專利名稱：能夠在具有蜜二糖、水蘇四糖和棉子糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的釀酒酵母菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的釀酒酵母(S. cerevisiae)菌株。為了其更好地分泌，在α-半乳糖苷酶的基因上融合了信號(hào)序列。所述的菌株用于在富含棉子糖、 蜜二糖和/或水蘇四糖的培養(yǎng)基中生產(chǎn)α “半乳糖苷酶，生物質(zhì)和乙醇的方法中，并且如果菌株含有表達(dá)具有治療功能蛋白的二級(jí)構(gòu)建體，則可以用于生產(chǎn)所述治療蛋白。
背景技術(shù)：
α -半乳糖苷酶(EC 3. 2. 1. 22)催化半乳糖殘基水解，該殘基與半乳糖低聚糖和半乳糖甘露糖聚合物(帶有半乳糖支鏈的甘露糖聚合物)通過α (1,6)糖苷鍵結(jié)合；也水解在豆子，大豆及其他豆類中存在的諸如水蘇四糖，棉子糖和蜜二糖的低聚糖。這些酶廣泛地分布在動(dòng)物，植物和微生物中。但是大多數(shù)單胃哺乳動(dòng)物包括人類，缺乏胰腺α-半乳糖苷酶以至于這種類型的低聚糖不能在消化系統(tǒng)中消化，并通過腸道微生物群落發(fā)酵產(chǎn)生氣體引起腸胃氣脹和其他形式腸胃紊亂，可導(dǎo)致問題的嚴(yán)重性因個(gè)體敏感度而不同。大豆及其衍生產(chǎn)品具有特別的重要性，因?yàn)樗鼈兪窃S多人飲食的重要組成部分，基于它們是好的蛋白質(zhì)的來源，在某些情況下可以用作乳制品的替代品，例如對(duì)于不能耐受乳糖的人群而言。有一些由來自不同來源(乳酸球菌(Lactococus)，曲霉菌 (Aspergillusniger)，酵母(Saccharomyces)等)的α -半乳糖苷酶濃縮物構(gòu)成的食品補(bǔ)充物，例如，諸如Promefarm(Sinaire)生產(chǎn)的片劑用于治療這些紊亂。這些大豆制品以及其他制備的用于人和動(dòng)物消耗的具有高含量的非消化性低聚糖如棉子糖，水蘇四糖的產(chǎn)品用α-半乳糖苷酶的預(yù)處理，是很好的替代方法以避免這些腸胃問題。其進(jìn)一步的貢獻(xiàn)是增強(qiáng)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；這一點(diǎn)通常在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中是非常重要的，因?yàn)閷?duì)飼料能量的利用在增加。在人體內(nèi)，α -半乳糖苷酶是一種溶酶體的外切糖苷酶，在糖脂和糖蛋白的α -半乳糖基型末端殘基上發(fā)生作用。這個(gè)基因的變異導(dǎo)致降解的缺乏，引起Fabry氏病(X-連鎖溶酶體貯積病)。這種疾病的發(fā)病率為1/40，000。今天的治療手段有，例如由美國(guó)健贊公司(Genzyme Corp.)開發(fā)的(Fabrazyme，β -半乳糖苷酶A靜脈滴注劑)，其基于酶替代性技術(shù)通過將人類α-半乳糖苷酶在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)用于治療該疾病。更有效降低成本的選擇是將哺乳動(dòng)物細(xì)胞用于異源蛋白的生產(chǎn)；人類α-半乳糖苷酶重組表達(dá)在酵母上的應(yīng)用已經(jīng)被研究。另外，在紅細(xì)胞的表面的糖蛋白杯型結(jié)構(gòu)在許多其他功能中，決定了每一個(gè)個(gè)體的血型。0型血可以輸給任何個(gè)體，因此它是最被需要的。0型血可以被通過使用能夠加工 α (1-3)型半乳糖鍵的α-半乳糖苷酶的B型血冒充。α-半乳糖苷酶也被用于在工業(yè)水平上生產(chǎn)焦糖和糖類以去除棉子糖的存在，這將抑制焦糖的適當(dāng)結(jié)晶，并因此改進(jìn)了該生產(chǎn)。此外，糖蜜，該工業(yè)中的廢產(chǎn)品具有很高的棉子糖和水蘇四糖含量，意味著由于其具有很高的生物降解能力(BOD)不能被直接拋棄。 這種生產(chǎn)該糖的酶或者有機(jī)體被用于降解這些糖并將這種降解與其他功能結(jié)合，例如生產(chǎn)乙醇或者生物質(zhì)。進(jìn)一步，糖蜜被廣泛地作為基質(zhì)，用于每年大約生產(chǎn)430000噸(干重)制造面包用的釀酒酵母(S. cerevisiae)。這種制備面包用的酵母菌株缺乏α -半乳糖苷酶， 并且釀酒酵母菌株已經(jīng)被開發(fā)用于制備面包，該類菌株是帶有編碼α-半乳糖苷酶基因的釀酒酵母變型葡萄汁酵母菌株(S. cerevisiae Var. uvarum)，目的在于提高這種生物質(zhì)的生產(chǎn)(利爾耶施特勒姆_索米寧等；應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué).1988年1月；第54卷第1期，第 245-249 M) ( Liljestrom-Suominen et al. ；Appl Environ Microbiol. 1988 Jan ；54(1) 245-249)。就酵母來說，已經(jīng)有文獻(xiàn)記載了，α -半乳糖苷酶釋放在半乳糖的末端的非還原殘基，該殘基是位于該底物的末端的位置而不是內(nèi)部的殘基0。除了水解活性外，α-半乳糖苷酶具有在高濃度單糖存在下，通過轉(zhuǎn)糖基作用和反向水解合成低聚糖的能力0。釀酒酵母是研究最多的α-半乳糖苷酶來源之一以及其在生物技術(shù)上的應(yīng)用是廣泛的()?？紤]到這種酶的重要性和廣泛的生物技術(shù)應(yīng)用，有關(guān)于從細(xì)菌(bacteria) 生產(chǎn)α -半乳糖苷酶的資料，所述細(xì)菌例如有嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophi lus)(美國(guó)專利號(hào)3846239)，嗜熱菌種(Thermus sp.)菌株 T2 (西班牙專利號(hào)2172380)，淺灰白鏈霉菌(Sti^ptomyces griseoloalbus) (Anisha et al. ；Appl Biochem Biotechnol. 2008 Sept 4) (Anisha 等；生物化學(xué)生物技術(shù)應(yīng)用.2008 年 9 月 4 日)，然而考慮到這種酶具有的很多應(yīng)用與涉及動(dòng)物或人類食品的原料的加工或制備有關(guān)，必須是，這些將要被使用的微生物是GRAS (GeneralIy Recognized As Safe,公認(rèn)為安全的)，釀酒酵母就是例子。也有關(guān)于從真菌生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的資料，所述真菌是鏈抱霉屬(Neurospora)禾口根霉屬(Rhizopus) (fforthington and Beuchat, J Agric Food Chem. 1974 ；22 (6) 1063-6)(沃辛頓和伯沙，食品農(nóng)業(yè)化學(xué)雜志.1974年第22卷第6期第 1063-6 頁)，米曲霉菌(Aspergillus oryzae),臭曲霉菌(A. foetidus) (Liu et al., Lett Appl Microbiol. 2007 Aug ；45 (2) :206_12)(劉等，生物工程與應(yīng)用微生物.2007 年 8月第45卷第2期第206-12頁)，無花果曲霉菌種(A. ficuum) (Zapater et al.，Prep Biochem. 1990 ；20 (3-4) :263_96)(薩帕特爾等，制備生物化學(xué)· 1990年第20卷第3-4期第263-96頁)和黑曲霉種(A.niger)(美國(guó)專利號(hào)6197566和5919690)，其中，然而真菌生產(chǎn)的主要的缺點(diǎn)之一是產(chǎn)生不想要的副產(chǎn)品。就在黑曲霉中生產(chǎn)α-半乳糖苷酶來說， 大量的草酸產(chǎn)生。同樣地，有關(guān)于生產(chǎn)非人類的α-半乳糖苷酶的資料，例如從融合不同信號(hào)序列的瓜爾豆植物存在的(Cyamopsis tetragonoloba) (Harmsen, Μ. et al.，Gene. 1993 Mar 30 ； 125 (2) 115-23)(哈姆森，Μ·等，基因.1993 年 3 月 30 日第 125 卷第 2 期第 115-23 頁)。關(guān)于在酵母中生產(chǎn)，美國(guó)專利4431737描述了一種變異的生產(chǎn)α _半乳糖苷酶的釀酒酵母菌株，該菌株通過紫外線照射的方法突變獲得。通過用紫外線誘導(dǎo)處理突變得到的菌株的缺點(diǎn)是，由于嘧啶引物的構(gòu)型導(dǎo)致了雙螺旋結(jié)構(gòu)的局部扭曲，干擾了正常互補(bǔ)堿基配對(duì)，從而使這種處理根本性改變了 DNA ；這反過來干擾復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程以及接下來的生長(zhǎng)和呼吸。因此，除了能夠具有其他不想要的突變外，因此突變的菌株也經(jīng)常具有低生長(zhǎng)率。有另外的專利(美國(guó)專利號(hào)5055401)，其中用編碼葡萄汁酵母菌(S. cerevisiae var. uvarum)的α _半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)化的酵母菌株已經(jīng)被構(gòu)建得到(利爾耶施特勒姆-索米寧等，1988) (Liljestrom-Suominen et al.，1988)。從其他的酵母分泌進(jìn)入培養(yǎng)基中的人類α -半乳糖苷酶已經(jīng)生產(chǎn)得到，例如巴斯德畢赤酵母菌(Pichia Pastoris)(陳，Y.等， 蛋白質(zhì)表達(dá)和純化.2000年12月；第20卷第3期第472-84頁)(Chen，Y. et al.，Protein Expr Purif. 2000 Dec ；20 (3) :472_84)。因此，通過有效和改進(jìn)的方式從酵母中生 產(chǎn)和獲得α-半乳糖苷酶是在生物技術(shù)上一個(gè)有特別興趣的目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供通過本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的釀酒酵母菌株，在食品工業(yè)和生物技術(shù)公司有多種應(yīng)用的由酵母產(chǎn)生的α-半乳糖苷酶的生產(chǎn)。α-半乳糖苷酶催化活性的開發(fā)有用的是，例如在生產(chǎn)甜菜糖和大豆加工過程中棉子糖的水解中；在酵母菌株對(duì)糖蜜的使用中，在研究Fabry疾病的治療方法中，和作為使動(dòng)物飲食中能量的利用最大化和治療人類胃腸紊亂的食品補(bǔ)充劑。因此，一方面，本發(fā)明涉及一種DNA構(gòu)建體，包括通過葡萄糖阻遏作用調(diào)節(jié)的異源啟動(dòng)子，編碼酵母中功能信號(hào)序列的序列，和編碼成熟形式的α “半乳糖苷酶的MELl基因的片段或其功能等同變異體，其中序列(b)和(c)必須在相同閱讀框內(nèi)。另一方面，本發(fā)明涉及一種DNA構(gòu)建體，包含ADH2啟動(dòng)子或其功能等同變異體，編碼酵母中功能信號(hào)序列和編碼成熟形式的α“半乳糖苷酶的基因片段或其功能等同變異體，其中信號(hào)序列和編碼成熟形式的α-半乳糖苷酶基因必須在相同閱讀框內(nèi)。另一方面，本發(fā)明涉及一種本發(fā)明的DNA構(gòu)建體之一編碼的蛋白。另一方面，本發(fā)明涉及一種含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體。又另一方面，本發(fā)明涉及一種含有本發(fā)明構(gòu)建體的微生物，本發(fā)明DNA構(gòu)建體之一編碼的蛋白，含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體之一的表達(dá)載體。另一方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的方法，包含培養(yǎng)微生物和從培養(yǎng)基中回收分泌的α-半乳糖苷酶的步驟。另一方面，本發(fā)明涉及一種獲得細(xì)胞生物質(zhì)的方法，包含步驟在含有α-D-半乳糖的末端位置的非還原殘基的基質(zhì)上培養(yǎng)含有具有本發(fā)明的構(gòu)建體的表達(dá)載體的微生物和回收細(xì)胞生物質(zhì)。另一方面，本發(fā)明涉及一種獲得乙醇的方法，包括步驟，在含有α-D-半乳糖末端位置的非還原性殘基的基質(zhì)上培養(yǎng)含有具有本發(fā)明的構(gòu)建體的表達(dá)載體的微生物和回收所制備的乙醇。另一方面，本發(fā)明涉及一種微生物，包含具有本發(fā)明構(gòu)建體的表達(dá)載體且還具有編碼目標(biāo)蛋白的基因的二級(jí)構(gòu)建體。另一方面，本發(fā)明涉及一種獲得蛋白的方法，包含步驟在含有α-D-半乳糖的末端位置的非還原殘基的基質(zhì)上培養(yǎng)含有具有本發(fā)明的構(gòu)建體表達(dá)載體且還具有編碼目標(biāo)蛋白的基因的二級(jí)構(gòu)建體的微生物，和回收目標(biāo)蛋白。


圖1顯示含有編碼釀酒酵母α -半乳糖苷酶的完整基因的分泌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的釀酒酵母菌株的600納米吸收度測(cè)量值與細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)和總的α-半乳糖苷酶活性曲線。細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的α“半乳糖苷酶活性測(cè)定是四個(gè)獨(dú)立的測(cè)定結(jié)果。圖2顯示含有編碼釀酒酵母α-半乳糖苷酶的完整基因的分泌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的釀酒酵母菌株(黑色符號(hào)和實(shí)線)與含有在ADHl啟動(dòng)子下編碼釀酒酵母α -半乳糖苷酶的基因轉(zhuǎn)化的釀酒酵母菌株(白色符號(hào)和虛線)的細(xì)胞外和總的α-半乳糖苷酶活性比較測(cè)定。圖3顯示 含有編碼釀酒酵母α-半乳糖苷酶的完整基因的分泌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的釀酒酵母菌株在含有2%的綿子糖的合成培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)的600納米吸收度測(cè)量值和總的α -半乳糖苷酶活性曲線。上述600納米吸收度值用來與相同菌株(除了沒有用MELl基因轉(zhuǎn)化) 的吸收度值進(jìn)行比較。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)研發(fā)了一種DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包括通過葡萄糖阻遏作用調(diào)節(jié)的異源啟動(dòng)子，與編碼成熟形式的釀酒酵母α-半乳糖苷酶基因融合在相同閱讀框內(nèi)的編碼酵母中功能信號(hào)序列的序列。已經(jīng)顯示出，含有所述的構(gòu)建體的酵母菌株以其活性形式分泌α-半乳糖苷酶到培養(yǎng)基中，使得該菌株具有使用于食品工業(yè)和生物技術(shù)公司的多種應(yīng)用。由于這些特征，該菌株提供了一種現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題的解決方案。因此，在第一方面，本發(fā)明涉及一種DNA構(gòu)建體，包含(a)通過葡萄糖阻遏作用調(diào)節(jié)的異源啟動(dòng)子，(b)編碼酵母中功能信號(hào)序列的序列，和(c)編碼成熟形式的α -半乳糖苷酶的MELl基因的片段或其功能等同變異體，其中序列(b)和(c)必須在相同閱讀框內(nèi)。在下文中將之稱為發(fā)明的一級(jí)構(gòu)建體。本發(fā)明的一級(jí)構(gòu)建體的組成部分(a)是通過葡萄糖阻遏作用調(diào)節(jié)的異源啟動(dòng)子。 術(shù)語“葡萄糖阻遏作用調(diào)節(jié)的異源啟動(dòng)子”指的是該目標(biāo)基因是被啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的基因不同于該目標(biāo)基因本身，并且另一方面，它是指表達(dá)受葡萄糖阻遏作用的影響的啟動(dòng)子，以致于當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度開始增加時(shí)，α "半乳糖苷酶的表達(dá)將被抑制。用于實(shí)施本發(fā)明的啟動(dòng)子包括例如釀酒酵母甘油醛3-磷酸酯(GAP)脫氫酶啟動(dòng)子，半乳糖激酶(GAL1和GAL7)啟動(dòng)子和3-磷酸甘油酸酯激酶(PGK)基因啟動(dòng)子。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子是ADH2基因啟動(dòng)子，它的序列號(hào)是序列號(hào)(SEQ ID No.) :1。本發(fā)明的一級(jí)構(gòu)建體的組成部分(b)是編碼酵母中功能信號(hào)序列的序列。“酵母中功能信號(hào)序列”指的是能夠促進(jìn)任何蛋白分泌進(jìn)入細(xì)胞外培養(yǎng)基中的肽， 在具體的實(shí)施方式中，該蛋白為α-半乳糖苷酶。在本發(fā)明環(huán)境中能夠使用的信號(hào)序列的非限制示意性例子包括，釀酒酵母和來自克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)和漢遜酵母屬(Hansenula) 的其他種的α-因子信號(hào)序列，乳酸克魯維酵母(K. Iactis)嗜殺毒素的信號(hào)序列，淀粉酶酵母菌(S. diastaticus)的葡萄糖淀粉酶II的信號(hào)序列，白假絲酵母(C. albicans) 的葡萄糖淀粉酶的信號(hào)序列，釀酒酵母(S. cerevisiae)的磷酸酶的信號(hào)序列，釀酒酵母 (S. cerevisiae)的128kDa的嗜殺毒素的信號(hào)序列，釀酒酵母(S. cerevisiae)的轉(zhuǎn)化酶的信號(hào)序列，也可以是任何已知的能夠在功能上替換大腸桿菌(E.coli)的信號(hào)序列的序列，如凱撒.C等描述的一樣.(科學(xué)，1987年第235期第312-317卷)(Science，1987，235 312-317)，和使用本領(lǐng)域已知的方法能夠鑒定的信號(hào)序列(例如Gallicioti，G.等.膜生物化學(xué)雜志，第 183 卷，第 175-182 頁)(Gallicioti, G. et al. J. Membrane Biology, 183 175-182)。信號(hào)序列與α -半乳糖苷酶能夠直接連接，或者它們可以選擇通過在信號(hào)序列加工后連接到α-半乳糖苷酶上的間隔肽分開，這有助于α-半乳糖苷酶的鑒定或其從培養(yǎng)基中的提純。在第一種情況下，事實(shí)上，任何可以識(shí)別肽或融合蛋白的肽或肽序列能夠使用，例如通過單克隆抗體識(shí)別的肽序列，其能夠通過免疫親和色譜識(shí)別得到的融合蛋白；例如標(biāo)記肽諸如c-myc，HA, Ε, FLAG和通常的任何其他被抗體識(shí)別的序列。在第二種情況下， 事實(shí)上任何允許分離或提純肽或者融合蛋白的肽或肽序列都能夠使用，例如多組氨酸序列，被單克隆抗體識(shí)別的肽序列，有助于通過免疫親和色譜純化得到的融合蛋白，例如標(biāo)記肽諸如c-myc，HA，E，F(xiàn)LAG等(抗體使用實(shí)驗(yàn)室手冊(cè).E.哈洛和大衛(wèi)萊恩(1999).冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約.章名蛋白標(biāo)記.第347-377頁(Using Antibodies =A laboratory manual. Ed Harlow and David Lane(1999). Cold Spring Harbor Laboratory Press. New Cork. Chapter =Tagging proteins, pp. 347-377))和通常的任何其他可以被抗體識(shí)別的序列。該標(biāo)記肽優(yōu)選FLAG表位(序列號(hào)2)，它與信號(hào)序列的C-末端相連，與α-半乳糖苷酶的N-末端相連，這樣就使在移除信號(hào)序列后，F(xiàn)LAG表位形成帶有α _半乳糖苷酶的N-末端。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，DNA構(gòu)建體可以包含編碼釀酒酵母(S. cerevisiae) α-因子序列的序列(序列號(hào)3)或者釀酒酵母(S. cerevisiae) MELl基因的內(nèi)源性信號(hào)序列，通過與編碼α-半乳糖苷酶的序列在其3’端融合且在相同閱讀框內(nèi)。本發(fā)明的一級(jí)DNA構(gòu)建體的第三個(gè)組成部分(C)是編碼成熟形式的α -半乳糖苷酶蛋白的MELl基因片段(序列號(hào)4)或其功能等同變異體。鑒定為序列號(hào)4的的序列的功能等同變異體理解為，由插入，缺失或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸產(chǎn)生的任何其他序列，其保持α“半乳糖苷酶活性。測(cè)定α-半乳糖苷酶活性的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的。所述方法是基于測(cè)定酶水解具有通過α“糖苷鍵共軛結(jié)合到發(fā)色團(tuán)/熒光團(tuán)/化學(xué)發(fā)光團(tuán)化合物上半乳糖的發(fā)色、熒光或者化學(xué)發(fā)光共軛體的能力，其中，所述化合物的釋放可以通過檢測(cè)被釋放的熒光、確定波長(zhǎng)的光密度或者化學(xué)發(fā)光來檢測(cè)。發(fā)色化合物可以用做α-半乳糖苷酶的底物， 用來按照邱和道格拉斯描述的方法(邱，0. Μ.和道格拉斯，H. C.，1976年)(Kew, 0. Μ. and Douglas, H. C.，1976)測(cè)定其活性包括對(duì)硝基苯基-α -D-吡喃半乳糖苷(PNPG)，其被水解后，產(chǎn)生強(qiáng)黃色的化合物，該化合物的形成是源于酶解反應(yīng)一旦結(jié)束產(chǎn)生的PH的變化，其與底物的釋放量是成比例的。其他已知的α-半乳糖苷酶活性測(cè)定如下述那些文獻(xiàn)中描述1969年戴伊和普里德姆(戴伊，P.M.，普里德姆，J. B.，1969年，生物化學(xué)雜志第113卷，第49-55頁)(Dey， P.M.，Pridham, J. B.，1969. Biochem. J. 113，49-55) ； 1977 年拉澤等(拉澤，P. S.，奧喬亞， A. G.，Gascon, S.，1977年·歐洲生物化學(xué)雜志第77卷第2期第375-382頁)(Lazo, P. S.， Ochoa, A. G. , Gascon, S. , 1977. Eur. J. Biochem. 77 (2) :375_382) ； 1998 年賴安等(賴安， Μ. P.，瓊斯，R.，摩爾斯，R. H.，1998年，分子和細(xì)胞生物學(xué)第18卷第4期第1774-82頁) (Ryan, Μ. P. , Jones, R. , Morse, R. H. , 1998. Mol Cell Biol 18(4) 1774-82) ；2004 加洛斯等(加洛斯MS，拉莫斯GF，吉奧里亞GS.，2004年.食品微生物學(xué)雜志，第21卷第511-8頁)(Garroa MS, Valdeza GF, Gioria GS. ,2004. Food Microbiol 21 :511_8.) ；2007 年劉等(劉，C.，阮，阿屋斯，沈，阿屋斯，陳，Q.，周，B.，Li，Y.，何，G.，2007年，食品科學(xué)雜志第 72 卷第 4 期M120-M125) (Liu, C.，Ruan，HOURS.，Shen，HOURS.，Chen, Q.，Zhou, B. ,Li, Y., He, G. ,2007. J Food Sci 72(4) :M120_M125)的文獻(xiàn)。 進(jìn)行α-半乳糖苷酶測(cè)定的合適條件在現(xiàn)有技術(shù)中是廣為知道的，例如，馬尼阿蒂斯等的(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1982)) (Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1982))文獻(xiàn)。在第二方面，本發(fā)明涉及一種DNA構(gòu)建體，包含(a)ADH2啟動(dòng)子或者其功能等同變異體，(b)編碼酵母中功能信號(hào)序列的序列，和(c)編碼成熟形式的α-半乳糖苷酶的基因片段或其功能等同變異體，其中序列 (b)和(c)必須在相同的閱讀框內(nèi)。ADH2啟動(dòng)子是乙醇脫氫酶II基因的啟動(dòng)子并易受代謝產(chǎn)物抑制的影響。術(shù)語“酵母中功能信號(hào)序列”在第一方面中已經(jīng)定義，以同樣的方式應(yīng)用在這種情況下。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，該信號(hào)序列是MELl基因的內(nèi)源性信號(hào)序列或者是酵母 α-因子的信號(hào)序列。成熟形式的α-半乳糖苷酶可能相當(dāng)于任何在動(dòng)物，植物和微生物中存在的 α-半乳糖苷酶。術(shù)語“功能等同變異體”應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)與在第一方面中的一樣。優(yōu)選的實(shí)施方式可以是其中編碼α "半乳糖苷酶蛋白的基因?yàn)镸ELl基因的實(shí)施方式。另外，在另一方面本發(fā)明涉及一種之前定義的構(gòu)建體編碼的蛋白和含有所述構(gòu)建體的表達(dá)載體。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體之一產(chǎn)生的蛋白，包含酵母中的功能信號(hào)序列和α -半乳糖苷酶，融合在一起，從而該信號(hào)序列的C-末端與α -半乳糖苷酶的N-末端融合在一起。術(shù)語“表達(dá)載體”指的是復(fù)制型DNA構(gòu)建體，用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽或者本發(fā)明的融合蛋白的DNA，它包含轉(zhuǎn)錄單元，該轉(zhuǎn)錄單元包括下述序列的組裝(1)遺傳因子，在基因表達(dá)中起到控制的作用，例如啟動(dòng)子、操縱子或增強(qiáng)子；與該遺傳因子有效地連接的(2) 編碼本發(fā)明多肽或融合蛋白的DNA序列，被轉(zhuǎn)錄到信使RNA中，并翻譯成為蛋白；和(3)適當(dāng)序列，用于開始和終止轉(zhuǎn)錄和翻譯。在本發(fā)明環(huán)境下使用的載體一般包括遺傳標(biāo)記，細(xì)菌和酵母中的復(fù)制起點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)和遺傳標(biāo)記。遺傳標(biāo)記通常是給予了對(duì)抗生素耐受的基因，或者是對(duì)酵母來說的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記物。適合本發(fā)明的酵母載體可以是以下列類型的質(zhì)粒為基礎(chǔ)-多拷貝自主質(zhì)粒這些質(zhì)粒包含可以形成所述載體的多拷貝的序列。這些序列可以是所謂的2μ，諸如是出現(xiàn)在附加體質(zhì)粒(Yep或酵母附加體質(zhì)粒)中的序列，或者ARS 型序列如出現(xiàn)在復(fù)制型質(zhì)粒內(nèi)(YRps或酵母復(fù)制質(zhì)粒)的序列。以這種類型質(zhì)粒為基礎(chǔ)的載體舉例有 p426GPD，p416GPD, p426TEF, p423GPD, p425GPD, p424GPD 或 p426GAL，YEp24 禾口 Yeplac0-單拷貝自主質(zhì)粒該質(zhì)粒包含自主復(fù)制序列ARSl和著絲粒序列(CEN4)。這個(gè)類型的質(zhì)粒包括著絲粒質(zhì)粒(YCps或酵母著絲粒質(zhì)粒)。-整合質(zhì)粒能夠被整合到宿主細(xì)胞基因組的質(zhì)粒。該類型的質(zhì)粒包括整合質(zhì)粒 (YIPs或酵母整合質(zhì)粒)。以這種類型質(zhì)粒為基礎(chǔ)的載體舉例有pRS303，pRS304，pRS305或者PRS306以及類似物。通常來說，西科爾斯基(“釀酒酵母的染色體外克隆載體”，質(zhì)粒，實(shí)用方法， 艾迪.K.G.哈代，IRL 出版社，1993 年)(“Extrachromosomal cloning vectors of Saccharomyces cerevisiae，，，in Plasmid, A Practical Approach, Ed. K. G. Hardy, IRL Press, 1993)和奧蘇伯爾等(“酵母克隆載體和基因”現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，第2部分，13. 4 單兀，1994 年)("Yeast Cloning Vectors and Genes，，Current Protocols in Molecular Biology, Section II，Unit 13. 4，1994)提到的所有的載體在本發(fā)明的環(huán)境中是有用的。

在另一方面，本發(fā)明涉及一種包含本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的微生物，包含本發(fā)明的構(gòu)建體的表達(dá)載體或者與本發(fā)明的融合蛋白。在一個(gè)特別的實(shí)施方式中，微生物是酵母。 酵母可以被理解為任何屬于子囊菌型的真核有機(jī)體，其包含通常知道的酵母有機(jī)體以及通常知道的絲狀真菌。酵母和絲狀真菌包括畢赤酵母種(Pichia sp)(例如，巴斯得畢赤酵母(P. pastoris)，芬蘭畢赤酵母(P. finlandica)，喜海藻糖畢赤酵母(P. trehalophila)， P. koclamae,莫璞畢赤酵母(P. membranaefaciens)，微小畢赤酵母(P. minuta)，仙人掌酵母(P. opuntiae)，嗜熱畢赤酵母(P. thermotolerans)，柳畢赤酵母(P. salictaria), 松櫟酵母(P. guercuum)，皮杰普畢赤酵母(P. pijperi)，樹干畢赤酵母(P. stiptis)，嗜甲畢赤酵母(P.methanolica))，酵母屬(釀酒酵母(S. cerevisiae))，粟酒裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces pombe)，克魯維酵母屬(Kluyveromyces)(例如，乳酸克魯維酵母 (K. Iactis)，脆壁克魯維酵母(K. fragilis)，加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus)，魏氏克魯維酵母(K. wickeramii)，克魯雄酵母(K. waltii)，果蠅克魯維酵母(K. drosophilarum)， 嗜熱克魯維酵母(K. thernotolerans)，和馬克斯克魯維酵母(K. marxianus)，耶魯維亞克魯維酵母(K. yarrowia))，里氏木霉屬(Trichoderma reesia)，粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)，許旺酵母屬(Schwanniomyces)，西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)， 青霉屬(Penicillium)，彎頸霉屬(Totypocladium)，曲霉菌屬(Aspergillus)(例如，構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)，黑曲霉(A. niger)，米根霉(A. oryzae))，多形漢森(氏)酵母屬 (Hansenula polymorpha)，假絲酵母(Candida)，克勒克酵母屬(Kloeckera)，球擬酵母屬(Torulopsis)，和紅酵母(Rhodotorula)，漢森(氏)酵母屬(Hansenula)，克魯維酵母菌(Kluyveromyces sp.)(例如，乳酸克魯維酵母菌屬Kluyveromyces lactis)，白假絲酵母(Candida albicans),曲霄菌(Aspergillus sp.)(例如，構(gòu)巢曲霄菌 Aspergillus nidulans)，黑曲霉 Aspergillum niger)，米根霉(Aspergillus oryzae))，里氏木霉屬 (Trichoderma reesei)，金抱子菌屬(Chrysosporium luchiowense)，鍵抱菌(Fusarium sp.)(例如，鐮孢菌禾谷鏈孢菌(Fusarium gramineum)),鐮孢霉(Fusarium venenatum)), 小立碗蘚屬(Physcomitrella patens)。事實(shí)上任何酵母都可以用來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法；然而，在一個(gè)具體的實(shí)施方式中， 所述的酵母是來自酵母屬的酵母，例如，釀酒酵母(S. cerevisiae)。為了得到本發(fā)明的酵母，將含有構(gòu)建體的載體引入到酵母細(xì)胞中是必要的。適合引入DNA分子到酵母細(xì)胞的方法包括 -原生質(zhì)球狀體的轉(zhuǎn)化，需要去除酵母細(xì)胞壁并在PEG存在下將原生質(zhì)球狀體與質(zhì)粒連接。-用Li+轉(zhuǎn)化，需要用一價(jià)堿陽離子(Na+、K+、Rb+、Cs+和Li+)聯(lián)合PEG—同處理酵母細(xì)胞通過完整的細(xì)胞刺激DNA吸收。-電穿孔法，需要給予酵母電脈沖，使在原生質(zhì)球狀體和完整的酵母細(xì)胞的膜上形成開孔。本發(fā)明的微生物能夠產(chǎn)生和分泌α -半乳糖苷酶到培養(yǎng)物中。因此，在另一方面， 本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)α “半乳糖苷酶的方法，該方法包括根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)微生物和從培養(yǎng)基中回收分泌的α-半乳糖苷酶。α-半乳糖苷酶蛋白能夠很容易地通過單一的親和色譜方法進(jìn)行純化，通過使用下述底物類似物分離，即例如對(duì)氨基苯基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(斯蒂爾斯.E 等，1970 年，生物化學(xué)雜志第 246 期第 196 頁-200 頁)(Steers, Ε. et al，1970，J. Biol. Chem. 246 196-200)。α -半乳糖苷酶的純度的測(cè)定，能夠通過具體酶的活性值評(píng)價(jià)，該值通過酶活性單位數(shù)除以蛋白的量計(jì)算得到，以確定體積內(nèi)的毫克計(jì)。優(yōu)選地，酶活性通過瓜倫特L.的方法(酶學(xué)方法· 1983 年，101 卷第 181-191 頁)(Methods Enzymo 1. 1983，101 181-191)測(cè)定。本發(fā)明的微生物能夠在含有基質(zhì)的培養(yǎng)基中成長(zhǎng)，所述基質(zhì)含有豐富的α -D-半乳糖末端位置的非還原性殘基作為唯一碳源。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及一種從富含 α-D-半乳糖末端位置的非還原性殘基的組合物中獲得細(xì)胞生物質(zhì)的方法，該方法包含 (a)培養(yǎng)含有本發(fā)明構(gòu)建體之一的微生物和(b)從培養(yǎng)基中回收生物質(zhì)。優(yōu)選富含α -D-半乳糖末端位置的非還原性殘基的培養(yǎng)基為富含水蘇四糖、綿子糖、蜜二糖、甘蔗和/或甜菜糖蜜、大豆蛋白滲透物和任何上述物質(zhì)的組合的培養(yǎng)基。生物質(zhì)能夠從培養(yǎng)基中通過任何本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法回收，包括但不限于離心，沉淀或過濾。使用的方法必須優(yōu)選最大限度內(nèi)對(duì)細(xì)胞破壞最小的。如果同樣的培養(yǎng)物用于制備生物質(zhì)和產(chǎn)生α-半乳糖苷酶，那么細(xì)胞生物質(zhì)的分離必須在最大程度上使α-半乳糖苷酶的減少到最低。從培養(yǎng)基中回收的微生物通常是用含水溶液洗滌去除不想要的可能是隨此附帶的物質(zhì)。酵母中蛋白含量?jī)?yōu)選在35-65%之間。回收的酵母生物質(zhì)不需要額外加工就能夠用作食品產(chǎn)品的成分?；厥盏纳镔|(zhì)也能被溶解，并可選擇地，將完整細(xì)胞分離。溶解的酵母細(xì)胞可以作為酵母提取物用在培養(yǎng)基上或者可以通過額外加工分離其中的不同成分例如肽類、核苷酸、氨基酸或者細(xì)胞壁中的具體成分，例如幾丁質(zhì)，葡聚糖、甘露聚糖和低聚糖。容許使用的基質(zhì)(水蘇四糖，綿子糖，蜜二糖，甘蔗和/或甜菜糖蜜和/或大豆蛋白滲透物)被本發(fā)明酵母消化，產(chǎn)生半乳糖，其是適用于酒精發(fā)酵，乙醇或其他化合物的生產(chǎn)的合適基質(zhì)。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及一種獲得發(fā)酵產(chǎn)品的方法，包含步驟在富含 α -D-半乳糖末端位置的非還原性殘基的基質(zhì)上培養(yǎng)微生物的步驟，其中所述酵母包括編碼融合蛋白的DNA構(gòu)建體，該融合蛋白中成熟形式的α -半乳糖苷酶與信號(hào)序列融合在相同閱讀框內(nèi)，其中所述的信號(hào)序列能夠促進(jìn)酵母細(xì)胞α -半乳糖苷酶的分泌；和(b)從培養(yǎng)基中回收發(fā)酵產(chǎn)品的步驟。在本發(fā)明環(huán)境下的發(fā)酵產(chǎn)品被理解為在厭氧條件下從來自于糖的酵母中獲得的產(chǎn)品。使用本發(fā)明的菌株和方法獲得的發(fā)酵產(chǎn)品包括醇(乙醇、甲醇、丁醇)、有機(jī)酸(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸)、酮(例如，丙酮)、氨基酸(例如，谷氨酸)、氣體(氫氣和二氧化碳)、抗生素(青霉素、四環(huán)素)等。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，發(fā)酵產(chǎn)品是乙醇，該乙醇可以用 作燃料、用在飲料或者工業(yè)水平上。用于生產(chǎn)乙醇的醇發(fā)酵通常是在溫度大約在32°C進(jìn)行發(fā)酵30-60小時(shí)。就作為碳源的培養(yǎng)基而言，生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的培養(yǎng)條件實(shí)質(zhì)上與生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的條件相同。然而，為了改進(jìn)反應(yīng)的收率，重要的是，培養(yǎng)條件是那些能夠有利于單糖發(fā)酵的條件。一旦在基質(zhì)中發(fā)酵產(chǎn)品的合適濃度已經(jīng)達(dá)到，就需要從基質(zhì)中回收產(chǎn)品?；厥债a(chǎn)品的方法將依賴于產(chǎn)品的化學(xué)性質(zhì)。如果發(fā)酵產(chǎn)品是乙醇，就使用包括蒸餾的常規(guī)技術(shù)回收。本發(fā)明微生物也能被包含編碼目標(biāo)蛋白的基因的二級(jí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，并進(jìn)而用于通過在富含α -D-半乳糖末端位置的非還原性殘基作為唯一碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述的雙重轉(zhuǎn)化菌株獲得目標(biāo)蛋白。因此在另一方面，本發(fā)明涉及一種微生物，除包含本發(fā)明的一級(jí)構(gòu)建體外還包含帶有編碼目標(biāo)蛋白的基因的二級(jí)構(gòu)建體。能夠用于表達(dá)異源性蛋白的表達(dá)載體實(shí)際上與那些能夠用于表達(dá)帶有α-半乳糖苷酶的融合蛋白的表達(dá)載體是一樣的。然而，適當(dāng)?shù)氖?，?duì)于兩種載體具有不同選擇標(biāo)記物以保證它們兩者在酵母中保持穩(wěn)定。調(diào)控異源蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子也可以與那些用于調(diào)控融合蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子一樣。用于生產(chǎn)本發(fā)明構(gòu)建體的啟動(dòng)子包括-組成型啟動(dòng)子，例如，舉例來說，乙醇脫氫酶(ADHl)啟動(dòng)子、1_(1~延長(zhǎng)因子(TEF) 啟動(dòng)子和編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)的基因的啟動(dòng)子、磷酸3-甘油醛脫氫酶(GPD)啟動(dòng)子和3-磷酸甘油酸激酶(GPK)啟動(dòng)子，MRP7啟動(dòng)子和乙醇氧化酶(AOXl)啟動(dòng)子。-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如，舉例來說，金屬硫蛋白(CUPl)啟動(dòng)子，其通過加入銅到培養(yǎng)基中來調(diào)控表達(dá)；編碼FUSl基因或FUS2基因的基因啟動(dòng)子，如在美國(guó)專利US5063154中描述的，它的表達(dá)在信息素(α-因子)存在下被激活的；TET啟動(dòng)子，它的表達(dá)在四環(huán)素存在下被調(diào)控；GAL1-10，GALL，GALS啟動(dòng)子，它們?cè)诎肴樘谴嬖谙卤患せ?；VP16-ER啟動(dòng)子，其被雌激素誘導(dǎo)；和磷酸酶(PH05)啟動(dòng)子，它的表達(dá)是在磷酸酯存在下激活的；和HSP150熱休克蛋白啟動(dòng)子，它的表達(dá)在高溫下被激活。-阻遏型啟動(dòng)子，例如，舉例來說，釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)基因啟動(dòng)子，當(dāng)微生物在非可發(fā)酵碳源中生長(zhǎng)時(shí)，它的表達(dá)被抑制；還有，受葡萄糖阻遏影響表達(dá)的啟動(dòng)子， 當(dāng)部分乳糖被水解，并且培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度開始增加時(shí)，該表達(dá)將會(huì)被抑制；釀酒酵母中，3-磷酸甘油醛脫氫酶(ADH2/GAP)啟動(dòng)子和半乳糖激酶(GALl)啟動(dòng)子。優(yōu)選地不同的啟動(dòng)子被用在兩種構(gòu)建體中，以致于α-半乳糖苷酶和異源蛋白的表達(dá)能夠被獨(dú)立地調(diào)控。優(yōu)選地，在那些異源蛋白被認(rèn)為是對(duì)宿主細(xì)胞是有毒性的情況下， 用于調(diào)控其表達(dá)的啟動(dòng)子適當(dāng)?shù)厥钦{(diào)控性啟動(dòng)子，從而使得目標(biāo)蛋白的表達(dá)被延遲，直到已經(jīng)達(dá)到足夠的生物量水平。本發(fā)明想到使用水蘇四糖，綿子糖，蜜二糖，甘蔗和/或甜菜糖蜜，大豆蛋白滲透物和任何上述物質(zhì)的組合作為富含α-半乳糖苷酶末端位置的非還原性殘基的培養(yǎng)基。目標(biāo)蛋白可能缺乏信號(hào)序列，或者是為了達(dá)到刺激釋放其到培養(yǎng)基中并進(jìn)而促進(jìn)它的回收的目的，它們能夠被合成帶有信號(hào)序列。在本發(fā)明環(huán)境下能夠使用的信號(hào)序列本質(zhì)上包括與那些能夠用于促進(jìn)α“半乳糖苷酶分泌相同的信號(hào)序列。雙重轉(zhuǎn)化菌株能夠方便地以使用α -D-半乳糖末端位置的非還原性殘基作為主要碳源用于生產(chǎn)目標(biāo)蛋白。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及一種獲得目標(biāo)蛋白的方法，包括步驟(a)按照本發(fā)明在富含α-D-半乳糖末端位置的非還原性殘基的培養(yǎng)基中培養(yǎng)雙重轉(zhuǎn)化的酵母菌株和(b)從培養(yǎng)基中回收目標(biāo)蛋白。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，富含α -D-半乳糖末端位置的非還原性殘基的培養(yǎng)基是水蘇四糖，蜜二糖，綿子糖，甘蔗和/或甜菜糖蜜，大豆蛋白滲透物和任何上述物質(zhì)的組合。實(shí)際上關(guān)于使用本發(fā)明菌株和方法能夠表達(dá)的目標(biāo)蛋白是沒有限制的。這些既包括人類也包括哺乳動(dòng)物的有治療用途的蛋白，和能夠在酵母中重新構(gòu)建代謝途徑的以及隨后生產(chǎn)有用的化合物的不同來源的酶。以本發(fā)明對(duì)象細(xì)胞生產(chǎn)的有治療用途的蛋白的例子是，促紅細(xì)胞生成素、促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(CRH)，生長(zhǎng)激素釋放激素(SRH)，促性腺激素釋放激素(GnRH)，促甲狀腺激素釋放激素(TRH)，催乳素釋放激素(PRH)，促黑素釋放激素(MRH)，催乳素抑制激素 (PIH)，生長(zhǎng)激素抑制素，促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)，促生長(zhǎng)激素或生長(zhǎng)激素(GH)，促黃體生成激素(LH)，促卵胞激素(FSH)，促甲狀腺激素刺激激素(TSH或促甲狀腺激素)，催乳素， 催產(chǎn)素，抗利尿激素(ADH或后葉加壓素)，褪黑激素，穆勒氏管抑制因子，降鈣素，膽囊收縮素激素(CCK)，胰泌素，胰島素樣生長(zhǎng)因子-I (IGF-I)，胰島素樣生長(zhǎng)因子-II (IGF-II)，心鈉素(ANP)，人體絨毛膜促性腺激素(hCG)，胰島素，胰高血糖素，生長(zhǎng)激素抑制素，胰多肽 (PP)，瘦素，Y神經(jīng)肽，腎素，血管緊張素I，血管緊張素II，第VDI因子，第IX因子，組織因子， 第VII因子，第X因子，凝血酶，第V因子，第XI因子，第XIII因子，白細(xì)胞介素-I(IL-I)Jt 瘤壞死因子-α (TNF- α )，白細(xì)胞介素_6 (IL_6)，白細(xì)胞介素_8 (IL_8和化學(xué)增活素)，白細(xì)胞介素-12(IL-12)，白細(xì)胞介素-16(IL-16)，α、β、Y-干擾素，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)，骨形成蛋白(BMPs)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF和KGF)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF和類似物)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子，角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子，內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，α-l抗胰蛋白酶，腫瘤壞死因子，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，環(huán)孢霉素，纖維蛋白原， 乳鐵蛋白，組織型纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)，胰凝乳蛋白酶，免疫球蛋白，水蛭素，超氧化物歧化酶和伊米苷酶。事實(shí)上，現(xiàn)有技術(shù)中的任何已知方法均能夠用于從細(xì)胞內(nèi)或從培養(yǎng)基中回收目標(biāo)蛋白。如果蛋白是在酵母細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)，那么需要溶解細(xì)胞以釋放目標(biāo)蛋白。酵母細(xì)胞被按照下述方式常規(guī)溶解通過對(duì)之前形成原生質(zhì)球狀體用葡聚糖酶處理進(jìn)行低滲溶解，借助聲裂法或通過在玻璃珠存在下進(jìn)行搖動(dòng)。一旦目標(biāo)蛋白從細(xì)胞內(nèi)部釋放到培養(yǎng)基中或者源于通過酵母本身的分泌結(jié)構(gòu)分泌的蛋白到培養(yǎng)基中，則用于純化所述蛋白的常規(guī)的方法，包括但不限于，色譜法(例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜、凝膠過濾色譜、 HPLC)，電泳法(準(zhǔn)備的等電位焦距電泳、在聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸鈉膠中的制備電泳)，差別性溶解度(用硫酸銨沉淀)，準(zhǔn)備的蔗糖梯度超速離心。一旦達(dá)到期望的純度，這可能需要進(jìn)行不止單一的色譜步驟，一般還需要濃縮蛋白或除去對(duì)隨后使用有害的鹽和離子。那樣的話，已知的技術(shù)例如低壓凍干法或超濾法可以使用。本發(fā)明通過本發(fā)明的非限制性示意性實(shí)施例描述如下。實(shí)施例實(shí)施例 1擺丨__職棚〒爐α-輔-棚材料和方法1. _石馬α-輔·隱細(xì)械浦赫歹丨丨設(shè)計(jì)兩對(duì)引物用于通過PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增編碼釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) α -半乳糖苷酶的MELl基因。兩個(gè)片段擴(kuò)增，其中一個(gè)對(duì)應(yīng)α-半乳糖苷酶的完整基因(序列號(hào)4)，使用下列具有序列號(hào)5和序列號(hào)6的引物進(jìn)行擴(kuò)增；另一個(gè)片段對(duì)應(yīng)除去編碼分泌信號(hào)(序列號(hào)7)的54個(gè)核苷酸的α-半乳糖苷酶基因，通過下列具有序列號(hào)8和序列號(hào)9的引物進(jìn)行擴(kuò)增。將α-半乳糖苷酶的完整基因插入到載體YEpFLAGl (伊士曼柯達(dá)公司分類號(hào)IB13400)中，用于在 ADH2 (Alcohol Dehydrogenase，醇脫氫酶2)啟動(dòng)子(序列號(hào)1)和CYCl基因的轉(zhuǎn)錄終止子 (序列號(hào)10)下在酵母中表達(dá)。將具有不含分泌信號(hào)序列的α-半乳糖苷酶基因的擴(kuò)增的第二種產(chǎn)品像前面描述的一樣插入到載體中，其進(jìn)一步具有了分泌信號(hào)酵母α因子(83個(gè)氨基酸)和FLAG多肽用于它的后續(xù)免疫學(xué)檢測(cè)(SEQ ID NO :2)。產(chǎn)生的構(gòu)建體通過乙酸鋰的方法(伊藤等，細(xì)菌學(xué)雜志，1983年1月第153卷第1期第163-8頁)(Ito et al., J Bacteriol. 1983 Jan ；153(1) 163-8)轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株(ρ印4::HIS3 prb-Δ 1. 6R HIS3 lys2-208 trpl-Δ 101 ura3-52 gal2 canl)中。2.培養(yǎng)重組菌株用兩種構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的菌株在完全培養(yǎng)基(CM medium)(資陶茂等，生物化學(xué)雜志.1976年 10月 25 日，第251卷第20期，第6320-6頁)(Zitomer et al. ,J Biol Chem. 1976 Oct 25；251 (20) 6320-6)中培養(yǎng)，使用色氨酸作為營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記物。當(dāng)它們到達(dá)穩(wěn)定的生長(zhǎng)時(shí)期后，將它們接種到IOOml的YPHSM培養(yǎng)基中(1 %葡萄糖，3%甘油，1 %酵母提取物和8%蛋白胨)或者接種到相同的培養(yǎng)基中，但所述培養(yǎng)基含有2%的棉子糖以代替的葡萄糖。所有測(cè)定的培養(yǎng)物都是在30°C下，在250轉(zhuǎn)/分鐘軌道振蕩器上生長(zhǎng)并且在 600nm初始吸收值是0. 05時(shí)開始。在不同的時(shí)間間隔測(cè)定600nm的吸收值，細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的α -半乳糖苷酶活性，并根據(jù)情況測(cè)定，棉子糖，蜜二糖，果糖，葡萄糖和半乳糖的消耗量。在一些情況下，培養(yǎng)物是在賽多利斯-MD (貝朗生物系統(tǒng))型(Braim-Biotech)發(fā)酵罐2升培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，控制通風(fēng)量(2升/分鐘)，溫度30°C，pH，震蕩頻率(250轉(zhuǎn)/分鐘)。在不同的時(shí)間間隔收集樣品，并將在前提到的參數(shù)進(jìn)行同樣的分析。3. α-半乳糖苷酶活性的測(cè)定α -半乳糖苷酶體外活性是使用發(fā)色底物對(duì)硝基苯基_ α _D_半乳糖吡喃糖苷 (PNPG) (Sigma-Aldrich，西格瑪-奧爾德利奇公司)按照邱和道格拉斯描述的方法(邱，0. Μ.等，細(xì)菌學(xué)雜志1976年1月，第125卷第(1)期，第33-41頁)(Kew，0. Μ. et al.，J Bacteriol. 1976 Jan ； 125(1) :33_41)測(cè)定。無色的PNPG化合物在水解后產(chǎn)生一種產(chǎn)物， 其由于酶反應(yīng)的終止產(chǎn)生的PH變化顯示可以通過分光光度計(jì)定量的淺黃色，其與底物釋放的量成比例。α -半乳糖苷酶活性是通過酶單位表達(dá)的；酶單位(Ε. U.)的定義為在測(cè)定條件下，每分鐘釋放1納摩爾對(duì)硝基苯基的酶的量(E.U.=納摩爾χ Hiin-1X ml—1)。在培養(yǎng)基中該單位的表達(dá)為E. U. /ml。4.泖丨斜帛稍、罾二■、果 棚禾_丨濂肺&沃特世HPLC (高效液相色譜)配有Breeze系列1515型單元泵，具有2414型折射率檢測(cè)器和Sugar Pak I的6. 5毫米χ 300毫米的分離柱，該HPLC被用于測(cè)定棉子糖、蜜二糖，果糖、葡萄糖和半乳 糖。MM圖1表示，含有編碼釀酒酵母(S. cerevisiae) α -半乳糖苷酶的全部MELl基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的釀酒酵母菌株，在含有葡萄糖的合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)在600納米的吸收度以及細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的α-半乳糖苷酶活性。顯示在圖1中的酶活性數(shù)據(jù)是四個(gè)獨(dú)立測(cè)定的結(jié)果?？偦钚允羌?xì)胞內(nèi)活性與細(xì)胞外活性的和。這個(gè)重組菌株在90-140小時(shí)內(nèi)平均分泌18700E.U./ml的α _半乳糖苷酶到培養(yǎng)基中，對(duì)于相同時(shí)間間隔的平均總活性為 32000Ε. U. /ml，這就意味著細(xì)胞外活性是總活性的58. 4%。為了驗(yàn)證帶有完整MELl基因的重組菌株在含有棉子糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，圖3顯示了菌株在帶有2%棉子糖的合成培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)的600納米的吸收以及總的α -半乳糖苷酶活性。通過對(duì)照，示出在2%棉子糖中相同的非轉(zhuǎn)化菌株生長(zhǎng)時(shí)600納米吸收度值測(cè)定值。可以觀察到，非轉(zhuǎn)化菌株在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)達(dá)到的吸收值大約是12，實(shí)際上它們?cè)谵D(zhuǎn)化菌株中已經(jīng)成倍，達(dá)到了約22。非轉(zhuǎn)化菌株只能利用棉子糖中的果糖，但是不能代謝蜜二糖。 然而轉(zhuǎn)化的菌株，除了使用棉子糖中的果糖，還能使用蜜二糖。通過HPLC測(cè)定棉子糖，蜜二糖、果糖、葡萄糖和半乳糖確認(rèn)了，在非轉(zhuǎn)化菌株的培養(yǎng)中蜜二糖的存在，而在轉(zhuǎn)化菌株中蜜二糖實(shí)際上在培養(yǎng)48小時(shí)后消失。實(shí)施例2帶有MELl在ADH2啟動(dòng)子下的菌株「Al與帶有MELl在ADHl啟動(dòng)子下的菌株「Bi 的α-半乳糖苷酶活件對(duì)比克隆的細(xì)節(jié)和α -半乳糖苷酶活性的測(cè)定在實(shí)施例1中已經(jīng)描述。重組菌株[Α] 的培養(yǎng)是在含有葡萄糖的合成培養(yǎng)基上進(jìn)行。圖2表示美國(guó)專利US 5055401描述的菌株[B]與本發(fā)明的重組菌株[Α]獲得的數(shù)據(jù)比較。為了達(dá)到目的，數(shù)據(jù)是從US 5055401中的圖7Α和7Β中提取的，并且他們已經(jīng)對(duì)比過。可以觀察到，在US 5055401中描述的菌株的α-半乳糖苷酶總的活性在36-54小時(shí)達(dá)到8000Ε. U. /ml，而本發(fā)明菌株[A]在相同的時(shí)間間隔達(dá)到的總的活性是10000E. U. /ml到 20000E. U. /ml，正如前述討論的，在培養(yǎng)的后續(xù)階段達(dá)到了約32000E. U. /ml。所述增加是， 在本發(fā)明重組菌株[A]總的α _半乳糖苷酶活性相對(duì)于US5055401描述的菌株[B]增量為從25%到300%。同樣地，關(guān)于在US5055401中描述的菌株[B]的細(xì)胞外α -半乳糖苷酶活性，當(dāng)與本發(fā)明菌株[Α]相比，可以觀察到，前者在36-54小時(shí)時(shí)獲得的活性約是2600Ε.U. /ml，是總活性的32. 5%，而在本發(fā)明 菌株[A]中得到的數(shù)值是3400到7800E. U. /ml (大約為總活性的37. 25% )，在后續(xù)階段的培養(yǎng)中增加到18700E. U. /ml (總活性的58. 4% )。
權(quán)利要求
1.一種DNA構(gòu)建體包括(a)通過葡萄糖阻遏作用調(diào)節(jié)的異源啟動(dòng)子，(b)編碼酵母中功能性信號(hào)序列的序列，和(c)編碼成熟形式的α-半乳糖苷酶的MELl基因的片段或其功能等同變異體，其中序列(b)和(c)必須在相同閱讀框內(nèi)。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中通過葡萄糖阻遏作用調(diào)節(jié)的異源啟動(dòng)子是ADH2啟動(dòng)子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建體，其中信號(hào)序列是MELl基因的內(nèi)源性信號(hào)序列。
4.如權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建體，其中信號(hào)序列是酵母α因子的信號(hào)序列。
5.一種DNA構(gòu)建體，含有(a)ADH2啟動(dòng)子或者或其功能等同變異體，(b)編碼酵母中功能信號(hào)序列的序列，和(c)編碼成熟形式的α-半乳糖苷酶的基因的片段或其功能等同變異體，其中序列(b) 和(c)必須在相同閱讀框內(nèi)。
6.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建體，其中編碼α-半乳糖苷酶蛋白的基因是MELl基因。
7.如權(quán)利要求5或6所述的構(gòu)建體，其中信號(hào)序列是MELl基因的內(nèi)源性信號(hào)序列。
8.如權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述構(gòu)建體，其中信號(hào)序列是酵母α因子的信號(hào)序列。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述構(gòu)建體編碼的蛋白。
10.一種表達(dá)載體，含有如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述構(gòu)建體。
11.一種微生物，含有權(quán)利要求10所述載體，權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體或權(quán)利要求9所述的蛋白。
12.如權(quán)利要求11所述的微生物，其中微生物是酵母。
13.如權(quán)利要求12所述的微生物，其中所述的微生物是釀酒酵母。
14.一種生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的方法，包括(a)在含有α-D-半乳糖末端位置的非還原性殘基的基質(zhì)上，培養(yǎng)權(quán)利要求11，12或 13中任一所述的微生物和(b)從培養(yǎng)基中回收分泌的α-半乳糖苷酶。
15.一種獲得細(xì)胞生物質(zhì)的方法，包括(a)在含有α-D-半乳糖的末端的非還原性殘基的基質(zhì)上，培養(yǎng)權(quán)利要求11，12或13 中任一項(xiàng)所述的微生物和(b)回收細(xì)胞生物質(zhì)。
16.一種獲得乙醇的方法，包括(a)在含有α-D-半乳糖的末端的非還原性殘基的基質(zhì)上，培養(yǎng)權(quán)利要求11，12或13 中任一項(xiàng)所述的微生物和(b)回收所制造的乙醇。
17.如權(quán)利要求11，12或13中任一項(xiàng)所述的微生物，包括編碼目標(biāo)蛋白基因的二級(jí)構(gòu)建體。
18.一種獲得蛋白的方法，包括(a)在含有α-D-半乳糖的末端的非還原性殘基的基質(zhì)上，培養(yǎng)權(quán)利要求17所述的微生物和(b)回收目標(biāo)蛋白。
19.如權(quán)利要求14-18任一項(xiàng)所述的方法，其中含有α-D-半乳糖末端位置的非還原性殘基的基質(zhì)選自棉子糖、蜜二糖、水蘇四糖、甘蔗和/或甜菜糖蜜、大豆蛋白滲透物和任何上述物質(zhì)的組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠分泌α-半乳糖苷酶到培養(yǎng)基中的釀酒酵母(S.cerevisiae)菌株，還涉及使用所述菌株獲得α-半乳糖苷酶的方法和通過在富含半乳糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)所述的菌株生產(chǎn)生物質(zhì)和生物乙醇的方法。另一方面，本發(fā)明提供表達(dá)重組蛋白的方法，該方法使用富含半乳糖的組合物作為培養(yǎng)基用于生產(chǎn)所述蛋白的微生物。
文檔編號(hào)C12N9/40GK102449145SQ201080023300
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月8日
發(fā)明者羅德里格茲 A·佩雷拉, 維拉紐瓦 M·E·塞爾當(dāng), 斯索 M·I·岡薩雷斯, 費(fèi)爾南德斯 M·貝塞拉, 萊羅 R·費(fèi)爾南德斯 申請(qǐng)人:拉科魯尼亞大學(xué)