāo)本，則未觀察到信號，確保所擴(kuò)增的條帶是來自病毒RNA(2C；泳道1-4)。從非被囊化BAG病毒生成細(xì)胞制備而得的未經(jīng)過RNase處理的病毒RNA，在RT-PCR中作為陽性對照(泳道7)。圖3將被囊化病毒生成細(xì)胞與NIH3T3細(xì)胞共培養(yǎng)。(A)在內(nèi)含逆轉(zhuǎn)錄病毒載體生成包裝細(xì)胞的囊加入之前一天，將靶細(xì)胞低密度接種。幾天后，細(xì)胞和囊均進(jìn)行組織學(xué)染色以測定其β-半乳糖苷酶活性。(B)為了證實A中的β-半乳糖苷酶表達(dá)靶細(xì)胞是由感染而得，而不是由于從病毒生成細(xì)胞的逸出，從細(xì)胞提取基因組DNA并進(jìn)行PCR分析。圖4掃描電子顯微鏡所顯示的囊表面，在高倍放大下，可看到類似小孔的結(jié)構(gòu)。白色小棒表示100nm(逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的直徑)，指示這些結(jié)構(gòu)可以代表小孔，病毒可以通過這些小孔從囊釋放出來。圖5植入小鼠乳腺中的囊的組織學(xué)分析。(A)(B)植入小鼠乳腺4周時，穿過一個囊的切片的光學(xué)顯微鏡(133倍放大)(C)植入含BAG載體生成PA317細(xì)胞的囊后，小鼠乳腺細(xì)胞的感染。圖6內(nèi)含鼠細(xì)胞色素P4502B1基因的pLX2B1表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)，其在啟動子轉(zhuǎn)變后，將由U3-MMTV啟動子控制。參考文獻(xiàn)Cepko，C.(1989)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化的譜系分析(Lineageanalysisinthevertebratenervoussystembyretrovirus-mediatedgenetransfer).神經(jīng)科學(xué)方法(Meth.Neurosci.)1,367-392.Chang，P.L.(1995)非自體的基因治療(Nonautologoussomaticgenetherapy)。體細(xì)胞基因治療(InSomaticGeneTherapy.)P.L.Chang，ed.(CRCPress，BocaRaton)pp.203-223.Cometta，K.，Moen，R.C.，Culver，K.，Morgan，R.A，Mclachlin，J.R.，Sturm，S，Selegue，J，London，W.，Blaese，R.M.，andAnderson，W.F.(1990)鼠白血病兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒不是靈長類的急性病原體(Amphotropicmurineleukemiaretrovirusisnotanacutepathogenforprimates)人類基因治療(Hum.GeneTher.)1，15-30.Crandelll，R.A.，F(xiàn)abricant，C.G.，andNelson-Rees，W.A.(1973).貓(Feliscatus)腎細(xì)胞系(CRFK)的發(fā)育，特性，和病毒易染性(Development，characterization，andvirussusceptibilityofafeline(Feliscatus)renalcellline(CRFK)).體外試驗(Invitro)9，176-185.Culver，K.W.，Ram，Z.，Wallbridge，S.，lshii，H.，Oldfield，E.H.，andBaese，R.M.(1992).在體內(nèi)用逆轉(zhuǎn)錄病素載體產(chǎn)生細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因以治療試驗性腦瘤(Invivogenetransferwithretroviralvectorproducercellsfortreatmentofexperimentalbraintumors).科學(xué)(Science)256，1550-1552.Deglon，N.，Zurn，A.，Baetge，E.，andAebischer，P.(1995)神經(jīng)變性性疾?。籔arkinson氏病，Alzheimer病和肌萎縮性側(cè)索硬化的基因治療的進(jìn)展；聚合物包被的神經(jīng)營養(yǎng)-分泌細(xì)胞的鞘內(nèi)移植(Developmentofgenetherapyforthetreatmentofneurodegenerativediseases；Parkinsondisease，Alzheimerdiseaseandamyotrophiclateralsclerosistherapy；polymerencapsulatedneurotrophic-secretin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-crypt、psi-AM、GP+E-86、PA317、和GP+envAM-12。15.按照權(quán)利要求11的被囊化細(xì)胞，其中的表達(dá)載體是pBAG、pLXSN、p125LX、pLX2B1、或pc3/2B1或其衍生物。16.一種制備按照權(quán)利要求1-15的被囊化細(xì)胞的工藝，包括將能生產(chǎn)病毒顆粒的細(xì)胞懸浮在一種聚電解質(zhì)水溶液中，然后將預(yù)先加工成的顆粒的懸浮液導(dǎo)入內(nèi)含一種帶相反電荷的聚電介質(zhì)水溶液的沉淀浴中。17.按照權(quán)利要求16的一種工藝，其中的顆粒是經(jīng)噴霧形成。18.按照權(quán)利要求16-17的一種工藝，其中的細(xì)胞懸浮在一種含硫酸基的多糖或多糖衍生物、或一種含磺酸基的合成多聚體的水溶液中。19.按照權(quán)利要求18的一種工藝，其中含硫酸基的多糖或多糖衍生物選自纖維素硫酸鹽、醋酸纖維素硫酸鹽、羧甲基纖維素硫酸鹽、葡聚糖硫酸鹽、或淀粉硫酸鹽；其中含磺酸基的合成多聚體是一種聚苯乙烯磺酸鹽。20.按照權(quán)利要求16-17的一種工藝，其中沉淀浴內(nèi)有一種含四元銨基的多聚體的水溶液。21.按照權(quán)利要求20的一種工藝，其中含有四元銨基的多聚體是聚二甲基二烯丙基銨或聚乙烯基苯甲基-三甲基銨。22.按照權(quán)利要求16-17的一種工藝，其中細(xì)胞懸浮在一種纖維素硫酸鈉的水溶液中，并被導(dǎo)入含有一種聚二甲基二烯丙基氯化銨的水溶液的沉淀浴中。23.按照權(quán)利要求22的一種方法，其中的纖維素硫酸鹽水溶液由0.5-50％，優(yōu)選地為2-5％的纖維素硫酸鈉及2-10％，優(yōu)選地為5％的胎牛血清的緩沖鹽構(gòu)成。24.按照權(quán)利要求22的一種方法，其中在沉淀浴中的水溶液由0.5-50％，優(yōu)選地為2-10％，或更優(yōu)選地為3％的聚二甲基二烯丙基氯化銨的緩沖鹽構(gòu)成。25.按照權(quán)利要求1-15的被囊化細(xì)胞，是按照權(quán)利要求16-24中的任一權(quán)利要求所述的一種工藝生產(chǎn)的。26.應(yīng)用按照權(quán)利要求1-15的被囊化細(xì)胞將基因運送到靶器官/細(xì)胞的步驟包括a)在一合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)被囊化細(xì)胞，以及b)把被囊化細(xì)胞植入一活的動物(包括人類)體內(nèi)。27.按照權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中的靶器官/細(xì)胞是乳腺或胰腺。28.按照權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中的靶器官/細(xì)胞是圍繞動脈的平滑肌細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及可生產(chǎn)病毒顆粒(特別是含有攜帶有治療基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒)的被囊化細(xì)胞;制備這種被囊化細(xì)胞的方法;以及用這種被囊化細(xì)胞治療疾病的應(yīng)用。文檔編號C12N7/00GK1189104SQ96195050公開日1998年7月29日申請日期1996年6月24日優(yōu)先權(quán)日1995年6月27日發(fā)明者羅伯特·M·薩勒,沃爾特·H·岡茲伯格,布賴恩·薩蒙斯申請人:巴法理安諾迪克研究協(xié)會有限公司,Gsf環(huán)境與健康研究中心有限公司