專利名稱：棉子糖合酶基因及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及棉子糖合酶基因及其應用。
棉子糖家族寡糖為由下面的通式所表示糖的衍生物O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)n-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃果糖苷，并且當n為1時稱其為“棉子糖”，當n為2時稱其為“水蘇糖”，當n為3時稱其為“毛蕊糖”，且當n為4時稱其為“筋骨草糖”。
已知棉子糖家族寡糖如果以適宜的量存在于食物中時具有提供良好腸道菌群條件的效應。因此，棉子糖家族寡糖已經(jīng)用作有功能的食品材料用于添加至有些食物中并且用于特定的健康食品領(lǐng)域中。另一方面，棉子糖家族寡糖在哺乳動物如人，中既不被消化也又不被吸收，但由腸道菌同化和分解以產(chǎn)生氣體并且導致腹中積氣和吸收紊亂。因此，已經(jīng)存在適當調(diào)節(jié)食品和飼料中棉子糖家族寡糖的量的必要。
棉子糖家族寡糖由棉子糖家族寡糖生物合成系統(tǒng)由許多植物中的蔗糖開始而合成的。該生物合成系統(tǒng)一般包括經(jīng)α(1→6)鍵依次加入來自肌醇半乳糖苷的半乳糖基至附著于蔗糖分子中D-葡萄糖殘基6-位置碳原子上的羥基的反應。棉子糖合酶是涉及通過以下方法制備棉子糖反應的酶，即在該生物合成系統(tǒng)的第一步中使來自肌醇半乳糖苷的D-半乳糖基與附著到蔗糖分子中D-葡萄糖殘基6-位置碳原子上的羥基形成α(1→6)鍵。已表明該酶構(gòu)成了上面合成系統(tǒng)中的限速步驟，并且因此該酶在控制棉子糖家族寡糖生物合成中是相當重要的。
那么，通過利用棉子糖合酶基因控制植物中棉子糖合酶表達水平或活性的方法對于控制植物中棉子糖家族寡糖生物合成系統(tǒng)以增加或減少植物中棉子糖的產(chǎn)量是有效的。因此，可以此方法應用的棉子糖合酶基因已成必要。
本發(fā)明的主要目的是提供新的植物棉子糖合酶基因。
通過下面的描述，本發(fā)明的該目的以及其它目的和優(yōu)勢對本領(lǐng)域的技術(shù)人員將變得顯而易見。
在這些條件下，本發(fā)明人進行了集中研究并且成功地從不同植物中分離出新的編碼棉子糖合酶的基因。這樣，本發(fā)明得以完成。
即，本發(fā)明提供了1．棉子糖合酶基因，包括在嚴格的條件下可與選自下組的核苷酸序列雜交的核苷酸序列(a)編碼由SEQ ID NO:1所表示氨基酸序列的核苷酸序列，(b)由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列，(c)編碼由SEQ ID NO:3所表示氨基酸序列的核苷酸序列，(d)由SEQ ID NO:4所表示核苷酸序列中的236位到2584位核苷酸所表示的核苷酸序列，(e)編碼由SEQ ID NO:5所表示氨基酸序列的核苷酸序列，(f)由SEQ ID NO:6所表示核苷酸序列中134位到2467位核苷酸所表示的核苷酸序列，(g)編碼由SEQ ID NO:7所表示氨基酸序列的核苷酸序列，和(h)由SEQ ID NO:8所表示核苷酸序列中1位到第1719位核苷酸所表示的核苷酸序列，并且其中的核苷酸序列編碼能夠經(jīng)α-(1→6)鍵結(jié)合D-半乳糖基至附著到蔗糖分子中D-葡萄糖殘基6-位置碳原子的羥基以形成棉子糖的蛋白。
2．棉子糖合酶基因，包括編碼由SEQ ID NO:1所表示氨基酸序列的核苷酸序列。
3．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列。
4.棉子糖合酶基因，包括編碼由SEQ ID NO:3所表示氨基酸序列的核苷酸序列。
5.棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:4所表示核苷酸序列中第236位到2584位核苷酸所表示的核苷酸序列。
6．棉子糖合酶基因，包括編碼由SEQ ID NO:5所表示氨基酸序列的核苷酸序列。
7．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:6所表示核苷酸序列中第134位至2467位核苷酸所表示核苷酸序列。
8．棉子糖合酶基因，包括編碼由SEQ ID NO:7所表示氨基酸序列的核苷酸序列。
9．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:8所表示核苷酸序列中第1位到第1719位核苷酸所表示核苷酸序列。
10．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列。
11．核酸，包括上面1到10中任一項的棉子糖合酶基因的部分核苷酸序列。
12．用于檢測含有棉子糖合酶基因的核酸的方法，包括用標記的上面11的核酸作為探針通過雜交檢測所述的核酸。
13．用于擴增含有棉子糖合酶基因核酸的方法，包括用上面11的核酸作為引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增所述的核酸。
14．用于獲取棉子糖合酶基因的方法，其包括以下步驟用標記的上面11的核酸作為探針通過雜交檢測含有所述棉子糖合酶基因的核酸，和回收檢測到的核酸。
15．用于獲取棉子糖合酶基因的方法，其包括以下步驟用上面11的核酸作為引物通過PCR擴增含有所述棉子糖合酶基因的核酸，和回收擴增的核酸。
16．核酸，包括含有上面1到10中任一項的棉子糖合酶基因的核酸，其被連接到在宿主細胞中表現(xiàn)出啟動子活性核酸上。
17．載體，包括上面1到10中任一項的棉子糖合酶基因的核酸。
18．轉(zhuǎn)化子，其中上面1到10中任一項的棉子糖合酶基因被導入宿主細胞中。
19．轉(zhuǎn)化子，其中上面16的核酸被導入宿主細胞中。
20．轉(zhuǎn)化子，其中上面17的載體被導入宿主細胞中。
21．上面1 8到20中任一項的轉(zhuǎn)化子，其中的宿主為微生物。
22．上面18到20中任一項的轉(zhuǎn)化子，其中的宿主為植物。
23．用于制備棉子糖合酶的方法，其包括以下步驟培養(yǎng)或繁殖上面18到22中任一項的轉(zhuǎn)化子以制備棉子糖合酶，和收集該棉子糖合酶。
24．棉子糖合酶，包括由SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列。
25．棉子糖合酶，包括由SEQ ID NO:3所表示的氨基酸序列。
26．棉子糖合酶，包括由SEQ ID NO:5所表示的氨基酸序列。
27．棉子糖合酶，包括由SEQ ID NO:7所表示的氨基酸序列。
這里應用的術(shù)語“核酸”意為一般稱為“DNA”或“RNA”的寡聚體化合物或高分子化合物。
下述的基因工程技術(shù)可以，例如，根據(jù)在“分子克隆實驗指南第2版”(1989)，冷泉港實驗室出版社，ISBN0-87969-309-6；“當前分子生物學方法”(1987),John Wile&Sons，公司，ISBN0-471-50338-X；“當今蛋白科學方法”(1995),John Wile&Sons，公司，ISBN0-471-11184-8中所述的方法完成。
本發(fā)明的基因可獲自大豆、屬于藜科的植物如甜菜等及十字花科如芥菜籽、油菜籽等。本發(fā)明基因的具體實例包括含有下面核苷酸序列的那些基因，包括編碼由SEQ ID NO:1所表示氨基酸序列的核苷酸序列、由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列、編碼由SEQ IDNO:3所表示氨基酸序列的核苷酸序列、由SEQ ID NO:4所表示的核苷酸序列或由SEQ ID NO:4所表示核苷酸序列中236位到2584位核苷酸所表示的核苷酸序列、編碼由SEQ ID NO:5所表示氨基酸序列的核苷酸序列、由SEQ ID NO:6所表示的核苷酸序列或由SEQ ID NO:6所表示的核苷酸序列中134位到2467位核苷酸所表示的核苷酸序列、編碼由SEQ ID NO:7所表示氨基酸序列的核苷酸序列、由SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列或由SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列中1位到1719位核苷酸所表示的核苷酸序列等。
本發(fā)明的基因可通過，例如，下面的方法而獲取。
即，例如，通過下面的方法可獲取源自大豆的本發(fā)明基因。
例如，該基因可通過以下步驟獲取，包括用具有SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列的核酸作為探針的雜交法以檢測大豆DNAs中與該探針雜交的核酸片段，然后分離檢測到的核酸。
在該方法中，首先，制備待用作探針的核酸。作為這樣的核酸，例如，存在由根據(jù)SEQ ID NO:2核苷酸序列通過常規(guī)方法化學合成的寡核苷酸所組成的核酸。其具體的實例包括具有由SEQ ID NO:2所表示核苷酸序列中800位到899位核苷酸的核酸。
作為選擇，源自大豆的本發(fā)明基因可通過下面方法獲取。
例如，將大豆(Glycine max)組織凍于液氮中并且用研體或其它方法將其物研磨成細碎的組織碎粉。從該組織碎粉中，通過常規(guī)方法提取RNA。商業(yè)可得到的RNA提取試劑盒可用于該提取中。通過乙醇沉淀從這樣獲得的RNA提取物中回收RNA。通過常規(guī)方法從這樣回收的RNA中分級分離具有Poly-A尾部的RNA。商業(yè)上可得到的oligo-dT柱可用于該分級分離中。從通過常規(guī)方法這樣獲得的具有poly-A尾部的RNA中合成cDNA。合成可用商業(yè)上可得到的cDNA合成試劑盒完成。用上面獲得的cDNA作為模板并且用根據(jù)SEQ ID NO:2核苷酸序列命名和合成的引物通過PCR擴增DNA。更為具體地，作為引物，例如，有后面表1中所示的引物11和12。當PCR用這些引物并且用源自大豆的cDNA作為模板進行時，可獲取源自大豆的本發(fā)明基因，如，“具有編碼SEQ ID NO:1氨基酸序列核苷酸序列的棉子糖合酶基因”和“具有SEQ ID NO:2核苷酸序列的棉子糖合酶基因”。
可根據(jù)，例如，在“分子克隆實驗指南第2版”(1989)，冷泉港實驗室出版社；或“當今分子生物學方法”(1987),John Wiley&Sons，公司，ISBN0-471-50338-X中所述的常規(guī)方法克隆擴增的DNA。作為選擇，例如，可通過應用商業(yè)上可得到的克隆試劑盒如TA克隆試劑盒(Invitrogen)和商業(yè)上可得到的質(zhì)粒載體如pBluescript Ⅱ(Stratagene)進行克隆?？赏ㄟ^如F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson在美國自然科學院院報(1977),74,pp.5463-5467中所述的雙脫氧終止方法測定該DNA克隆的核苷酸序列。例如，可應用商業(yè)可得到的試劑盒如珀金-埃爾默公司生產(chǎn)的ABI PRISM Dye Terminator Cycle測序即用反應試劑盒。
表1引物11:ccaatctgat catgcttgtg ccgaa 25聚體引物12:ggaacaaagt tatgcactat tatttaaggt 30聚體源自藜科植物如甜菜的本發(fā)明基因可通過下面的方法獲取。
例如，將藜科植物如甜菜(Beta vulgaris)的組織凍于液氮中并從研體或其它手段物理研磨成細碎的組織碎粉。從這些組織碎粉中，通過常規(guī)方法提取RNA。商業(yè)上可得到的RNA提取試劑盒可用于此提取中，通過乙醇沉淀從這樣獲得的RNA提取物中回收RNA。從回收的RNA中，通過常規(guī)的方法分級分離具有poly-A尾部的RNA。商業(yè)上可得到的oligo-dT柱可用于此分級分離中。通過常規(guī)的方法從這樣獲得的具有poly-A尾部的RNA中合成cDNA?？赏ㄟ^利用商業(yè)上可得到的cDNA合成試劑盒完成此合成。用上面獲得的cDNA作為模板并且根據(jù)SEQ IDNO:4核苷酸序列命名和化學合成的引物通過PCR擴增DNA。更為具體地，作為引物，例如，有后面表2中所示的引物21和22。當用這些引物及源自甜菜的cDNA作為模板進行PCR時，可獲取源自甜菜的本發(fā)明基因，如，“具有編碼SEQ ID NO:3氨基酸序列核苷酸序列的棉子糖合酶基因”，和“具有SEQ ID NO:4核苷酸序列的棉子糖合酶基因”。根據(jù)特定的目的，此PCR引物也可根據(jù)SEQ ID NO:4的核苷酸序列命名和合成。例如，為了擴增“具有由SEQ ID NO:4所表示核苷酸序列中第236位到第2584位核苷酸所表示的核苷酸序列的棉子糖合酶基因”，優(yōu)選地，合成具有由下表2中引物23和24所表示核苷酸序列的寡核苷酸并且用作引物。
可根據(jù)常規(guī)的方法，例如，在“分子克隆實驗指南第2版”(1989)，冷泉港實驗室出版社；或“當今分子生物學方法”(1987),John Wiley&Sons，公司，ISBN0-471-50388-X中所述的方法，克隆此擴增出的DNA。作為選擇，克隆可通過應用商業(yè)上可得到的克隆試劑盒如TA克隆試劑盒(Invitrogen)及商業(yè)可得到的質(zhì)粒載體如pBluescript Ⅱ(Stratagene)進行。例如，可通過如F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson在美國自然科學院院報(1977),74,pp.5463-5467中所述的雙脫氧終止方法測定此DNA克隆的核苷酸序列。例如，優(yōu)選地，可應用商業(yè)上可得到的試劑盒如由珀金-埃爾默公司生產(chǎn)的ABI PRISM DyeTerminator Cycle測序即用反應試劑盒。
表2引物21:ctaccaaatt ccacaactta aagttca 27聚體引物22:ggaataataa gcttcacaca tactgtactc tc 32聚體引物23:atggctccaa gctttagcaa ggaaaattcc30聚體引物24:tcaaaataag tactcaacag tggtaaaacc30聚體源自十字花科植物如芥菜(Brassica juncea)和歐洲油菜(Brassica napus)的本發(fā)明基因可通過下面的方法獲取。
例如，將十字花科植物如芥菜或油菜的組織凍于液氮中并以研體或其它手段物理研磨成細碎的組織碎粉。從運組織碎粉中，通過常規(guī)方法提取RNA。商業(yè)上可得到的RNA提取試劑盒可用于該提取中。通過乙醇沉淀從這樣獲得的RNA提取物中回收RNA。通過常規(guī)的方法，從這樣回收的RNA中分級分離具有poly-A尾部的RNA。商業(yè)上可得到的oligo-dT柱可用于此分級分離中。通過常規(guī)的方法從這樣獲得的具有poly-A尾部RNA中合成cDNA。此合成可通過應用商業(yè)上可得到的cDNA合成試劑盒完成。用上面獲取的cDNA作為模板并用根據(jù)SEQ IDNO:6核苷酸序列命名和化學合成的引物通過PCR擴增DNA。例如，當PCR用源自芥菜(Brassica juncea)的cDNA作為模板并且用后面表3中所示引物33和34進行PCR時，可獲取本發(fā)明源自十字花科植物的基因，如，“具有編碼SEQ ID NO:5氨基酸序列核苷酸序列的棉子糖合酶基因”，和“具有由SEQ ID NO:6所表示核苷酸序列中第1個到第2654個核苷酸所表示核苷酸序列的棉子糖合酶基因”。根據(jù)特定的目的，PCR引物也可根據(jù)SEQ ID NO:6核苷酸序列命名和合成。例如，為了擴增編碼“具有編碼具有SEQ ID NO:5氨基酸序列蛋白核苷酸序列的棉子糖合酶基因”，和“具有SEQ ID NO:6中第134位到第2467位核苷酸所表示核苷酸序列的棉子糖合酶基因開放閱讀框區(qū)域的DNA，優(yōu)選地，合成具有由表3中引物35和36所表示核苷酸序列的寡核苷酸并且用作引物。
可根據(jù)常規(guī)方法，如在“分子克隆實驗指南第2版”(1989)，冷泉港實驗室出版社，或“當今分子生物學方法”(1987),John Wiley&Sons，公司，ISBN0-471-50338-X中所述的方法克隆此擴增的DNA。作為選擇，例如，可通過應用商業(yè)可得到的TA克隆試劑盒(Invitrogen)或商業(yè)上可得到的質(zhì)粒載體如pBluescript Ⅱ(Stratagene)完成克隆。可通過如F.Sanger,S.Nicklen,A.R Coulson，在美國國家科學院院報(1977),74,pp.5463-5467中所述的雙脫氧終止方法測定此DNA克隆的核苷酸序列。例如，優(yōu)選地，可應用商業(yè)上可得到的珀金-埃爾默公司的ABI PRISM Dye Terminator Cycle測序即用反應試劑盒。
表3引物31:ttggaagaga agacgccgcc gggaatcgtc 30聚體引物32:ttaagccccg gcgagagctc tggccggaca 30聚體引物33:accaatccaa aatctcatca aataatcgca 30聚體引物34:aaataatagg ggcagtacaa attacaccac 30聚體引物35:atggctccac cgagcgtaat taaatccga 29聚體引物36:ctaaaactca tacttaatag aagacaaacc 30聚體然后，標記通過上述方法獲得的具有本發(fā)明基因部分核苷酸序列的核酸(之后稱為“基因片段”)且然后用作雜交方法中的探針。該探針可雜交至，例如，源自大豆、藜科植物或十字花科植物的DNA以檢測出具有特異性結(jié)合到其中探針的核酸，因而檢測出具有棉子糖合酶基因的核酸。
作為源自大豆、藜科植物如甜菜或十字花科植物如芥菜或油菜的DNA，例如，可應用這些植物的cDNA文庫或基因組DNA文庫。此基因文庫也可是商業(yè)上可得到的基因文庫本身或根據(jù)常規(guī)的文庫構(gòu)建方法。例如，在“分子克隆室驗指南第2版”(1989)，冷泉港實驗室出版社；“當今分子生物學方法”(1987),John Wiley&Sons，公司，ISBN0-471-50338-X中所述方法構(gòu)建的文庫。
作為雜交方法，例如，可利用噬菌斑雜交或菌落雜交，并且它們依據(jù)在文庫構(gòu)建中所用載體的種類加以選擇。更為具體地，當待用的文庫以噬菌體載體構(gòu)建時，在感染的條件下將適宜的宿主微生物與文庫噬菌體混合。將轉(zhuǎn)化子進一步與柔軟的瓊脂培養(yǎng)基混合，并且將此混合物置于瓊脂培養(yǎng)基上。之后，將此混合物于37℃培養(yǎng)直至適宜大小的噬菌斑出現(xiàn)為止。當待用的文庫以質(zhì)粒載體構(gòu)建時，將質(zhì)粒導入適宜的宿主微生物以形成轉(zhuǎn)化子。將獲得的轉(zhuǎn)化子稀釋至適宜的濃度并將稀釋液置于瓊脂培養(yǎng)基上，然后將其培養(yǎng)于37℃直至適宜大小的菌落出現(xiàn)為止。在上面二種文庫的任一情況中，在上面的培養(yǎng)后將濾膜(membranefilter)置于瓊脂培養(yǎng)基的表面，從而將噬菌體或轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移至該膜上。該膜以堿變性，然后中和，并且例如，當應用尼龍膜時，用紫線光照射此膜，從而噬菌體或轉(zhuǎn)化子的DNA被固定于該膜上。然后將該膜用于雜交方法，其中具有本發(fā)明基因部分核苷酸序列并通過常規(guī)方法標記的基因片段(之后稱為“標記的基因片段”)用作探針。對于該方法，例如，可參照D.M.Glover編，“DNA克隆，實踐方法”IRL出版社(1985)，ISBN0-947946-18-7。有多種試劑和溫度條件待用于此雜交中。例如，一般地，通過將該濾膜浸于預雜交液〔6×SSC(0.9M NaCl,0.09M檸檬酸)，0.1至1(w/v)％SDS,100μg/ml變性鮭精DNA〕并且于65℃孵育1小時完成預雜交。然后，通過向其中添加和混合標記的基因片段并且于42℃到68℃將此膜孵育4到16小時而完成雜交。
在本發(fā)明中，“嚴格的條件”為在上述雜交中其中的孵育在，例如，65°到68℃完成的那些條件。
雜交后，取出濾膜并以含有0.1到1(w/v)％SDS的2×SSC洗，進一步以含有0.1到1(w/v)％SDS的0.2×SSC沖洗，且然后干燥。例如，通過放射自顯影或其它技術(shù)分析此膜以檢測出探針在膜上的位置，因而檢測出具有同源于所用探針核苷酸序列的核酸在濾膜上的位置。在原初瓊脂培養(yǎng)基上鑒定相應于這樣檢測到核酸在濾膜上位置的克隆并且篩選出陽性克隆從而可分離具有此核酸的克隆。重復相同的檢測方法以純化具有此核酸的克隆。
作為選擇，可應用商業(yè)上可得到的試劑盒如GENE TRAPPERcDNA Positive Section Sysfem試劑盒(GibcoBRL)。在此方法中，首先，將單鏈DNA文庫與生物素化的基因片段(即，探針)雜交，然后加入結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白的磁珠并混合從該混合物中，用磁鐵收集結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白的磁珠，從而收集和檢測具有同源于所用探針核苷酸序列并且經(jīng)該基因片段、生物素和鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合到這些小珠上的單鏈DNA。此收集到的單鏈DNA可通過用適當?shù)墓押塑账嶙鳛橐锱c適宜的DNA聚合酶處理而反應雙鏈形式。
如上所述，含有棉子糖合酶基因的核酸可通過以下步驟而獲取，包括檢測源自大豆、藜科植物或十字花科植物基因文庫DNA中可與此基因片段雜交的核酸、純化具有此核酸的克隆和從該克隆中分離噬菌體或質(zhì)粒DNA。通過根據(jù)常規(guī)方法制備這樣獲得核酸的限制性圖譜或測定其核苷酸序列，可確證含有本發(fā)明基因的核酸。
例如，來自藜科植物的本發(fā)明基因可通過下面的幾點加以確證由這樣測定的核苷酸序列所編碼的氨基酸與由SEQ ID NO:3氨基酸序列中103位到208位氨基酸所表示的氨基酸序列具有75％或更高的同源性；與由SEQ ID NO:3氨基酸序列中255位到271位氨基酸所表示的氨基酸序列有80％或更高的同源性；與由SEQ ID NO:3氨基酸序列中289位到326位氨基酸所表示的氨基酸序列有70％或更高的同源性；或與由SEQ ID NO:3氨基酸序列中610到696位氨基酸所表示的氨基酸序列有70％或更高的同源性。
例如，可通過以下幾點確證源自十字花科植物的本發(fā)明基因由該測定的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列與由SEQ ID NO:5氨基酸序列中111位到213位氨基酸所表示的氨基酸序列具有75％或更高的同源性；與由SEQ ID NO:5氨基酸序列中260位到275位氨基酸所表示的氨基酸序列有80％或更高的同源性；與由SEQ ID NO:5氨基酸序列中293位到325位氨基酸所表示的氨基酸序列有70％或更高的同源性；與由SEQ ID NO:5氨基酸序列中609位到695位氨基酸所表示的氨基酸序列有70％或更高的同源性。
這里應用的“同源性”意為根據(jù)比較二種氨基酸序列中具有類似性的區(qū)域，在一個區(qū)域中與待比較的不同區(qū)域中具有相同氨基酸數(shù)目對前者區(qū)域中全部氨基酸數(shù)目的比例。在這方面具有類似性的區(qū)域含有更多的氨基酸是優(yōu)選的。氨基酸序列的這種同源性可通過用商業(yè)上可得到的基因分析軟件如GENETIX(Software Kaihatu K.K)加以評價。
此外，根據(jù)上述相同的方式，可通過用該基因片段作為探針與來自所需生物的DNA雜交以檢測出探針特異性結(jié)合的核酸而檢測出含有棉子糖合酶基因的核酸(之后稱為本發(fā)明檢測方法)。這里應用的基因片段可依據(jù)由SEQ ID NO:2、4、6或8所表示的核苷酸序列根據(jù)常規(guī)的方法化學合成。作為選擇，其可用依據(jù)由SEQ ID NO:2、4、6或8所表示的核苷酸序列根據(jù)常規(guī)方法化學合成的寡核苷酸作為引物通過PCR加以制備。
該基因片段可以是棉子糖合酶基因的非翻譯區(qū)以及其開讀框的一部分。例如，與5′-上游端的一部分核苷酸序列如SEQ ID NO:4核苷酸序列的1-235位核苷酸，SEQ ID NO:6核苷酸序列的1-133位核苷酸相同的寡核苷酸；或者與3′-下游端的一部分核苷酸序列如SEQ ID NO:4核苷酸序列的2588-2675位核苷酸，SEQ IDNO:6核苷酸序列的2468-2676位核苷酸相同的寡核甘酸。
當PCR用該基因片段作為引物進行時，從源自所需生物DNA中擴增出含有棉子糖合酶基因的核酸是可能的(之后稱為本發(fā)明擴增方法)。
更為具體地說，例如，根據(jù)常規(guī)方法設計和化學合成具有該基因片段核苷酸序列的寡核苷酸。一般來說，從確保退火特異性的角度來看，此核苷酸的數(shù)目越多是更為優(yōu)選的。然而，從引物自身易形成更高級結(jié)構(gòu)導致退火效率的可能破壞以及合成后的純化中需要復雜的步驟角度來講，此核苷酸的數(shù)目不是太多也是優(yōu)選的。通常，由15到50個堿基所組成的寡核苷酸是優(yōu)選的。在運方面，根據(jù)顯示由密碼子編碼氨基酸對應性的密碼子表，也可通過應用多種堿基混合物而合成引物的混合物，從而根據(jù)可編碼某一種特定氨基酸的密碼子的改變將引物中特定位置的殘基變成不同的堿基。作為選擇，例如，可以應用堿基如可與多種堿基形成堿基對的肌苷代替上面多種堿基的混合物。
密碼子表Phe:UUU,UUC Ser:UCU,UCC,UCA,UCG,AGU,AGCTyr:UAU,UAC Cys:UGU,UGC終止密碼子UAA,UAG,UGA Trp:UGGLeu:UUA,UUG,CUU,CUC,CUA,CUGPro:CCU,CCC,CCA,CCG His:CAU,CAC Gln:CAA,CAG Arg:CGU,CGC,CGA,CGG,AGA,AGGIle:AUU,AUC,AUA Thr:ACU,ACC,ACA,ACGAsn:AAU,AAC Lys:AAA,AAGMet:AUGVal:GUU,GUC,GUA,GUG Ala:GCU,GCC,GCA,GCGAsp:GAU,GAC Gly:GGU,GGC,GGA,GGGGlu:GAA,GAG
在上面的密碼子表中，每個密碼子顯示為mRNA中的核苷酸序列并且其左手為5′-端。U表示RNA中的尿嘧啶堿基并且相應于DNA中的胸腺嘧啶。
與本發(fā)明基因雙鏈DNA的編碼鏈具有相同核苷酸序列的寡核苷酸稱為“有義引物”并且具有與該編碼鏈互補寡核苷酸序列的寡核苷酸稱為“反義引物”。
與本發(fā)明基因編碼鏈中5′-上游一側(cè)具有相同核苷酸序列的有義引物和具有與該編碼鏈3′-下游一側(cè)核苷酸序列互補的核苷酸序列的反義引物例如，與作為模板的基因文庫、基因組DNA或cDNA共同用于PCR反應以擴增DNA。作為待用的基因文庫，例如，有源自大豆、藜科植物如甜菜或十字花科植物如芥菜或油菜等的cDNA文庫和基因組文庫。該基因文庫也可為根據(jù)常規(guī)文庫構(gòu)建方法，例如，在“分子克隆實驗指南第2版”(1989)，冷泉港實驗室出版社；“當今分子生物學方法”(1987),John Wiley&Sons公司，ISBN0-471-50338-X中所述方法構(gòu)建的文庫或商業(yè)上可得到的基因文庫。作為基因組DNA或cDNA，例如，有從大豆、藜科植物如甜菜或十字花科植物如芥菜或油菜等制備出的基因組DNA或cDNA。例如，通過用上面表3中的引物31和32并且用源自芥菜的cDNA作為模板進行PCR以擴增具有由SEQID NO:6核苷酸序列中749位到1215位核苷酸所表示核苷酸序列的DNA。此外，通過用該引物并且用源自油菜的cDNA作為模板進行PCR以擴增具有由SEQ ID NO:8核苷酸序列中1位到467位核苷酸所表示核苷酸序列的DNA。這樣擴增出的核酸可通過常規(guī)的電泳加以確證。可根據(jù)常規(guī)的方法如在“分子克隆實驗指南第2版”(1989)，冷泉港實驗室出版社或“當今分子生物學方法”(1987),John Wiley&Sons公司，ISBN0-471-50338-X中所述的方法克隆該核酸。對于該核酸，通過常規(guī)方法制備其限制性圖譜或測定其核苷酸序列，從而可鑒定出含有棉子糖合酶基因或其一部分的核酸。當該核酸含有棉子糖合酶的一部分時，可根據(jù)其核苷酸序列進行PCR以擴增出含有5′-上游一側(cè)核苷酸序列或3′-下游一側(cè)核苷酸序列的核酸。即，根據(jù)上面獲得的核酸的核苷酸序列，設計和合成反義引物用于擴增5′-上游一側(cè)的部分，并且設計和合成有義引物用于擴增3′-下游一側(cè)的部分?？赏ㄟ^用運些引物的RACE方法和商業(yè)上可得到的試劑盒如Clontech的Marathon Kit測定已獲得核苷酸序列5′-上游一側(cè)部分或3′-下游一側(cè)部分的核苷酸序列?？赏ㄟ^根據(jù)這樣測得核苷酸序列中的二個末端序列合成新的引物并再次進行PCR而獲得全長棉子糖合酶基因。
本發(fā)明的上述測定方法也可用于植物如大豆、藜科植物或十字花科植物等基因型的分析中。更為具體地說，例如，根據(jù)常規(guī)方法，例如，在“克隆與測序(植物生物技術(shù)實驗指南)”Itaru Watanabe監(jiān)導下編輯(complied),Masahiro Sugiura編(edited),Noson Bunka-sha出版，東京(1989)中所述的方法制備源自大豆、藜科植物或十字花科植物的基因組DNA。以至少數(shù)種限制酶消化該基因組DNA，然后電泳。根據(jù)常規(guī)的方法將電泳過的DNA印跡至濾膜上。將此濾膜與通過常規(guī)方法從具有該基因片段DNA中制備的探針雜交，并檢測與該探針雜交的DNA。比較特定植物種類不同變種間檢測出DNA的長度。這種長度差異使分析這些變種間伴隨棉子糖家族寡糖表達的表型特征差異成為可能。此外，當比較同一變種基因重組植物和非基因重組植物之間通過上述方法測得DNA的長度時，通過測定前者植物較后者植物雜交帶數(shù)目更大或濃度更高而可區(qū)分出前者植物與后者植物。此方法可根據(jù)RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)方法，例如在“植物PCR實驗方法”KoShimamoto和Takuji Sasaki監(jiān)導下編輯，Shujun-sha出版，東京(1995),ISBN4-87962-144-7,pp.90-94中所述方法完成。
此外，本發(fā)明的擴增方法可用于大豆、藜科植物或十字花科植物等基因的分析。更為具體地說，例如，本發(fā)明擴增方法通過應用從大豆、藜科植物或十字花科植物中制備的植物基因組DNA來完成以擴增DNA。將此擴增出的DNA與甲醛溶液混合，然后于85℃加熱變性5分鐘并且然后于冰上快速冷卻。將其樣品于，例如，含有0(v/v)％或10(v/v)％甘油的6(w/v)％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。對于該電泳，可應用商業(yè)上可得到的電泳儀如用于SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)的電泳儀并且維持凝膠于恒溫，例如，于5℃、25℃、37℃等進行電泳。從該電泳過的凝膠中，例如，通過以商業(yè)上可得到的試劑用銀染方法測定DNA。根據(jù)在被測DNA電泳中不同變種間行為的差異，測定棉子糖合酶基因中的突變，并且分析由該突變所致伴隨以棉子糖家族寡糖表達的表型特征的差異。此方法可根據(jù)SSCP方法，例如，在“植物PCR實驗方法”在KoShimamoto和Takuji Sasaki監(jiān)導下編輯Shujun-sha出版，東京(1995),ISBN4-87962-144-7,pp.141-146中所述的方法完成。
通過上述測定方法對來自大豆、藜科植物或十字花科植物基因的分析或本發(fā)明的擴增方法不僅可用于分析伴隨以棉子糖家族寡糖表達的表型特征差異，而且，例如，可用于根據(jù)大豆、藜科植物或十字花科植物新的變種的產(chǎn)生而篩選具有所需特征的克隆。此外，其也可用于根據(jù)用重組植物產(chǎn)生植物變種而鑒定這樣制備的并且具有源自重組植物特征的克隆。
為了本發(fā)明基因在宿主細胞中的表達，優(yōu)選地，可應用包括含有本發(fā)明基因核酸片段的核酸和在宿主細胞中具有啟動子活性并且連接到前面的核酸片段上的核酸片段(之后稱為本發(fā)明表達核酸)。
只要其在待轉(zhuǎn)化的宿主中有功能，本發(fā)明表達核酸中具有啟動子活性的核酸片段不局限于特定的一種。例如，有在大腸桿菌中有功能的合成啟動子，如大腸桿菌乳糖操縱子啟動子、大腸桿菌色氨酸操縱子啟動子和tac啟動子等；酵母乙醇脫氫酶基因(ADH)啟動子、腺病毒主要晚期(Ad.ML)啟動子、SV40早期啟動子、桿狀病毒啟動子等。當宿主為植物時，啟動子可包括，例如，T-DNA來源的組成性啟動子如胭脂氨酸合酶基因(NOS)啟動子、章魚氨酸合酶基因(OCS)啟動子等；植物病毒來源的啟動子如花椰菜花葉病毒(CaMV)來源的19S和35S啟動子；可誘導的啟動子如苯丙氨酸脫氨酶(PAL)基因啟動子、查耳酮合酶(CHS)基因啟動子、病理相關(guān)蛋白(PR)基因啟動子等。此外，也可應用載體pSUM-GY1(參見JP-A06-189777/1994)，其具有導致在特定植物組織中特異性表達的啟動子，如大豆來源的種子貯存蛋白大豆球蛋白基因啟動子(JP-A6-189777)。
此外，可將具有終止子活性的核酸片段連接到本發(fā)明的表達核酸中。在此情況中，構(gòu)建本發(fā)明表達核酸從而將具有終止子活性的核酸片段定位于棉子糖合酶基因的下游一般是優(yōu)選的。只要其在待轉(zhuǎn)化的宿主細胞中有功能，該待用的終止子沒有特別的限制。例如，當宿主是植物時，有T-DNA來源的組成性終止子如胭脂氨酸合酶基因(NOS)終止子等；植物來源的終止子如洋蔥病毒GV1或GV2終止子等。
可根據(jù)常規(guī)的基因工程技術(shù)將本發(fā)明的表達核酸導入宿主細胞中以獲得轉(zhuǎn)化子。如果必要，依據(jù)用于導入該核酸至宿主細胞中的特定轉(zhuǎn)化技術(shù)可將本發(fā)明的表達核酸插入到具有適宜標記的載體中。
可根據(jù)常規(guī)的方法，例如，在“分子克隆實驗指南第2版”(1989)，冷泉港實驗室出版社或“當今分子生物學方法”(1987),John Wiley&Sons公司，ISBN0-471-50338-X中所述的方法，將其中插入有本發(fā)明表達核酸的載體導入到微生物中。可根據(jù)篩選標記如抗生素抗性、營養(yǎng)缺陷等篩選出以該載體轉(zhuǎn)化的微生物。當本發(fā)明基因連接到篩選微生物(如大腸桿菌轉(zhuǎn)化子)中可翻譯的形式中的可誘導啟動子(如，tac啟動子)下游時，本發(fā)明基因的翻譯產(chǎn)物可在常規(guī)培養(yǎng)下和可誘導條件下表達并可回收成肽或蛋白。
這樣制備的本發(fā)明基因翻譯產(chǎn)物的棉子糖合酶活性可通過，例如，L.Lehle和W.Tanner，在歐洲生物化學雜志，38,103-110(1973)中描述的方法加以測定以鑒定出具有“經(jīng)α(1→6)鍵結(jié)合D-半乳糖基至附著到蔗糖分子中D-葡萄糖殘基6-位置碳原子上的羥基上能力”的翻譯產(chǎn)物。更為具體地說，例如，將本發(fā)明基因克隆入pGEX-4T3(發(fā)瑪西亞)中以獲得含有本發(fā)明表達核酸的質(zhì)粒。將得到的質(zhì)粒導入，例如，大腸桿菌HB101菌株中以獲得轉(zhuǎn)化子。將得到的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)過夜并將1ml培養(yǎng)物接種至100ml LB培養(yǎng)基中。將其于37℃孵育約3小時并加入IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至1mM的終濃度，然后進一步孵育5小時，通過離心從培養(yǎng)基中回收細胞并且通過加入10倍于細胞重量的100mM Tris-HCl(pH7.4)、1mM EDTA、5mM DTT(二硫蘇糖醇)、1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)和1mM苯甲酰胺而將其懸浮。用超聲破碎儀(Branson)超聲粉懸液以破碎細胞。離心破碎過的細胞懸液以回收可溶性蛋白溶液。將得到的蛋白溶液加入到含有終濃度為100mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM DTT(二硫蘇糖醇)、0.01％BSA、200uM蔗糖、5mM肌醇半乳糖苷和31.7uM[14C]蔗糖的反應混合物中。將該反應混合物于37℃孵育，然后加入1.5倍體積的乙醇并攪拌。通過離心去除不溶性物質(zhì)，將上清液點樣于，例如，HPTLC纖維素薄層層析板(Merch,HPTLC平板纖維素)上且然后將平板用正丁醇-吡啶-水-乙酸(60:40:30:3)展開。干燥展開的平板并用富士膠片公司生產(chǎn)的圖像分析儀(FUJIX Film Bio-Image AnalyzerBAS-2000Ⅱ)加以分析以測定產(chǎn)生的[14C]棉子糖從而測定棉子糖合酶的活性。
此外，按上述制備的翻譯產(chǎn)物也可用作制備抗體的抗原。這樣制備的抗體可用于，例如，從如植物的生物中制備的粗蛋白提取物中對本發(fā)明基因的檢測和測定。
當宿主為植物時，可通過常規(guī)的方法如農(nóng)桿菌感染方法(JP-B2-58917和JP-A60-70080)、電穿孔至原生質(zhì)體(JP-A60-251887和JP-B5-68575)或粒子槍方法(JP-A5-508316和JP-A63-258525)將其中插入有本發(fā)明基因的載體導入植物細胞中。通過導入該載體而化的植物細胞可根據(jù)篩選標記，例如，對抗生素如卡那霉素或潮霉素的抗性而加以篩選。從這樣轉(zhuǎn)化的植物細胞中，可通過常規(guī)植物細胞培養(yǎng)方法，例如，在Uchimiya著的“植物基因操作手冊(如何制備轉(zhuǎn)基因植物)”，1990,Kodan-sha Scientfic(ISBN4-06-153513-7),pp.27-55中所述的方法再生轉(zhuǎn)化的植物。此外，從該轉(zhuǎn)化的植物中收集種子也使擴增該轉(zhuǎn)化的植物成為可能。此外，該獲得的轉(zhuǎn)化植物與非轉(zhuǎn)化植物之間的雜交使制備具有此轉(zhuǎn)化植物特征的子代植物成為可能。
作為在大豆中的基因工程技術(shù)，基本上可利用上述常規(guī)的技術(shù)。更為具體地說，可以利用通過在EP301749中所述“粒子槍基因?qū)敕椒ㄞD(zhuǎn)化大豆植物品系”。例如，Torisky,R.S.,Kovacs,L,Avdiushko,S.,Newman,J.D.,Hunt,A.G.和Collins,G.B.，在“根據(jù)劇毒(supervirulent)根癌農(nóng)桿菌Chry5菌株開發(fā)用于植物轉(zhuǎn)化的雙重載體(binary vector)系統(tǒng)”，植物細胞報告，(1997),17,p.102-108，等中所述的方法。
作為藜科植物中的基因工程技術(shù)，基本上可利用上述常規(guī)的技術(shù)。更為具體地說，可以利用，例如，M.Mannerlof,S.Tuvesson,P.Steen和P.Tenning，在“對草甘膦具有耐受性的轉(zhuǎn)基因甜菜”，Euphytica(1997),94,p83-91中所述的方法，B.K.Konwar，在“根癌農(nóng)桿菌介導的甜菜(Beta vulgaris L.)的遺傳轉(zhuǎn)化”，植物生物化學及生物技術(shù)雜志(1994),3,p.37-41中所述的方法。
作為十字花科植物的基因工程技術(shù)，基本上可利用上述常規(guī)的技術(shù)。更為具體地說，基因?qū)肟筛鶕?jù)，例如，J.Fry,A.Barnason和R.B.Horsch，在“以基于根癌農(nóng)桿菌的載體對歐洲油菜(Brassicanapus)的轉(zhuǎn)化”，植物細胞報告(1987),6.321-325中所述的方法完成。
例如，當基因?qū)胪ㄟ^農(nóng)桿菌感染方法完成時，首先，將上述的本發(fā)明表達核酸插入雙重載體中?？蓪⒌玫降妮d體導入，例如，已通過氯化鈣處理而變成感受態(tài)的農(nóng)桿菌LBA4404菌株中。可根據(jù)該載體的篩選標記基因通過適當?shù)暮Y選方法而篩選轉(zhuǎn)化子，例如，在篩選標記基因為賦予對抗生素如卡那霉素抗性的基因時在含有抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有載體的菌株?？蓪⒌玫降霓D(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基，例如，LB培養(yǎng)基中。
大豆、藜科植物或十字花科植物可通過應用這樣獲得的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)基按下述加以轉(zhuǎn)化。例如，將來自大豆、甜菜、油菜或芥菜的種子無菌播種于，例如，含2％蔗糖和0.7％瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基中。約1周后，用解剖刀無菌切除長出植物的子葉及葉柄并且移植于，例如，含有3％蔗糖、0.7％瓊脂、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D和3.3μMAgNO3的MS培養(yǎng)基中并培養(yǎng)一天。將這樣預培養(yǎng)出的子葉及葉柄轉(zhuǎn)移到上面農(nóng)桿菌培養(yǎng)基的1000-倍稀釋液中并使其靜置5分鐘。將子葉及葉柄再次轉(zhuǎn)移到與預培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基中并培養(yǎng)約3到4天。將這樣培養(yǎng)出的子葉及葉柄轉(zhuǎn)移到，例如，含有3％蔗糖、0.7％瓊脂、4.5μMBA、0.05μM 2.4-D、3.3μM AgNO3和500mg/升頭孢噻肟的MS培養(yǎng)基中，然后振動1天以去除微生物細胞。將得到的子葉及葉柄轉(zhuǎn)移到，例如，含有3％蔗糖、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、3.3μMAgNO3t100mg/升頭孢噻肟及20mg/升卡那霉素的MS培養(yǎng)基中，然后培養(yǎng)3到4周。然后，將此子葉及葉柄轉(zhuǎn)移至，例如，含有3％蔗糖、0.7％瓊脂、4.5μM BA、0.05μM 24-D、100mg/升頭孢噻肟及20mg/ml卡那霉素的MS培養(yǎng)基中并培養(yǎng)。以每3到4周傳代培養(yǎng)而持續(xù)在此培養(yǎng)基中的培養(yǎng)。當再生出嫩枝時，將其傳代培養(yǎng)于，例如，含有3％蔗糖、0.7瓊脂和20mg/升卡那霉素的MS培養(yǎng)基中3到4周。當該植物產(chǎn)生出根時，將其轉(zhuǎn)移到蛭石-泥炭蘚(1:1)中并通過在12小時12小時=白天時間晚間的日夜條件下于21到22℃培養(yǎng)而使其適應。隨著植物的生長，將其轉(zhuǎn)移到適宜的培養(yǎng)土壤中以培養(yǎng)該植物。根據(jù)上述方法從該再生植物的葉子提取基因組DNA并且用具有本發(fā)明表達核酸的部分核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進行PCR以確證本發(fā)明基因插入到植物中。
如上面所述，通過導入本發(fā)明基因到植物，例如，大豆、藜科植物或十字花科植物，改變棉子糖合酶在植物中的表達水平和活性以控制棉子糖家族寡糖在該植物中的量是可能的，根據(jù)基因同源技術(shù)，例如，同源重組技術(shù)及反義技術(shù)、共抑制技術(shù)等，本發(fā)明基因在改變棉子糖合酶在大豆、藜科植物或十字花科植物中表達水平和活性的技術(shù)中是有用的。
下面的實施例進一步詳細說明本發(fā)明而不應解釋為要限制本發(fā)明的范圍。
實施例1大豆cDNA的制備將大約2g未成熟大豆(Glycine max)Williams82的種子凍于液氮中且然后用研體研磨，向其中加入20ml Isogen(Nippon Gene)，并進一步徹底研磨該混合物。將研磨過的材料轉(zhuǎn)移到離心管中，向其中加入4ml氯仿，并用渦輪混合器攪拌此混合物并且然后以6,500xg于4℃離心10分鐘。收集水層，向其中加入100ml異丙醇，并且攪拌混合物且然后以6,500xg于4℃離心10分鐘。將得到的沉淀物以10ml70％乙醇洗且然后溶解于1ml洗脫緩沖液(10mM Tris-HCl/pH7.5,1mMEDTA,0.1％SDS)中。將該溶液于60℃靜置10分鐘且然后于10,000xg離心1分鐘以去除不溶性物質(zhì)。向得到的上清液中加入等體積的Oligotex-dT30(Takara)，并且攪拌該混合物且然后使其于65℃靜置5分鐘。此外，將該混合物置于冰上并且使其靜置3分鐘，向其中加入200μl 5M的NaCl，且混合該混合物且然后使其于37℃靜置10分鐘。然后以10,000xg于4℃離心該混合物3分鐘。收集沉淀物并懸浮于1mlTE緩沖液中，并讓此懸液置于冰上且然后使其靜置3分鐘，然后以10,000xg于4℃離心3分鐘以去除沉淀物。
向得到的上清液中加入100μl 3M的醋酸鈉和2ml乙醇以沉淀和收集RNA。以70％的乙醇洗收集的RNA兩次且然后溶解于20ml無菌水中用于隨后的cDNA合成。通過測定260nm處的吸收測定獲得的RNA量。
為了cDNA合成，應用用于RT-PCR的第一條鏈合成試劑盒(Amersham)和cDNA合成試劑盒(Takara)，并且所有的操作均根據(jù)附于試劑盒中的方法完成。
實施例2從大豆cDNA中克隆棉子糖合酶基因通過用從實施例1中未成熟大豆(Glycine max)Williams82的種子中獲得的cDNA作為模板和根據(jù)SEQ ID NO:1的氨基酸序列設計的引物，即，具有下表4中所示核苷酸序列的引物進行PCR以擴增DNA片段。用Clontech的Advantage KlenTaq cDNA試劑盒以珀金埃爾默公司的Gene Amp PCR Systems2400和DNA熱循環(huán)儀480型進行PCR。通過重復維持于94℃1分鐘、50℃3分鐘且然后于72℃3分鐘的循環(huán)40次以完成反應而擴增出該DNA片段。用TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆該擴增出的DNA片段，然后進行用珀金-埃爾默的ABI PRISM Dye Terminator Cycle測序即用反應試劑金的測序反應和以ABI的373S DNA測序儀對該核苷酸序列進行分析。根據(jù)此序列，合成具有示于下表5中核苷酸序列的引物。該cDNA合成用從實施例中大豆Williams82葉子中獲得的mRNA以Clontech的Marathon試劑盒完成。將此獲得的cDNA用連接酶連接到該試劑盒中所含的銜接子上。這些操作根據(jù)附著于該試劑盒中的方法完成。通過應用這樣制備的連接到銜接子上的cDNA，根據(jù)上述相同的方式用示于下表5中的引物進行PCR。根據(jù)附于Clontech Marathon試劑盒中的方法分析該基因末端區(qū)域中的核苷酸序列。結(jié)果，測定了SEQ ID NO:2的核苷酸序列表44-5-F引物cgatggatgg giaaittiat icaiccigai tgggaiatgt t 41聚體4-6-RV引物ggccacatit tiacia(ag)icc iatiggigci aa 32聚體表55-SC-2:tgttactagg cgaaacaaga gtagctctga30聚體實施例3藜科植物cDNA的制備將大約2g甜菜(Beta vulgaris:haming)葉子凍于液氮中且然后用研體研磨，向其中加入20ml Isogen(Nippon Gene)，并將該混合物進一步徹底研磨。將研磨過的材料轉(zhuǎn)移到離心管中，向其中加入4ml氯仿，并以渦輪混合器攪拌混合物且然后以6,500xg于4℃離心10分鐘。收集水層，向其中加入10ml異丙醇，并且攪拌該混合物且然后以6,500g于4℃離心10分鐘。以10ml70％的乙醇洗得到的沉淀物且然后溶解于1 80μl DEPC處理的無菌水。讓該溶液于55℃靜置5分鐘并向其中加入20μl 5M NaCl。用BIOMAG mRNA純化試劑盒(PerSeptiveBiosystems目錄號8-MB4003K)純化得到的溶液。
向得到的mRNA溶液中加入3M乙酸鈉和乙醇，并沉淀和收集RNA。收集到的RNA用70％乙醇洗2次且然后溶解于20μl無菌水中，用于后面的cDNA合成。通過測定260nm處的吸收測定獲得RNA的量。
為了cDNA合成，應用SMART PCR cDNA合成試劑盒(Clontech)，并且所有的操作根據(jù)附于試劑盒中的方法完成。
實施例4藜科植物棉子糖合酶基因核苷酸序列的分析合成具有示于下表6中核苷酸序列的合成DNA引物。PCR方法用Clontech的Advantage KlenTaq cDNA試劑盒以珀金-埃爾默公司的Gene Amp PCR系統(tǒng)2400和DNA熱循儀480型完成。用上述引物和在上面實施例3中獲得甜菜cDNA通過重復維持于94℃1分鐘、50℃3分鐘且然后于72℃3分鐘40個循環(huán)而進行PCR。結(jié)果，聯(lián)合應用引物6-3-F和6-8-RV與引物6-10-F和6-6-RV分別擴增出大約0.3kb和0.6kb的帶。用TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆此擴增出的DNA片段，然后用珀金-埃爾默公司的ABI PRISM DyeTerminator Cycle測序即用試劑盒進行測序反應并以ABI的373S DNA測序儀分析核苷酸序列。根據(jù)得到的核苷酸序列，制備具有示于下表7中核苷酸序列的合成DNA引物并且以上述相同的方式用實施例3中從甜菜獲得的cDNA進行PCR。結(jié)果，最終從甜菜cDNA中獲得具有SEQ IDNO:4核苷酸序列的DNA。
表66-3-Fcgaggiggit gicciccigg ittigtiati atigaigaig gitggca 47聚體6-8-RVat(t/c)tt(a/g)tcia cigcia(a/g)(a/g)tc (t/c)tccatigt 29聚體6-10-Fggiacitait gg(c/t)ticaigg itgicaiatg gticaitg 38聚體6-6-RVggccacatit tiacia(a/g)icc iatiggigci aa 32聚體表77-Sb-1atctatttgt catgacgatg atccga26聚體7-Sb-2RVggccctcatt cccatattgg gatgatcctc30聚體7-Sb-3RVaagcatgcca aacatacaca tgctcaacag30聚體7-Sb-4RVagacccgggg aaagctttgg ggttactact30聚體7-Sb-5tggatgggaa actttataca ccctgact 28聚體7-Sb-6gacatgttcc catctacaca cccttgtg 28聚體7-Sb-7ccaatttatg ttagtgatgt tgttggcaag30聚體7-Sb-8RVtcgactccca gggtagaatt gtcatc26聚體實施例5十字花科植物cDNA的制備將大約2g芥菜(Brassica juncea)葉子凍于液氮中且然后用研體研磨，向其中加入20ml Isogen(Nippon Gene)，并將混合物進一步徹底研磨。將磨碎的材料轉(zhuǎn)移至離心管中，向其中加入4ml氯仿，并且用旋渦振蕩混合器攪拌該混合物且然后以6,500xg于4℃離心10分鐘。收集水層，向其中加入10ml異丙醇，并且攪拌混合物且然后以6,500xg于4℃離心10分鐘。以10ml70％的乙醇洗得到的沉淀物且然后溶解于1 80μl DEPE-處理過的無菌水中，讓該溶液于55℃靜置5分鐘并且向其中加入10μl 5M的NaCl。用BIOMAG mRNA純化試劑盒(PerSeptive Biosystems目錄號8-MB4003K)純化得到的溶液。
向得到的mRNA溶液中加入3M乙酸鈉和乙醇，并沉淀和收集RNA。以70％的乙醇洗收集到的RNA2次且然后溶解于20μl無菌水中，用于后面的cDNA合成。通過測定260nm處的吸收測定獲得RNA的量。
為了cDNA合成，應用SMART PCR cDNA合成試劑盒(Clontech)，并且所有的操作根據(jù)附于該試劑盒的方法完成。
從上述相同的方式，從未成熟油菜Westar(Brassica napus)的種子純化mRNA并合成cDNA。
實施例6十字花科植物棉子糖合酶基因的分離及核苷酸序列分析合成具有示于下表8中核苷酸序列的DNA引物。用Clontech的Advantage KlenTaq cDNA試劑盒從珀金-埃爾默公司的Gene AmpPCR Systems2400和DNA熱循環(huán)儀480型進行PCR。用上述引物和在實施例5中獲得的芥菜cDNA通過重復維持于94℃1分鐘，50℃3分鐘且然后于72℃3分鐘40個循環(huán)而完成PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳分析此反應產(chǎn)物。結(jié)果，檢測到大約1.2kb條帶的擴增。用TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆此擴增出的DNA片段，然后用珀金-埃爾默公司的ABI PRISM Dye Terminator Cycle測序即用反應試劑盒進行測序反應并且用ABI的373 S DNA測序儀進行核苷酸序列分析。根據(jù)得到的核苷酸序列，制備具有示于下表9中核苷酸序列的合成引物并且用在實施例5中獲得的芥菜(Brassica juncea)歐洲油菜Westar(Brassicanapus)的cDNA根據(jù)上述相同的方式進行PCR。結(jié)果，最終分別從芥菜(Brassica juncea)和歐洲油菜Westar(Brassica napus)的cDNA中檢測到由SEQ ID NO:6的第749個到第1215個核苷酸所表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO:8的1位到467位核苷酸所表示的核苷酸序列。
表88-#1cgattiaaig titggtggac iacicaitgg gtigg 35聚體8-#l0RVcaitgiacca titgicaicc itgia(ag)ccai taigticc38聚體表99-引物-1gttagggttc atatgaacac cttcaagctc30聚體9-引物-2RVcaacggcgag atcttgcatc gtcaac26聚體實施例7十字花科植物棉子糖合酶全長基因核苷酸序列的分析根據(jù)在實施例6中獲得的核苷酸序列，合成具有示于下表10中核苷酸序列的DNA引物。將與實施例5中所述相同方式獲得的芥菜(Brassicajuncea)和歐洲油菜Westar(Brassica napus)的cDNA連接到Clontech的Marathon試劑盒中帶有的銜接子上，通過應用這樣制得的連接上銜接子的cDNA以示于表10中的引物進行PCR。10-B-2RV、10-B-3RV和10-B-4RV引物用于5′-末端的核苷酸分析，并且10-B-1、10-B-8、10-B-7和10-B-6引物用于3′-末端的核苷酸分析。根據(jù)附于Clontech Marathon試劑盒的方法分析此核苷酸序列。結(jié)果，分別從芥菜(Brassica juncea)和歐洲油菜Westar(Brassica napus)中檢測到SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
表1010-B-2RVggattcgaca caaaccgcca cgtcatcgtc 30聚體10-B-3RVccacgtgcac cacccgaact tatcgac 27聚體10-B-4RVaacatcgata ccatcggagt catgtccaat 30聚體10-B-1gttagggttc atatgaacac cttcaagctc 30聚體10-B-8tctacgtctg gcacgcgctt tgcggctac 29聚體10-B-7gttgacgtca tccacatatt ggagatgttg t31聚體10-B-6gttatcgcta gcatggagca ctgtaatga 29聚體實施例8用于十字花科植物棉子糖合酶基因的植物表達載體的構(gòu)建根據(jù)在實施例7中獲得的芥菜棉子糖合酶基因的核苷酸序列，制備具有示于表11中核苷酸序列的DNA引物。通過應用芥菜的cDNA，以與實施例6中相同的方式進行PCR。以SacI消化該擴增出的DNA片段。通過用連接試劑盒(Takara)將這樣消化過的DNA片段連接到預先以SacI消化的載體pBI121(-)中。用BamHI和SacI消化質(zhì)粒pBI121(Clontech)，并連接到示于表12中的接頭(Ginker)上以制備載體pBI121(-)。通過限制性圖譜和用具有示于表13中核苷酸序列的引物的PCR分析這樣獲得的載體，并且確證插入的棉子糖合酶基因的方向。將其中的芥菜棉子糖合酶基因從可表達的方向插入的載體命名為BjRS-Sac(+)-121并將其中的芥菜棉子糖合酶基因以相反方向插入的載體命名為BjRS-Sac(-)-121。
表1111-SacI-BjNaacgagctca atccaaaatc tcatcaaata atcgc 35聚體11-SacI-BjintRVacaatagttg agggcggaag agtag 25聚體表1212-BamSac-(+)接頭gatcgagctc gtgtcggatc cagct 25聚體12-BamSac-(-)接頭ggatccgaca cgagctc 17聚體表1313-35S-3cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg 30聚體13-B-2RVggattcgaca caaaccgcca cgtcatcgtc 30聚體13-B-8tctacgtctg gcacgcgctt tgcggctac 29聚體實施例9用十字花科植物棉子糖合酶基因的轉(zhuǎn)化將實施例8中制備的載體BjRS-Sac(+)-121和BiRS-Sac(-)-121通過農(nóng)桿菌感染方法用于芥菜(Brassica juncia)的轉(zhuǎn)化。分別用在實施例8中制備的二種質(zhì)粒BjRS-Sac(+)-121和BjRS-Sac(-)-121轉(zhuǎn)化預先用氯化鈣處理而轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺軕B(tài)的根癌農(nóng)桿菌(具有利福平和鏈霉素抗性的菌株LBA4404)。通過利用由導入質(zhì)?？敲顾乜剐曰?新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，NPTII)賦予的卡那霉素抗性特征在含有50μg/ml利福平和25μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。
將獲得的轉(zhuǎn)化子農(nóng)桿菌(根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株具有利福平和鏈霉素抗性)于28℃培養(yǎng)于含有50μg/ml利福平和25μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中完整的一天一夜，并通過下述方法將該培養(yǎng)物用于轉(zhuǎn)化芥菜。
將芥菜的種子無菌種植于含有2％蔗糖和0.7％瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基。一周后，以解剖刀切下發(fā)芽植物的子葉和葉柄，并且轉(zhuǎn)移至含有3％蔗糖、0.7％瓊脂、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D和3.3μM AgNO3的MS培養(yǎng)基中，然后預培養(yǎng)1天。將預培養(yǎng)的子葉和葉柄轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌培養(yǎng)基的100倍稀釋液中并使其靜置5分鐘。再次將子葉和葉柄轉(zhuǎn)移至與預培養(yǎng)中所用相同的培養(yǎng)基中。并培養(yǎng)3到4天。將培養(yǎng)出的子葉和葉柄轉(zhuǎn)移至含有3％蔗糖、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、3,3μMAgNO3和500m/l頭孢噻肟的MS培養(yǎng)基中，且然后振蕩1天以去除微生物細胞。將這樣處理過的子葉和葉柄轉(zhuǎn)移到含有3％蔗糖、0.7％瓊脂、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、3,3μM AgNO3、100mg/l頭孢噻肟和20mg/l卡那霉素的MS培養(yǎng)基中，并且培養(yǎng)。通過以3到4周的間隔傳代培養(yǎng)而持續(xù)在該培養(yǎng)基上的培養(yǎng)。當嫩枝開始再生時，將這些嫩枝傳代培養(yǎng)于含有3％蔗糖、0.7％瓊脂和20mg/l卡那霉素的MS培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)3到4周。將生根的植物轉(zhuǎn)移到蛭石泥炭蘚=1∶1，并且從白天/晚上=12小時12小時的循環(huán)于21℃到22℃培養(yǎng)。隨著植物體生長的進行，將這些植物種植于培養(yǎng)土壤中。
序列簡述SEQ ID NO:1顯示了由本發(fā)明棉子糖合酶基因所編碼的棉子糖合酶蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2顯示了本發(fā)明棉子糖合酶基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3顯示了由從甜菜中獲得棉子糖合酶基因所編碼的棉子糖合酶蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4顯示了從甜菜中獲得棉子糖合酶基因的cDNA核苷酸序列。
SEQ ID NO:5顯示了由從芥菜中獲得棉子糖合酶基因所編碼棉子糖合酶蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6顯示了從芥菜中獲得棉子糖合酶基因的cDNA核苷酸序列。
SEQ ID NO:7顯示了由從油菜中獲得棉子糖合酶基因所編碼棉子糖合酶蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8顯示了從油菜中獲得棉子糖合酶基因的cDNA核苷酸序列。
表1顯示于表1中的核苷酸序列為用于擴增具有棉子糖合酶基因DNA片段中典型引物的實例。所有這些序列依據(jù)SEQ ID NO:2的核苷酸序列。引物11為有義引物且引物12為反義引物。根據(jù)目的，適當?shù)南拗菩悦缸R別序列可被添加到這些核苷酸序列的5′-末端。
表2顯示于表2中的核苷酸序列為用于擴增棉子糖合酶基因cDNA中典型引物的實例。引物21為相應于甜菜來源的棉子糖合酶合酶基因的5′-端的有義引物。引物22為相應于3′-端的反義引物。根據(jù)目的，適當限制性酶的識別序列可添加到這些核苷酸序列的5′-端。
引物23為相應于開放閱讀框N-端的有義引物，且引物24為相應于C-端的反義引物。
表3在表3中所顯示的核苷酸序列中，引物31和32為用于擴增具有棉子糖合酶基因部分核苷酸序列的DNA中的典型引物。引物31為用于擴增具有來自芥菜和油菜棉子糖合酶基因部分核苷酸序列的DNA中的正義引物并且引物32為反義引物。根據(jù)目的，適當限制性酶的識別序列可添加到這些核苷酸序列的5′-端。
引物33和34為用于擴增芥菜棉子糖合酶基因cDNA中的典型引物。引物33和34均依據(jù)非翻譯區(qū)中棉子糖合酶基因的核苷酸序列。引物33為相應于來源于芥菜的棉子糖合酶基因5′-端非翻譯區(qū)的有義引物。引物34為相應于3′-端非翻譯區(qū)的反光引物。
引物35和36為用于擴增在棉子糖合酶基因cDNA中編碼棉子糖合酶蛋白氨基酸序列開放閱讀框中的典型引物。引物35為相應于上面開放閱讀框5′-端的有義引物。引物36為相應于3′-端的反義引物。根據(jù)目的，適當限制酶的識別序列可添加到這些核苷酸序列的5′-端。
表4顯示于表4中核苷酸序列為用于克隆具有本發(fā)明棉子糖合酶基因DNA片段中的引物。由符號“i”表示的堿基為肌苷。顯示于括號中的堿基意為這些堿基的混合物用于合成中。引物號后所用的符號“RV”意為由該符號所指的引物具有反義序列。
表5顯示于表5中的核苷酸序列為用于分析本發(fā)明棉子糖合酶基因核苷酸序列中的引物。5-SC-2用于分析3′-端區(qū)域中本發(fā)明的核苷酸序列。
表6顯示于表6中的核苷酸序列為用于分析本發(fā)明甜菜棉子糖合酶基因中的引物。由符號“i”所表示的堿基“i”為肌苷。顯示于括號中的堿基意為這些堿基的混合物用于合成中。引物號后所用的符號“RV”意為由該符號所指的引物具有反義序列。
表7顯示于表7中的核苷酸序列為根據(jù)甜菜棉子糖合酶基因部分核苷酸序列而合成的引物。引物號后所用的符號“RV”意為由該符號所指的引物具有反義序列。
表8顯示于表8中的核苷酸序列為用于分析芥菜棉子糖合酶基因cDNA核苷酸序列中的引物。由符號“i”所表示的堿基為肌苷。顯示于括號中的堿基意為這些堿基的混合物。引物號后所用的符號“RV”意為由該符號所指的引物具有反義序列。
表9顯示于表9中的核苷酸序列為根據(jù)芥菜棉子糖合酶基因部分核苷酸序列而合成的引物。引物號后所用的符號“RV”意為由該符號所指的引物具有反義序列。
表10顯示于表10中的核苷酸序列為用于分析芥菜和油菜棉子糖合酶基因核苷酸序列中的引物。引物號后所用的符號“RV”意為由該符號所指的引物具有反義序列。
表11顯示于表11中的核苷酸序列為用于擴增芥菜棉子糖合酶基因5′端區(qū)域中的引物，11-SacI-BjN為其中的SacI限制性位點添加到由SEQID NO:6中4位到第29位核苷酸所表示核苷酸序列上的引物。11-SacI-Bjint RV為具有相應于由SEQ ID NO:6中第1164個到1188個核苷酸所表示核苷酸序列的核苷酸序列的反義引物。
表12顯示于表12中的核苷酸序列為添加到芥菜cDNA上的銜接子。當混合到一起時這些合成DNA采取雙鏈的形式因為它們是互補的鏈。該銜接子兩個末端均具有用于限制酶BamHI和SacI切割位點的粘性末端，并且在雙鏈區(qū)域中含有用于限制酶BamHI和SacI的限制性位點。
表13顯示于表13中的核苷酸序列為用于確證來源于芥菜棉子糖合酶基因插入方向中的引物。13-35S-3為相應于35S啟動子的引物。13-B-2RV為具有由SEQ ID NO:6第593個到第622個核苷酸所表示核苷酸序列的反義引物，13-B-8為具有由SEQ ID NO:6中第1110位到1138位核苷酸所表示核苷酸序列的有義引物。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明，提供可用于改變棉子糖合酶在植物中表達水平和活性技術(shù)中的棉子糖合酶基因是可能的。
無文本序列表SEQ ID NO:9到SEQ ID NO:20為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物，n為i,r是a或g。
SEQ ID NO:23為獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:24到SEQ ID NO:27為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物，n為i,y為t或c,r是a或g。
SEQ ID NO:28到SEQ ID NO:35為了獲得棉子糖合酶設計的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37為了獲得棉子糖合酶而設計的寡核苷酸引物，n為i,r是a或g。
SEQ ID NO:38到SEQ ID NO:48為了獲得棉子糖合酶而設計的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50為了獲得棉子糖合酶而設計的寡核苷酸接頭。
SEQ ID NO:51到SEQ ID NO:53為了確認插入的棉子糖合酶基因的方向而設計的寡核苷酸引物。
序列表<110>Eijiro WATANABE等.；住友化學工業(yè)株式會社<120>棉子糖合酶基因及其應用<150>JP10/120550<151>1998-04-30<150>JP10/120551<151>1998-04-30<150>JP10/345590<151>1998-12-04<150>JP10/351246<151>1998-12-10<160>53<210>1<211>265<212>PRT<213>大豆<400>1Gln Ser Asp His Ala Cys Ala Glu Phe His Ala Ala Ser Arg Ala Ile5 10 15Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp Ser Val Gly Lys His Asn Phe20 25 30Lys Leu Leu Lys Lys Leu Val Leu Pro Asp Gly Ser Ile Leu Arg Cys35 40 45Gln His Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Cys Leu Phe Val Asp Pro Leu50 55 60His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn Leu Asn Lys Cys Ser65 70 75 80Gly Val Leu Gly Leu Phe Asn Cys Gln Gly Gly Gly Trp Cys Pro Val
85 90 95Thr Arg Arg Asn Lys Ser Ser Ser Asp Tyr Ser His Ser Val Thr Cys100 105 110Phe Ala Ser Pro Gln Asp Ile Glu Trp Gly Lys Gly Lys His Pro Val115 120 125Cys Ile Lys Gly Val Asp Val Phe Ala Val Tyr Met Phe Lys Asp Asp130 135 140Lys Leu Lys Leu Leu Lys Tyr Thr Glu Ser Val Glu Val Ser Leu Glu145 150 155 160Pro Phe Ser Cys Glu Leu Leu Thr Val Ser Pro Val Val Ile Leu Pro165 170 175Arg Lys Ser Ile Gln Phe Ala Pro Ile Gly Leu Val Asn Met Leu Asn180 185 190Ser Gly Gly Ser Ile Met Ser Leu Glu Phe Asp Gln Gln Glu Asn Leu195 200 205Ala Arg Ile Gly Val Arg Gly His Gly Glu Met Arg Val Phe Ala Ser210 215 220Glu Lys Pro Glu Ser Val Lys Ile Asp Gly Glu Ser Val Glu Phe Asp225 230 235 240Tyr Val Asp Arg Thr Val Arg Leu Gln Val Ser Trp Pro Cys Ser Ser245 250 255Arg Leu Ser Val Val Glu Tyr Leu Phe260 265<210>2<211>928<212>DNA<213>大豆<220><221>CDS<222>(2)…(799)<400>2c caa tct gat cat gct tgt gcc gaa ttc cac gct gct tct aga gcc 46Gln Ser Asp His Ala Cys Ala Glu Phe His Ala Ala Ser Arg Ala5 10 15att tct ggt gga cca att tat gta agc gac tct gtt gga aaa cac aac 94Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp Ser Val Gly Lys His Asn
20 25 30ttc aag ttg ctt aag aag ctt gtt cta cct gat ggc tcc att ttg cgg142Phe Lys Leu Leu Lys Lys Leu Val Leu Pro Asp Gly Ser Ile Leu Arg35 40 45tgt caa cat tat gca ctt ccc acc cga gac tgc tta ttt gta gat cct190Cys Gln His Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Cys Leu Phe Val Asp Pro50 55 60tta cat gat ggg aaa aca atg ctc aaa att tgg aac ctc aat aaa tgt238Leu His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn Leu Asn Lys Cys65 70 75tcc ggg gtt ttg ggt ctg ttc aat tgc caa gga gga ggt tgg tgc cct286Ser Gly Val Leu Gly Leu Phe Asn Cys Gln Gly Gly Gly Trp Cys Pro80 85 90 95gtt act agg cga aac aag agt agc tct gac tat tca cac tcc gtg act334Val Thr Arg Arg Asn Lys Ser Ser Ser Asp Tyr Ser His Ser Val Thr100 105 110tgc ttt gca agt cct caa gac att gaa tgg ggc aaa ggg aag cac cca382Cys Phe Ala Ser Pro Gln Asp Ile Glu Trp Gly Lys Gly Lys His Pro115 12 125gtt tgc atc aaa ggg gtg gac gta ttt gct gtg tac atg ttt aag gac430Val Cys Ile Lys Gly Val Asp Val Phe Ala Val Tyr Met Phe Lys Asp130 135 140gac aag ttg aag ctg ctg aag tac aca gag agt gta gaa gtt tct ctt478Asp Lys Leu Lys Leu Leu Lys Tyr Thr Glu Ser Val Glu Val Ser Leu145 150 155gag cct ttt agt tgt gag ctt ttg acc gtt tct cca gtg gtg atc tta526Glu Pro Phe Ser Cys Glu Leu Leu Thr Val Ser Pro Val Val Ile Leu160 165 170 175ccc aga aaa tca atc caa ttt gcc cca att gga ttg gta aac atg ctc574Pro Arg Lys Ser Ile Gln Phe Ala Pro Ile Gly Leu Val Asn Met Leu180 185 190aac tct ggg ggc tct att atg tca ttg gaa ttt gat caa cag gaa aat622Asn Ser Gly Gly Ser Ile Met Ser Leu Glu Phe Asp Gln Gln Glu Asn195 200 205ttg gcg agg att ggg gtg aga gga cat ggg gaa atg agg gta ttt gca670Leu Ala Arg Ile Gly Val Arg Gly His Gly Glu Met Arg Val Phe Ala210 215 220tca gag aag cca gag agt gtc aag att gat gga gaa tct gtg gaa ttt718Ser Glu Lys Pro Glu Ser Val Lys Ile Asp Gly Glu Ser Val Glu Phe
225 230 235gat tat gtt gat aga acc gtg agg ctc caa gtc tcg tgg cct tgt tct766Asp Tyr Val Asp Arg Thr Val Arg Leu Gln Val Ser Trp Pro Cys Ser240 245 250 255tcg agg ttg tcc gta gtc gag tat ttg ttc tga atcatgattt ggtgtccgag 819Ser Arg Leu Ser Val Val Glu Tyr Leu Phe260 265agagccgtgt aatgttcaca taaactgact taagtgcatt aagcaaatcc accttaaata 879atagtgcata actttgttcc aaaaaaaaaa agaaaaaaaa aaaaaaaaa 928<210>3<211>783<212>PRT<213>甜菜<400>3Met Ala Pro Ser Phe Ser Lys Glu Asn Ser Lys Thr Cys Asp Glu Val5 10 15Ala Asn His Asp Asp Cys Asn Thr Cys Pro Ile Ile Ser Leu Glu Glu20 25 30Ser Asn Phe Met Val Asn Gly His Val Ile Leu Ser Gln Val Pro Ser35 40 45Asn Ile Thr Ala Ile Ser Lys Met Gly Phe Asp Gly Leu Phe Val Gly50 55 60Phe Asp Ala Pro Glu Pro Lys Ala Arg His Val Val Ser Val Gly Gln65 70 75 80Leu Lys Gly Ile Pro Phe Met Ser Ile Phe Arg Phe Lys Val Trp Trp85 90 95Thr Thr His Trp Thr Gly Ser Asn Gly Arg Asp Leu Glu His Glu Thr100 105 110Gln Ile Leu lle Leu Asp Lys Ser Asp Glu Gly Leu Gly Arg Pro Tyr115 120 125Ile Val Ile Leu Pro Leu Ile Glu Gly Pro Phe Arg Ala Ser Leu Gln130 135 140Pro Gly Ser Val Asp Asp Tyr Val Asp Ile Cys Val Glu Ser Gly Ser145 150 155160Thr Lys Val Val Gly Asp Ser Phe Arg Ala Val Leu Tyr Ile Arg Ala165 170 175Gly Pro Asp Pro Phe Lys Leu Ile Lys Asp Thr Met Lys Glu Val Gln
180 185 190Ala His Leu Gly Thr Phe Lys Leu Leu Asp Asp Lys Thr Pro Pro Gly195 200 205Ile Val Asp Lys Phe Gly Trp Cys Thr Trp Asp Ala Phe Tyr Leu Lys210 215 220Val Glu Pro Tyr Gly Val Trp Glu Gly Val Lys Gly Leu Val Glu Asn225 230 235 240Gly Val Pro Pro Gly Leu Val Leu Ile Asp Asp Gly Trp Gln Ser Ile245 250 255Cys His Asp Asp Asp Pro Ile Thr Asp Gln Glu Gly Ile Asn Arg Thr260 265 270Ser Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg Leu Ile Lys Tyr Glu Glu Asn275 280 285Phe Lys Phe Arg Asp Tyr Lys Ser Pro Asn Ile Met Gly His Glu Asp290 295 300His Pro Asn Met Gly Met Arg Ala Phe Val Arg Asp Leu Lys Glu Glu305 310 315 320Phe Lys Thr Val Glu His Val Tyr Val Trp His Ala Phe Thr Gly Tyr325 330 335Trp Gly Gly Val Arg Pro Asn Val Pro Gly Leu Pro Glu Ala Gln Val340 345 350Val Thr Pro Lys Leu Ser Pro Gly Leu Glu Met Thr Met Glu Asp Leu355 360 365Ala Val Asp Lys Ile Val Asn Asn Gly Ile Gly Leu Val Gln Pro Asp370 375 380Lys Ala Gln Glu Leu Tyr Glu Gly Leu His Ser His Leu Glu Asn Cys385 390 395 400Gly Ile Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Leu Leu Glu Met Met405 410 415Ala Glu Asp Tyr Gly Gly Arg Val Glu Leu Ala Lys Thr Tyr Tyr Lys420 425 430Ala Ile Thr Glu Ser Val Arg Lys His Phe Lys Gly Asn Gly VaL Ile435 440 445Ala Ser Met Glu Gln Cys Asn Asp Phe Met Leu Leu Gly Thr Glu Thr450 455 460Ile Cys Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Pro Thr Asp Pro Ser465 470 475 480Gly Asp Ile Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His Met Val His485 490 495Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile His Pro Asp Trp500 505 510Asp Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His Ala Ala Ser515 520 525Arg Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp Val Val Gly Lys530 535 540His Asn Ile Pro Leu Leu Lys Arg Leu Val Leu Ala Asp Gly Ser Ile545 550 555 560Leu Arg Cys Glu Tyr His Ala Leu Pro Thr Lys Asp Cys Leu Phe Val565 570 575Asp Pro Leu His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn Leu Asn580 585 590Lys Tyr Asn Gly Val Leu Gly Val Phe Asn Cys Gln Gly Gly Gly Trp595 600 605Ser Arg Glu Ser Arg Lys Asn Leu Cys Phe Ser Glu Tyr Ser Lys Pro610 615 620Ile Ser Cys Lys Thr Ser Pro Lys Asp Val Glu Trp Glu Asn Gly His625 630 635 640Lys Pro Phe Pro Ile Lys Gly Val Glu Cys Phe Ala Met Tyr Phe Thr645 650 655Lys Glu Lys Lys Leu Ile Leu Ser Gln Leu Ser Asp Thr Ile Glu Ile660 665 670Ser Leu Asp Pro Phe Asp Tyr Glu Leu Ile Val Val Ser Pro Met Thr675 680 685Ile Leu Pro Trp Glu Ser Ile Ala Phe Ala Pro Ile Gly Leu Val Asn690 695 700Met Leu Asn Ala Gly Gly Ala Val Lys Ser Leu Asp Ile Ser Glu Asp705 710 715 720Asn Glu Asp Lys Met Val Gln Val Gly Ile Lys Gly Ala Gly Glu Met725 730 735Met Val Tyr Ser Ser Glu Lys Pro Lys Ala Cys Arg Val Asn Gly Glu740 745 750Asp Met Glu Phe Glu Tyr Glu Glu Ser Met Ile Lys Val Gln Val Thr755 760 765Trp Asn His Asn Ser Gly Gly Phe Thr Thr Val Glu Tyr Leu Phe770 775 780 783<210>4<211>2690<212>DNA<213>甜菜<220><221>CDS<222>(236)…(2587)<400>4ctaccaaatt ccacaactta aagttcacct caatctttat tccatttttc ctccctaaac 60ttcattgtta agattttgta attgaattca aattcttaat tctgaatttt gtcatttttt120ttgtggggat atttataact atcatattat ttgtgtagat cattctacaa aaaagagagt180gagttttttt agctcttatt tcctaagaaa ttaatagcaa aagttttgca taact atg 238Metgct cca agc ttt agc aag gaa aat tcc aag acg tgt gat gag gtt gca 286Ala Pro Ser Phe Ser Lys Glu Asn Ser Lys Thr Cys Asp Glu Val Ala5 10 15aac cat gat gat tgc aac acg tgt cca ata att tcc ttg gaa gaa tca 334Asn His Asp Asp Cys Asn Thr Cys Pro Ile Ile Ser Leu Glu Glu Ser20 25 30aac ttc atg gtg aat ggt cac gtg ata ttg tcc caa gtt cca tcc aac 382Asn Phe Met Val Asn Gly His Val Ile Leu Ser Gln Val Pro Ser Asn35 40 45atc acg gcc att agt aaa atg ggt ttt gat ggg ctt ttt gtg ggt ttt 430Ile Thr Ala Ile Ser Lys Met Gly Phe Asp Gly Leu Phe Val Gly Phe50 55 60 65gat gct cca gag ccc aag gcc cgg cac gtt gta tcc gtg ggc cag ctc 478Asp Ala Pro Glu Pro Lys Ala Arg His Val Val Ser Val Gly Gln Leu70 75 80aag gga att ccc ttc atg agt atc ttc agg ttc aag gta tgg tgg act 526Lys Gly Ile Pro Phe Met Ser Ile Phe Arg Phe Lys Val Trp Trp Thr85 90 95acc cat tgg act ggg tcc aat ggg cgg gac ctt gag cat gag acc caa 574Thr His Trp Thr Gly Ser Asn Gly Arg Asp Leu Glu His Glu Thr Gln100 105 110att ctc atc ctt gat aag tca gat gaa ggt ttg ggc cgt ccc tat att 622Ile Leu Ile Leu Asp Lys Ser Asp Glu Gly Leu Gly Arg Pro Tyr Ile115 120 125gtg atc ctc cca ttg atc gaa ggc cca ttt cgg gca tct ctc cag ccg 670Val Ile Leu Pro Leu Ile Glu Gly Pro Phe Arg Ala Ser Leu Gln Pro130 135 140 145ggt tct gtt gat gac tat gtg gat ata tgt gtt gag agt ggg tcc act 718Gly Ser Val Asp Asp Tyr Val Asp Ile Cys Val Glu Ser Gly Ser Thr150 155 160aaa gtt gtc gga gac tcg ttc cgg gct gtt ctt tat ata cgg gct ggg 766Lys Val Val Gly Asp Ser Phe Arg Ala Val Leu Tyr Ile Ara Ala Gly165 170 175cct gac cca ttt aag tta att aaa gat aca atg aag gaa gtc caa gcc 814Pro Asp Pro Phe Lys Leu Ile Lys Asp Thr Met Lys Glu Val Gln Ala180 185 190cat tta ggg act ttc aaa ctc tta gat gac aaa act cct cca gga ata 862His Leu Gly Thr Phe Lys Leu Leu Asp Asp Lys Thr Pro Pro Gly Ile195 200 205gtg gac aag ttt gga tgg tgt aca tgg gat gca ttt tac ctc aaa gta 910Val Asp Lys Phe Gly Trp Cys Thr Trp Asp Ala Phe Tyr Leu Lys Val210 215 220 225gag ccw tat ggt gtt tgg gaa gga gtt aaa gga ctc gtc gaa aac ggg 958Glu Pro Tyr Gly Val Trp Glu Gly Val Lys Gly Leu Val Glu Asn Gly230 235 240gtc cca ccc ggt ctc gta ctc att gat gat ggg tgg caa tct att tgt 1006Val Pro Pro Gly Leu Val Leu Ile Asp Asp Gly Trp Gln Ser Ile Cys245 250 255cat gac gat gat ccg att acc gac caa gaa ggg ata aac cgg act tct 1054His Asp Asp Asp Pro Ile Thr Asp Gln Glu Gly Ile Asn Arg Thr Ser260 265 270gcc ggc gag caa atg cca tgt aga ttg atc aag tac gag gaa aac ttc 1102Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg Leu Ile Lys Tyr Glu Glu Asn Phe275 280 285aag ttt agg gac tat aaa agc cca aat att atg ggc cat gag gat cat 1150Lys Phe Arg Asp Tyr Lys Ser Pro Asn Ile Met Gly His Glu Asp His290 295 300 305ccc aat atg gga atg agg gcc ttt gtt agg gac ctt aag gag gag ttc 1198Pro Asn Met Gly Met Arg Ala Phe Val Arg Asp Leu Lys Glu Glu Phe310 315 320aaa act gtt gag cat gtg tat gtt tgg cat gct ttt acg ggc tat tgg 1246Lys Thr Val Glu His Val Tyr Val Trp His Ala Phe Thr Gly Tyr Trp325 330335gga ggg gta agg ccc aat gtt cca ggc cta ccr gag gcc caa gta gta 1294Gly Gly Val Arg Pro Asn Val Pro Gly Leu Pro Glu Ala Gln Val Val
340 345 350acc cca aag ctt tcc ccg ggt ctt gag atg aca atg gaa gat cta gct 1342Thr Pro Lys Leu Ser Pro Gly Leu Glu Met Thr Met Glu Asp Leu Ala355 360 365gtg gat aaa att gtt aat aat ggt att ggg ctt gtc cag cct gat aag 1390Val Asp Lys Ile Val Asn Asn Gly Ile Gly Leu Val Gln Pro Asp Lys370 375 380 385gcc caa gaa ctt tat gaa ggg ttg cat tct cat ttg gaa aat tgt ggg 1438Ala Gln Glu Leu Tyr Glu Gly Leu His Ser His Leu Glu Asn Cys Gly390 395 400att gat gga gtc aaa gtt gat gtc atc cat ttg ttg gag atg atg gca 1486Ile Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Leu Leu Glu Met Met Ala405 410 415gag gac tat gga gga aga gtt gaa cta gca aaa aca tac tat aag gca 1534Glu Asp Tyr Gly Gly Arg Val Glu Leu Ala Lys Thr Tyr Tyr Lys Ala420 425 430ata aca gaa tca gtg cgt aag cat ttc aaa ggc aac ggt gtg att gct 1582Ile Thr Glu Ser Val Arg Lys His Phe Lys Gly Asn Gly Val Ile Ala435 440 445agc atg gag cag tgc aac gat ttc atg ctc ctt ggt act gag acc att 1630Ser Met Glu Gln Cys Asn Asp Phe Met Leu Leu Gly Thr Glu Thr Ile450 455 460 465tgt ctt ggt cgc gtt ggg gat gac ttt tgg cca act gat ccg tct gga 1678Cys Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Pro Thr Asp Pro Ser Gly470 475 480gat ata aat ggt aca tat tgg ctc caa ggc tgt cat atg gtg cat tgt 1726Asp Ile Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His Met Val His Cys485 490 495gcc tac aat agc tta tgg atg gga aac ttt ata cac cct gac tgg gac 1774Ala Tyr Asn Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile His Pro Asp Trp Asp500 505 510atg ttc caa tct aca cac cct tgt gct gaa ttt cat gct gca tct cgt 1822Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His Ala Ala Ser Arg515 520 525gcg att tct ggt gga cca att tat gtt agt gat gtt gtt ggc aag cat 1870Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp Val Val Gly Lys His530 535 540 545aac atc ccc ttg ctc aaa agg ctc gtc ttg gct gat ggt tcg atc ctt 1918Asn Ile Pro Leu Leu Lys Arg Leu Val Leu Ala Asp Gly Ser Ile Leu
550 555 560cgt tgc gag tac cat gca ctt cct act aag gat tgc cta ttt gta gat 1966Arg Cys Glu Tyr His Ala Leu Pro Thr Lys Asp Cys Leu Phe Val Asp565 570 575cct ttg cac gat ggc aaa aca atg ctc aaa att tgg aac ctc aac aag 2014Pro Leu His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn Leu Asn Lys580 585 590tac aat gga gtg ctt gga gtc ttc aat tgc caa gga gga ggg tgg agc 2062Tyr Asn Gly Val Leu Gly Val Phe Asn Cys Gln Gly Gly Gly Trp Ser595 600 605cgt gag tct cga aaa aat cta tgt ttc tca gag tat tca aaa cct att 2110Arg Glu Ser Arg Lys Asn Leu Cys Phe Ser Glu Tyr Ser Lys Pro Ile610 615 620 625tcc tgc aag aca agt cca aaa gat gtt gaa tgg gag aac gga cac aag 2158Ser Cys Lys Thr Ser Pro Lys Asp Val Glu Trp Glu Asn Gly His Lys630 635 640cca ttc ccc atc aaa gga gtg gaa tgt ttt gcc atg tac ttc acc aag 2206Pro Phe Pro Ile Lys Gly Val Glu Cys Phe Ala Met Tyr Phe Thr Lys645 650 655gaa aaa aag cta atc ctc tca caa cta tct gac acc att gaa ata tca 2254Glu Lys Lys Leu Ile Leu Ser Gln Leu Ser Asp Thr Ile Glu Ile Ser660 665 670ctt gat ccc ttc gat tac gag ctt att gta gtc tct ccg atg aca att 2302Leu Asp Pro Phe Asp Tyr Glu Leu Ile Val Val Ser Pro Met Thr Ile675 680 685cta ccc tgg gag tcg atc gca ttt gca ccc ata gga tta gta aac atg 2350Leu Pro Trp Glu Ser Ile Ala Phe Ala Pro Ile Gly Leu Val Asn Met690 695 700 705ctc aac gcc gga ggg gca gtc aag tct ttg gac atc agt gag gat aat 2398Leu Asn Ala Gly Gly Ala Val Lys Ser Leu Asp Ile Ser Glu Asp Asn710 715 720gag gat aag atg gtt cag gtt ggt att aaa ggg gcc gga gaa atg atg 2446Glu Asp Lys Met Val Gln Val Gly Ile Lys Gly Ala Gly Glu Met Met725 730 735gtt tat tca tca gaa aag cca aaa gcg tgt aga gtt aat gga gaa gac 2494Val Tyr Ser Ser Glu Lys Pro Lys Ala Cys Arg Val Asn Gly Glu Asp740 745 750atg gag ttt gag tat gaa gag agc atg att aag gtt caa gtt aca tgg 2542Met Glu Phe Glu Tyr Glu Glu Ser Met Ile Lys Val Gln Val Thr Trp
755 760 765aac cat aac tca ggt ggt ttt acc act gtt gag tac tta ttt tga gcttg 2592Asn His Asn Ser Gly Gly Phe Thr Thr Val Glu Tyr Leu Phe770 775 780aagctaatct aagtctttac ttaatgagtg atgtaactga gtagttgact tgagagtaca 2652gtatgtgtga agcttattat tccaaaaaaa aaaaaaaa 2690<210>5<211>777<212>PRT<213>芥菜<400>5Met Ala Pro Pro Ser Val Ile Lys Ser Asp Ala Ala Val Asn Gly Ile5 10 15Asp Leu Ser Gly Lys Pro Leu Phe Arg Leu Glu Gly Ser Asp Leu Leu20 25 30Ala Asn Gly His Val Val Leu Thr Asp Val Pro Val Asn Val Thr Val35 40 45Thr Ala Ser Pro Tyr Leu Ala Asp Lys Asp Gly Glu Pro Val Asp Ala50 55 60Ser Ala Gly Ser Phe Ile Gly Phe Asn Leu Asp Gly Glu Pro Arg Ser65 70 75 80Arg His Val Ala Ser Ile Gly Lys Leu Arg Asp Ile Arg Phe Met Ser85 90 95Ile Phe Arg Phe Lys Val Trp Trp Thr Thr His Trp Val Gly Ser Lys100 105 110Gly Ser Asp Ile Glu Asn Glu Thr Gln Ile Ile Ile Leu Glu Asn Ser115 120 125Gly Ser Gly Arg Pro Tyr Val Leu Leu Leu Pro Leu Leu Glu Gly Ser130 135 140Phe Arg Ser Ser Phe Gln Pro Gly Glu Asp Asp Asp Val Ala Val Cys145 150 155 160Val Glu Ser Gly Ser Thr Gln Val Thr Gly Ser Glu Phe Arg Gln Val165 170 175Val Tyr Val His Ala Gly Asp Asp Pro Phe Lys Leu Val Lys Asp Ala180 185 190Met Lys Val Val Arg Val His Met Asn Thr Phe Lys Leu Leu Glu Glu195 200 205Lys Thr Pro Pro Gly Ile Val Asp Lys Phe Gly Trp Cys Thr Trp Asp210 215 220Ala Phe Tyr Leu Thr Val Asn Pro Asp Gly Val His Lys Gly Val Lys225 230 235 240Cys Leu Val Asp Gly Gly Cys Pro Pro Gly Leu Val Leu Ile Asp Asp245 250 255Gly Trp Gln Ser Ile Gly His Asp Ser Asp Gly Ile Asp Val Glu Gly260 265 270Met Ser Cys Thr Val Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg Leu Leu Lys275 280 285Phe Gln Glu Asn Phe Lys Phe Arg Asp Tyr Val Ser Pro Lys Asp Lys290 295 300Asn Glu Val Gly Met Lys Ala Phe Val Arg Asp Leu Lys Glu Glu Phe305 310 315 320Ser Thr Val Asp Tyr Ile Tyr Val Trp His Ala Leu Cys Gly Tyr Trp325 330 335Gly Gly Leu Arg Pro Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ser Thr Ile Val340 345 350Arg Pro Glu Leu Ser Pro Gly Leu Lys Leu Thr Met Gln Asp Leu Ala355 360 365Val Asp Lys Ile Val Asp Thr Gly Ile Gly Phe Val Ser Pro Asp Met370 375 380Ala Asn Glu Phe Tyr Glu Gly Leu His Ser His Leu Gln Asn Val Gly385 390 395 400Ile Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Ile Leu Glu Met Leu Cys405 410 415Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Val Asp Leu Ala Lys Ala Tyr Phe Lys Ala420 425 430Leu Thr Ser Ser Val Asn Lys His Phe Asp Gly Asn Gly Val Ile Ala435 440 445Ser Met Glu His Cys Asn Asp Phe Met Phe Leu Gly Thr Glu Ala Ile450 455 460Ser Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Thr Asp Pro Ser Gly465 470 475 480Asp Ile Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His Met Val His Cys485 490 495Ala Tyr Asn Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile Gln Pro Asp Trp Asp500 505 510Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His Ala Ala Ser Arg
515 520 525Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Ile Ser Asp Cys Val Gly Gln His530 535 540Asp Phe Asp Leu Leu Lys Arg Leu Val Leu Pro Asp Gly Ser Ile Leu545 550 555 560Arg Cys Glu His Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Arg Leu Phe Glu Asp565 570 575Pro Leu His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn Leu Asn Lys580 585 590Tyr Thr Gly Ile Ile Gly Ala Phe Asn Cys Gln Gly Gly Gly Trp Cys595 600 605Arg Glu Thr Arg Arg Asn Gln Cys Phe Ser Gln Cys Val Asn Thr Leu610 615 620Thr Ala Thr Thr Asn Pro Lys Asp Val Glu Trp Asn Ser Gly Asn Asn625 630 635 640Pro Ile Ser Val Glu Asn Val Glu Glu Phe Ala Leu Phe Leu Ser Gln645 650 655Ser Lys Lys Leu Val Leu Ser Gly Pro Asn Asp Asp Leu Glu Ile Thr660 665 670Leu Glu Pro Phe Lys Phe Glu Leu Ile Thr Val Ser Pro Val Val Thr675 680 685Ile Glu Gly Ser Ser Val Gln Phe Ala Pro Ile Gly Leu Val Asn Met690 695 700Leu Asn Thr Ser Gly Ala Ile Arg Ser Leu Val Tyr His Glu Glu Ser705 710 715 720Val Glu Ile Gly Val Arg Gly Ala Gly Glu Phe Arg Val Tyr Ala Ser725 730 735Arg Lys Pro Ala Ser Cys Lys Ile Asp Gly Glu Val Val Glu Phe Gly740 745 750Tyr Glu Glu Ser Met Val Met Val Gln Val Pro Trp Ser Ala Pro Glu755 760 765Gly Leu Ser Ser Ile Lys Tyr Glu Phe770 775 777<210>6<211>2690<212>DNA<213>芥菜<220><221>CDS<222>(134)…(2467)<400>6accaatccaa aatctcatca aataatcgca attaggggaa gtttacaaga ttcatcatct60ccgttactat ataactacgc tcttcttcct tcgcctaatc caacttaacc taaaaaccac 120tctatcagcg aaa atg gct cca ccg agc gta att aaa tcc gat gct gca 169Met Ala Pro Pro Ser Val Ile Lys Ser Asp Ala Ala5 10gtc aac ggc att gac ctc tcc gga aag ccg ctt ttc cgg cta gag ggt 217Val Asn Gly Ile Asp Leu Ser Gly Lys Pro Leu Phe Arg Leu Glu Gly15 20 25tcc gat ctc cta gcc aat ggt cac gtt gtc tta acc gat gta ccg gtt 265Ser Asp Leu Leu Ala Asn Gly His Val Val Leu Thr Asp Val Pro Val30 35 40aac gtg act gtc act gct tca cct tac cta gct gac aaa gac gga gaa 313Asn Val Thr Val Thr Ala Ser Pro Tyr Leu Ala Asp Lys Asp Gly Glu45 50 55 60ccg gtt gac gcc tcc gct ggt tca ttc atc ggg ttt aat ctc gac ggt 361Pro Val Asp Ala Ser Ala Gly Ser Phe Ile Gly Phe Asn Leu Asp Gly65 70 75gag cca cga agc cgc cac gtg gcg tcc atc ggt aaa ctc agg gat att 409Glu Pro Arg Ser Arg His Val Ala Ser Ile Gly Lys Leu Arg Asp Ile80 85 90cga ttc atg agc ata ttc cgt ttc aag gtt tgg tgg act act cac tgg 457Arg Phe Met Ser Ile Phe Arg Phe Lys Val Trp Trp Thr Thr His Trp95 l00 105gtc ggt tcc aaa gga tcc gac atc gag aac gag acc cag atc atc atc 505Val Gly Ser Lys Gly Ser Asp Ile Glu Asn Glu Thr Gln Ile Ile Ile110 115 120ctc gag aac tcc ggg tcg ggt cgt cct tat gtt ctt ctt ctg ccg ctt 553Leu Glu Asn Ser Gly Ser Gly Arg Pro Tyr Val Leu Leu Leu Pro Leu125 130 135 140ctt gaa ggc tct ttc cgt tca tcc ttt cag cct ggg gaa gac gat gac 601Leu Glu Gly Ser Phe Arg Ser ger Phe Gln Pro Gly Glu Asp Asp Asp145 150 155gtg gcg gtt tgt gtc gaa tcc ggg tcg acc cag gtg acc ggg tcg gag 649Val Ala Val Cys Val Glu Ser Gly Ser Thr Gln Val Thr Gly Ser Glu
160 165 170ttt cgt caa gtt gtg tat gtt cac gcc gga gac gat ccg ttc aag ctc 697Phe Arg Gln Val Val Tyr Val His Ala Gly Asp Asp Pro Phe Lys Leu175 180 185gtg aaa gac gcg atg aag gtg gtt agg gtt cat atg aac acc ttc aag 745Val Lys Asp Ala Met Lys Val Val Arg Val His Met Asn Thr Phe Lys190 195 200ctc ttg gaa gag aag acr ccg ccg gga atc gtc gat aag ttc ggg tgg 793Leu Leu Glu Glu Lys Thr Pro Pro Gly Ile Val Asp Lys Phe Gly Trp205 210 215 220tgc acg tgg gat gcg ttt tat ttg acg gtg aac cct gac gga gtt cat 841Cys Thr Trp Asp Ala Phe Tyr Leu Thr Val Asn Pro Asp Gly Val His225 230 235aag ggt gtt aag tgt ctc gtc gac ggt ggt tgt ccg ccg gga ttg gtc 889Lys Gly Val Lys Cys Leu Val Asp Gly Gly Cys Pro Pro Gly Leu Val240 245 250cta atc gac gac ggt tgg caa tcg att gga cat gac tcc gat ggt atc 937Leu Ile Asp Asp Gly Trp Gln Ser Ile Gly His Asp Ser Asp Gly Ile255 260 265gat gtt gaa ggg atg agt tgt acc gtc gcc ggg gag caa atg cct tgc 985Asp Val Glu Gly Met Ser Cys Thr Val Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys270 275 280agg ctt ctg aaa ttt caa gag aac ttc aag ttc aga gac tac gtc tct1033Arg Leu Leu Lys Phe Gln Glu Asn Phe Lys Phe Arg Asp Tyr Val Ser285 290 295 300ccg aaa gac aaa aac gaa gtc ggg atg aaa gct ttc gtc aga gat ctg1081Pro Lys Asp Lys Asn Glu Val Gly Met Lys Ala Phe Val Arg Asp Leu305 310 315aaa gaa gaa ttc tcc acc gtt gat tac atc tac gtc tgg cac gcg ctt1129Lys Glu Glu Phe Ser Thr Val Asp Tyr Ile Tyr Val Trp His Ala Leu320 325 330tgc ggc tac tgg ggt ggt ctt cgt ccc gga gct cct act ctt ccg ccc1177Cys Gly Tyr Trp Gly Gly Leu Arg Pro Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro335 340 345tca act att gtc cgg cca gag ctc tcg ccg ggg ctt aag ttg acg atg1225Ser Thr Ile Val Arg Pro Glu Leu Ser Pro Gly Leu Lys Leu Thr Met350 355 360caa gat ctc gcc gtt gat aag att gtc gat acc gga atc gga ttc gtc1273Gln Asp Leu Ala Val Asp Lys Ile Val Asp Thr Gly Ile Gly Phe Val365 370 375 380tcg ccg gac atg gcg aat gag ttt tac gaa ggt ctt cac tct cat ctt1321Ser Pro Asp Met Ala Asn Glu Phe Tyr Glu Gly Leu His Ser His Leu385 390 395caa aac gtc ggt att gac ggc gtt aaa gtt gac gtc atc cac ata ttg1369Gln Asn Val Gly Ile Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Ile Leu400 405 410gag atg ttg tgc gag aaa tat ggc ggg aga gta gac ttg gct aaa gct1417Glu Met Leu Cys Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Val Asp Leu Ala Lys Ala415 420 425tac ttc aag gcg tta act tcc tca gtg aat aag cat ttt gac ggt aac 1465Tyr Phe Lys Ala Leu Thr Ser Ser Val Asn Lys His Phe Asp Gly Asn430 435 440ggc gtt atc gct agc atg gag cac tgt aat gat ttc atg ttc ctt gga1513Gly Val Ile Ala Ser Met Glu His Cys Asn Asp Phe Met Phe Leu Gly445 450 455 460acc gaa gcc atc tct cta ggt cgt gtc ggt gat gac ttt tgg tgc acg1561Thr Glu Ala Ile Ser Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Thr465 470 475gat cca tca ggc gac ata aac ggc aca tat tgg ctg caa gga tgc cac1609Asp Pro Ser Gly Asp Ile Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His480 485 490atg gtc cac tgt gcc tac aac agt ctt tgg atg gga aat ttc atc cag1657Met Val His Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile Gln495 500 505cct gat tgg gac atg ttt cag tcc aca cat cct tgt gct gag ttc cat1705Pro Asp Trp Asp Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His510 515 520gct gct tct cgt gcc atc tcc ggt ggg ccc att tac atc agc gat tgt1753Ala Ala Ser Arg Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Ile Ser Asp Cys525 530 535 540gtg ggc cag cac gat ttc gat ctc ttg aag cga ctc gtc ttg cct gac1801Val Gly Gln His Asp Phe Asp Leu Leu Lys Arg Leu Val Leu Pro Asp545 550 555ggt tcg att ttg agg tgt gag cac tat gca ctc cca act cgt gac cgt1849Gly Ser Ile Leu Arg Cys Glu His Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Arg560 565 570ctc ttt gaa gac cct ctt cat gat ggc aaa acc atg ctc aag att tgg1897Leu Phe Glu Asp Pro Leu His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp
575 580 585aac ttg aac aag tac act gga att att gga gca ttc aac tgc caa gga1945Asn Leu Asn Lys Tyr Thr Gly Ile Ile Gly Ala Phe Asn Cys Gln Gly590 595 600gga gga tgg tgc aga gaa acc cga cgc aac caa tgc ttc tcc caa tgc1993Gly Gly Trp Cys Arg Glu Thr Arg Arg Asn Gln Cys Phe Ser Gln Cys605 610 615 620gtt aac acg tta acc gcc aca aca aat cct aag gac gtt gaa tgg aac2041Val Asn Thr Leu Thr Ala Thr Thr Asn Pro Lys Asp Val Glu Trp Asn625 630 635agt ggg aac aac cca atc tcc gtt gaa aac gtt gaa gag ttt gct ttg2089Ser Gly Asn Asn Pro Ile Ser Val Glu Asn Val Glu Glu Phe Ala Leu640 645 650ttc ttg tct cag tct aag aag ctt gtg ttg tct gga cca aac gat gat2137Phe Leu Ser Gln Ser Lys Lys Leu Val Leu Ser Gly Pro Asn Asp Asp655 660 665ctc gag atc act ttg gag cct ttc aag ttt gag cta atc act gtc tca2185Leu Glu Ile Thr Leu Glu Pro Phe Lys Phe Glu Leu Ile Thr Val Ser670 675 680cca gtt gtc act att gag ggt agt tcg gtt cag ttt gct cca atc gga2233Pro Val Val Thr Ile Glu Gly Ser Ser Val Gln Phe Ala Pro Ile Gly685 690 695 700ttg gtt aac atg cta aac act agc ggt gca att cga tcc ttg gtg tat2281Leu Val Asn Met Leu Asn Thr Ser Gly Ala Ile Arg Ser Leu Val Tyr705 710 715cat gag gaa tcc gtt gag att gga gtt cgt ggt gct gga gag ttc agg2329His Glu Glu Ser Val Glu Ile Gly Val Arg Gly Ala Gly Glu Phe Arg720 725 730gtt tat gca tca agg aaa cct gcg agc tgc aaa att gat ggt gaa gtt2377Val Tyr Ala Ser Arg Lys Pro Ala Ser Cys Lys Ile Asp Gly Glu Val735 740 745gtt gag ttt gga tac gaa gag tca atg gtg atg gtt caa gtg cct tgg2425Val Glu Phe Gly Tyr Glu Glu Ser Met Val Met Val Gln Val Pro Trp750 755 760tct gca ccc gag ggt ttg tct tct att aag tat gag ttt tag agtttccga 2476Ser Ala Pro Glu Gly Leu Ser Ser Ile Lys Tyr Glu Phe765 770 775aggtgcttat ttgtatcctt ctaaactcct taattatgag ctccgtgccg tttctttttc 2536tatatggttt ctgagagtga acatctaata tttacccact agggtataat tattggcttt 2596taagtgattt gtttttgaac tgtttttagt ggtgtaattt gtactgcccc tattattttt 2656catatttatt tgtgaaagat aaaaaaaaaa aaaa 2690<210>7<211>572<212>PRT<213>歐洲油菜<400>7Leu Glu Glu Lys Thr Pro Pro Gly Ile Val Asp Lys Phe Gly Trp Cys5 10 15Thr Trp Asp Ala Phe Tyr Leu Thr Val Asn Pro Asp Gly Val His Lys20 25 30Gly Val Lys Cys Leu Val Asp Gly Gly Cys Pro Pro Gly Leu Val Leu35 40 45Ile Asp Asp Gly Trp Gln Ser Ile Gly His Asp Ser Asp Gly lle Asp50 55 60Val Glu Gly Met Ser Cys Thr Val Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg65 70 75 80Leu Pro Lys Phe Gln Glu Asn Phe Lys Phe Arg Asp Tyr Val Ser Pro85 90 95Lys Asp Lys Asn Glu Val Gly Met Lys Ala Phe Val Arg Asp Leu Lys100 105 110Glu Glu Phe Ser Thr Val Asp Tyr Ile Tyr Val Trp His Ala Leu Cys115 120 125Gly Tyr Trp Gly Gly Leu Arg Pro Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ser130 135 140Thr Ile Val Arg Pro Glu Leu Ser Pro Gly Leu Lys Leu Thr Met Gln145 150 155 160Asp Leu Ala Val Asp Lys Ile Ile Asp Thr Gly Ile Gly Phe Val Ser165 170 175Pro Asp Met Ala Asn Glu Phe Tyr Glu Gly Leu His Ser His Leu Gln180 185 190Asn Val Gly Ile Asn Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Ile Leu Glu195 200 205Met Leu Cys Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Val Asp Leu Ala Lys Ala Tyr210 215 220Phe Lys Ala Leu Thr Ser Ser Val Asn Lys His Phe Asp Gly Asn Ala225 230 235 240Val Ile Ala Ser Met Glu His Cys Asn Asp Phe Met Phe Leu Gly Thr245 250 255Glu Ala Ile Ser Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Thr Asp260 265 270Pro Ser Gly Asp Ile Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His Met275 280 285Val His Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile Gln Pro290 295 300Asp Trp Asp Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His Ala305 310 315 320Ala Ser Arg Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Ile Ser Asp Cys Val325 330 335Gly Gln His Asp Phe Asp Leu Leu Arg Arg Leu Val Leu Pro Asp Gly340 345 350Ser Ile Leu Arg Cys Glu Tyr Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Arg Leu355 360 365Phe Glu Asp Pro Leu His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn370 375 380Leu Asn Lys Tyr Thr Gly lle lle Gly Ala Phe Asn Cys Gln Gly Gly385 390 395 400Gly Trp Cys Arg Glu Thr Arg Arg Asp Gln Cys Phe Ser Gln Cys Val405 410 415Asn Thr Leu Thr Ala Thr Thr Asn Pro Asn Asp Val Glu Trp Asn Ser420 425 430Gly Asn Asn Pro Ile Ser Ile Glu Asn Val Glu Glu Phe Ala Leu Phe435 440 445Leu Ser Gln Ser Lys Lys Leu Val Leu Ser Gly Gln Asn Asp Asp Leu450 455 460Glu Ile Thr Leu Glu Pro Phe Lys Phe Glu Leu Ile Thr Val Ser Pro465 470 475 480ValVal Thr Ile Glu Gly Ser Ser Val Gln Phe Ala Pro Ile Gly Leu485 490 495Val Asn Met Leu Asn Thr Ser Gly Ala Ile Arg Ser Leu Val Tyr His500 505 510Glu Glu Ser Val Glu Ile Gly Val Arg Gly Ala Gly Glu Phe Arg Val515 520 525Tyr Ala Ser Lys Lys Pro Val Ser Cys Lys Ile Asp Gly Glu Asp Val530 535 540Glu Phe Gly Tyr Glu Glu Ser Met Val Met Val Gln Val Pro Trp Ser545 550 555 560Ala Pro Glu Gly Leu Ser Ser Ile Lys Tyr Leu Phe565 570 572<210>8<211>1762<212>DNA<213>歐洲油菜<220><221> CDS<222>(1)…(1719)<400>8ttg gaa gaa aaa acg ccg ccg gga atc gtc gat aag ttc ggg tgg tgc 48Leu Glu Glu Lys Thr Pro Pro Gly Ile Val Asp Lys Phe Gly Trp Cys5 10 15acg tgg gat gcg ttt tat ttg acg gtg aac cct gac gga gtt cat aag 96Thr Trp Asp Ala Phe Tyr Leu Thr Val Asn Pro Asp Gly Val His Lys20 25 30ggt gtt aag tgt ctc gtc gac ggt ggt tgt ccg ccg gga ttg gtc cta 144Gly Val Lys Cys Leu Val Asp Gly Gly Cys Pro Pro Gly Leu Val Leu35 40 45atc gac gac ggt tgg caa tcg att gga cat gac tcc gat ggt atc gat 192Ile Asp Asp Gly Trp Gln Ser Ile Gly His Asp Ser Asp Gly Ile Asp50 55 60gtt gaa ggg atg agt tgt acc gtc gcc ggg gag caa atg cct tgc agg 240Val Glu Gly Met Ser Cys Thr Val Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg65 70 75 80ctt ccg aaa ttt caa gag aac ttc aag ttc aga gac tac gtc tct ccg 288Leu Pro Lys Phe Gln Glu Asn Phe Lys Phe Arg Asp Tyr Val Ser Pro85 90 95aaa gac aaa aac gaa gtc ggg atg aaa gct ttc gtc aga gat ctg aaa 336Lys Asp Lys Asn Glu Val Gly Met Lys Ala Phe Val Arg Asp Leu Lys100 105 110gaa gaa ttc tcc acc gtt gat tac atc tac gtc tgg cac gcg ctt tgc 384Glu Glu Phe Ser Thr Val Asp Tyr Ile Tyr Val Trp His Ala Leu Cys115 120 125ggy tac tgg ggw ggt ctt cgt ccc gga gct cct act ctt ccg ccs tcr 432Gly Tyr Trp Gly Gly Leu Arg Pro Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ser130 135 140act att gtc cgr cca gag ctc tcg ccg ggg ctt aag ttg acg atg caa 480Thr Ile Val Arg Pro Glu Leu Ser Pro Gly Leu Lys Leu Thr Met Gln145 150 155 160gat ctc gcc gtt gat aag atc atc gat acc gga atc gga ttc gtc tcg 528Asp Leu Ala Val Asp Lys Ile Ile Asp Thr Gly Ile Gly Phe Val Ser165 170 175ccg gac atg gcg aac gag ttt tac gaa ggt ctt cac tct cat ctt caa 576Pro Asp Met Ala Asn Glu Phe Tyr Glu Gly Leu His Ser His Leu Gln180 185 190aac gtc ggc att aac ggc gtt aaa gtt gac gtt ate cac ata ctg gag 624Asn Val Gly Ile Asn Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Ile Leu Glu195 200 205atg ttg tgc gag aaa tat ggc ggg aga gtt gac ttg gct aaa gct tac 672Met Leu Cys Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Val Asp Leu Ala Lys Ala Tyr210 215 220ttc aag gcg tta acg tcg tca gtg aat aag cat ttt gac ggc aac gcc 720Phe Lys Ala Leu Thr Ser Ser Val Asn Lys His Phe Asp Gly Asn Ala225 230 235 240gtt atc gcc agc atg gag cac tgt aat gac ttc atg ttc ctt gga acc 768Val Ile Ala Ser Met Glu His Cys Asn Asp Phe Met Phe Leu Gly Thr245 250 255gaa gcc atc tct cta ggt cgt gtc ggt gat gac ttt tgg tgc acg gat 816Glu Ala Ile Ser Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Thr Asp260 265 270cca tct ggc gac att aac ggc acg tat tgg ctg caa gga tgt cac atg 864Pro Ser Gly Asp Ile Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His Met275 280 285gtc cac tgt gcc tac aac agt ctt tgg atg gga aat ttc atc cag cct 912Val His Cys Ala Tyr Asa Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile Gln Pro290 295 300gat tgg gac atg ttt cag tcc aca cat cct tgt gct gag ttc cat gct 960Asp Trp Asp Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His Ala305 310 315 320gct tca cgt gcc atc tcc ggt ggg ccc att tac atc agc gat tgt gtg1008Ala Ser Arg Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Ile Ser Asp Cys Val325 330 335ggc cag cac gat ttc gat ctc ttg agg aga ctc gtt ttg cct gac ggt1056Gly Gln His Asp Phe Asp Leu Leu Arg Arg Leu Val Leu Pro Asp Gly340 345 350tcg att ttg agg tgt gag tac tat gct ctc cca act cgt gac cgt ctc1104Ser Ile Leu Arg Cys Glu Tyr Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Arg Leu355 360 365ttt gaa gac cct ctt cat gat ggc aaa acc atg ctc aag att tgg aac1152Phe Glu Asp Pro Leu His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn370 375 380ttg aac aag tac act gga atc atc gga gca ttc aac tgt caa gga gga1200Leu Asn Lys Tyr Thr Gly Ile Ile Gly Ala Phe Asn Cys Gln Gly Gly385 390 395 400gga tgg tgc aga gaa act cga cgc gac caa tgc ttc tcc caa tgc gtt1248Gly Trp Cys Arg Glu Thr Arg Arg Asp Gln Cys Phe Ser Gln Cys Val405 410 415aac acg tta acc gcc aca aca aat cct aat gac gtt gaa tgg aac agt1296Asn Thr Leu Thr Ala Thr Thr Asn Pro Asn Asp Val Glu Trp Asn Ser420 425 430ggg aac aac ccg atc tcc att gaa aac gtt gaa gag ttt gct ttg ttc1344Gly Asn Asn Pro Ile Ser Ile Glu Asn Val Glu Glu Phe Ala Leu Phe435 440 445ttg tct caa tcc aag aag ctt gtg ttg tcc ggg caa aac gat gat ctc1392Leu Ser Gln Ser Lys Lys Leu Val Leu Ser Gly Gln Asn Asp Asp Leu450 455 460gag atc aca tta gag ccc ttc aag ttc gag ctc atc act gtc tca cca1440Glu Ile Thr Leu Glu Pro Phe Lys Phe Glu Leu Ile Thr Val Ser Pro465 470 475 480gtt gtc acc att gag ggc agt tcg gtt cag ttt gct cca atc gga ttg1488Val Val Thr Ile Glu Gly Ser Ser Val Gln Phe Ala Pro Ile Gly Leu485 490 495gtt aac atg ctt aac act agc ggt gcg att cga tcc ttg gtt tat cat1536Val Asn Met Leu Asn Thr Ser Gly Ala Ile Arg Ser Leu Val Tyr His500 505 510gag gaa tcc gtt gag atc ggt gtt cgt ggt gct gga gaa ttc agg gtt1584Glu Glu Ser Val Glu Ile Gly Val Arg Gly Ala Gly Glu Phe Arg Val515 520 525tat gca tcg aag aaa cct gtg agc tgc aag att gat ggt gaa gat gtt1632Tyr Ala Ser Lys Lys Pro Val Ser Cys Lys Ile Asp Gly Glu Asp Val530 535 540gag ttt ggg tac gaa gag tca atg gtg atg gtt caa gtg cct tgg tct1680Glu Phe Gly Tyr Glu Glu Ser Met Val Met Val Gln Val Pro Trp Ser545 550 555 560gca cca gag ggt ttg tct tct att aag tat ttg ttt tag agttatttaa1729Ala Pro Glu Gly Leu Ser Ser Ile Lys Tyr Leu Phe565 570ggtgcttaat tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1762<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>9ccaatctgat catgcttgtg ccgaa 25<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>10ggaacaaagt tatgcactat tatttaaggt30<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>11ctaccaaatt ccacaactta aagttca27<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>12ggaataataa gcttcacaca tactgtactc tc 32<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>13atggctccaa gctttagcaa ggaaaattcc 30<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>14tcaaaataag tactcaacag tggtaaaacc 30<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>15ttggaagaga agacgccgcc gggaatcgtc 30<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>16ttaagccccg gcgagagctc tggccggaca 30<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>17accaatccaa aatctcatca aataatcgca 30<210>18<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>18aaataatagg ggcagtacaa attacaccac 30<210>19<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>19atggctccac cgagcgtaat taaatccga 29<210>20<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>20ctaaaactca tacttaatag aagacaaacc 30<210>21<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的引物n是i.<400>21cgatggatgg gnaanttnat ncanccngan tggganatgt t41<210>22<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物n是i,r是a或g。<400>22ggccacatnt tnacnarncc natnggngcn aa32<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>23tgttactagg cgaaacaaga gtagctctga30<210>24<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物n是i.<400>24cgaggnggnt gnccnccngg nttngtnatn atngangang gntggca47<210>25<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物n是i,y是t或c,r是a或g。<400>25atyttrtcna cngcnarrtc ytccatngt 29<210>26<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物n是i,y是t或c.<400>26ggnacntant ggytncangg ntgncanatg gtncantg38<210>27<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物n是i,r是a或g。<400>27ggccacatnt tnacnarncc natnggngcn aa 32<210>28<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>28atctatttgt catgacgatg atccga 26<210>29<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>29ggccctcatt cccatattgg gatgatcctc30<210>30<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>30aagcatgcca aacatacaca tgctcaacag 30<210>31<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>31agacccgggg aaagctttgg ggttactact 30<210>32<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>32tggatgggaa actttataca ccctgact28<210>33<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>33gacatgttcc catctacaca cccttgtg28<210>34<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>34ccaatttatg ttagtgatgt tgttggcaag 30<210>35<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>35tcgactccca gggtagaatt gtcatc 26<210>36<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物n是i.<400>36cgattnaang tntggtggac nacncantgg gtngg35<210>37<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物n是i,r是a或g。<400>37cantgnacca tntgncancc ntgnarccan tangtncc 38<210>38<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>38gttagggttc atatgaacac cttcaagctc 30<210>39<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>39caacggcgag atcttgcatc gtcaac26<210>40<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>40ggattcgaca caaaccgcca cgtcatcgtc 30<210>41<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>41ccacgtgcac cacccgaact tatcgac27<210>42<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>42aacatcgata ccatcggagt catgtccaat 30<210>43<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>43gttagggttc atatgaacac cttcaagctc 30<210>44<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>44tctacgtctg gcacgcgctt tgcggctac 29<210>45<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>45gttgacgtca tccacatatt ggagatgttg t 31<210>46<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>46gttatcgcta gcatggagca ctgtaatga 29<210>47<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>47aacgagctca atccaaaatc tcatcaaata atcgc 35<210>48<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>248acaatagttg agggcggaag agtag 25<210>49<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>49gatcgagctc gtgtcggatc cagct 25<210>50<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>50ggatccgaca cgagctc17<210>51<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>51cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg 30<210>52<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>52ggattcgaca caaaccgcca cgtcatcgtc 30<210>53<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>為了獲得棉子糖合酶基因而設計的寡核苷酸引物<400>53tctacgtctg gcacgcgctt tgcggctac29
權(quán)利要求
1．棉子糖合酶基因，包括在嚴格的條件下可與選自如下的核苷酸序列雜交的核苷酸序列(a)編碼由SEQ ID NO:1所表示氨基酸序列的核苷酸序列，(b)由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列，(c)編碼由SEQ ID NO:3所表示氨基酸序列的核苷酸序列，(d)由SEQ ID NO:4所表示核苷酸序列中由236位到2584位核苷酸所表示的核苷酸序列，(e)編碼由SEQ ID NO:5所表示氨基酸序列的核苷酸序列，(f)由SEQ ID NO:6所表示的核苷酸序列中由134位到2467位核苷酸所表示的核苷酸序列，(g)編碼由SEQ ID NO:7所表示氨基酸序列的核苷酸序列，和(h)由SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列中1到1719位核苷酸所表示的核苷酸序列，并且編碼的蛋白能夠經(jīng)α-(1→6)鍵結(jié)合D-半乳糖基到附著于蔗糖分子中D-葡萄糖殘基6-位碳原子上的羥基上以形成棉子糖。
2．棉子糖合酶基因，包括編碼SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列的核苷酸序列。
3．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列。
4．棉子糖合酶基因，包括編碼SEQ ID NO:3所表示氨基酸序列的核苷酸序列。
5．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:4所表示的核苷酸序列中由236位到2584位核苷酸所表示的核苷酸序列。
6．棉子糖合酶基因，包括編碼SEQ ID NO:5所表示氨基酸序列的核苷酸序列。
7．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:6所表示核苷酸序列中134位到2467位核苷酸所表示的核苷酸序列。
8．棉子糖合酶基因，包括編碼SEQ ID NO:7所表示氨基酸序列的核苷酸序列。
9．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列中1位到1719位核苷酸所表示的核苷酸序列。
10．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列。
11．核酸，包括權(quán)利要求1到10中任一項的棉子糖合酶基因的部分核苷酸序列。
12．用于檢測含有棉子糖合酶基因核酸的方法，包括用標記的權(quán)利要求11的核酸作為探針通過雜交檢測所述的核酸。
13．用于擴增含有棉子糖合酶基因核酸的方法，包括用權(quán)利要求11的核酸作為引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增所述的核酸。
14．用于獲取棉子糖合酶基因的方法，包括以下的步驟用標記的權(quán)利要求11的核酸作為探針通過雜交檢測含有所述棉子糖合酶基因的核酸，和回收檢測到的核酸。
15．用于獲取棉子糖合酶基因的方法，包括以下的步驟用權(quán)利要求11的核酸作為引物通過PCR擴增含有所述棉子糖合酶基因的核酸，和回收擴增的核酸。
16．核酸，包括含有權(quán)利要求1到10中任一項的棉子糖合酶基因的核酸，其被連接到在宿主細胞中表現(xiàn)出啟動子活性的核酸上。
17．載體，包括權(quán)利要求1到10中任一項的棉子糖合酶基因。
18．轉(zhuǎn)化子，其中權(quán)利要求1到10中任一項的棉子糖合酶基因被導入宿主細胞中。
19．轉(zhuǎn)化子，其中權(quán)利要求16的核酸被導入宿主細胞中。
20．轉(zhuǎn)化子，其中權(quán)利要求17的載體被導入宿主細胞中。
21．權(quán)利要求18到20中任一項的轉(zhuǎn)化子，其中的宿主為微生物。
22．權(quán)利要求18到20中的任一項的轉(zhuǎn)化子，其中的宿主為植物。
23．用于制備棉子糖合酶的方法，包括以下的步驟培養(yǎng)或種植權(quán)利要求18到22中任一項的轉(zhuǎn)化子以制備棉子糖合酶，和收集該棉子糖合酶。
24．包括由SEQ ID NO:1所表示氨基酸序列的棉子糖合酶。
25．包括由SEQ ID NO:3所表示氨基酸序列的棉子糖合酶。
26．包括由SEQ ID NO:5所表示氨基酸序列的棉子糖合酶。
27．包括由SEQ ID NO:7所表示氨基酸序列的棉子糖合酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了棉子糖合酶基因及其編碼的棉子糖合酶。還公開了檢測和擴增含該棉子糖合酶基因的核酸的方法。另外，本發(fā)明還涉及獲取棉子糖合酶基因和生產(chǎn)棉子糖合酶的方法。
文檔編號C12N15/82GK1237635SQ9910533
公開日1999年12月8日 申請日期1999年4月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月30日
發(fā)明者渡邊英二郎, 大江田憲治 申請人:住友化學工業(yè)株式會社