專利名稱：治療肝硬化和肝纖維化的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因療法領(lǐng)域，更特別的，涉及通過使用病毒載體治療肝硬化和肝纖維化的方法。
背景技術(shù)：
肝移植是治療罹患晚期肝硬化患者的唯一選擇。由于手術(shù)禁忌癥和器官稀缺，此方法只能夠應(yīng)用于少數(shù)患者。事實上，在美國等候名單上包括約12500患者，其進行移植的時間中數(shù)約為300天，在等候名單上有45%以上的患者超過兩年，其中死亡率每年達130人 /1000 個患者(Freeman R. B.等，Am J. Transplant. 2008 ；8 :958-976)。胰島素樣生長因子I (IGF-I)是強效細胞保護和合成代謝激素。血清IGF-I主要源于肝，而且必然循環(huán)調(diào)節(jié)IGF-I生物活性的一組結(jié)合蛋白(IGFBPs) (Adamo M等，1989， Endocrinology,124 :2737-2744和 Mohan S等，2002，J. Endocrinol.，175 :19-31)。IGFBPs 的降解釋放能夠與IGF-I受體(IGF-IR)相互作用并活化的游離IGF-I。IGF-I還能夠結(jié)合胰島素受體，而胰島素能夠活化IGF-IR，但對它們的同源受體親和度要高100至1000倍 (Nitert MD 等，2005，Mol. Cell. Endocrinol. 229 :31-37)。與 IGF-IR 的相互作用導(dǎo)致 MAP 激酶和PI3激酶級聯(lián)的活化，其調(diào)節(jié)參與細胞存活、生長和分化的基因(Riedemarm J.等， 2006, Endocr. Relat. , Cancer. 13 Suppl 1 :S33_43)。在肝硬化中，由于肝細胞功能不全，IGF-I水平有明顯減少。這種激素缺乏可以對存在于肝硬化中的全身代謝紊亂發(fā)揮作用(Conchillo M.等，2005 ;43 :630-636和 Lorenzo-Zuniga V.等，2006，Gut 55:1306-1312)。事實上，使用重組 IGF-I (rIGF-Ι)對肝硬化鼠的治療促進了重量增加、氮貯留和營養(yǎng)物的腸吸收(Castilla-Cortazar I.等， 2000，Hepatology, 31 =592-600)。另外，已經(jīng)示出rIGF-Ι在肝硬化鼠中發(fā)揮保肝護肝活性(Castilla-Cortazar I.等，1997，Gastroenterology，113 :1682-1691 禾口 Muguerza B, 等，2001，Biochim Biophys Acta. 1536 185-195)。而且，在肝硬化患者體內(nèi)每日使用 10(^8/1^1^劑量的1~16 -1的近期臨床試驗試點導(dǎo)致了血清白蛋白的顯著升高并提高了 Child-Pugh 評分(Conchillo Μ.等，2005，J. H印atol. 43 :630-636)。然而，因為需要大量 rIGF-I，在肝硬化中rIGF-I療法的潛在優(yōu)勢被治療的高額成本抵消。作為直接施用IGF-I的另一種可選方案，已經(jīng)提出了使用包含編碼IGF-I的多核苷酸的病毒載體。Vera Μ.等(Gene Ther. ,2007,14 =203-210)已經(jīng)描述了將編碼IGF-I 的重組猿猴病毒40載體注入健康鼠中能夠保護肝臟不受CCl4誘導(dǎo)的肝損傷。Sobrevals 等(Molecular Therapy Volume 16，Supplement l，May 2008，S145)已經(jīng)描述了施用編碼 IGF-I的重組猿猴病毒40載體可以恢復(fù)CCl4誘導(dǎo)的肝硬化的部分效果。然而，并非所有涉及病毒載體的結(jié)果都提供了陽性結(jié)果。比如，Zaraitegui等(J. Physiol. Biochem.，2002， 58 :169-176)已經(jīng)描述了對患有CCl4S導(dǎo)肝硬化的鼠進行肌肉內(nèi)施用編碼IGF-I的腺伴隨病毒沒有得到肝損傷的任何顯著改善。因此，本領(lǐng)域中需要用于治療肝硬化的改進的IGF-I遞送。

發(fā)明內(nèi)容
第一方面，本發(fā)明涉及包含編碼IGF-I或其同功能變體的核苷酸序列的病毒基因組，該序列可操作地與肝特異性啟動子連接。第二方面，本發(fā)明涉及可通過根據(jù)本發(fā)明在合適的包裝細胞內(nèi)表達病毒基因組獲得的病毒粒子。另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明用作藥物的病毒粒子。在還一些方面，本發(fā)明涉及包含如權(quán)利要求9所述的病毒粒子和藥學上可接受的載體的藥物組合物，以及用于治療和/或預(yù)防肝硬化或肝纖維化的方法，其包含向?qū)ζ渌璧氖茉囌呤┯脵?quán)利要求8或9所述的病毒粒子。另一方面，本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防肝硬化或肝纖維化的方法，其包含向需要其的受試者施用包含編碼IGF-I或其同功能變體的序列的重組細小病毒。另一方面，本發(fā)明涉及用于制備重組AAV病毒粒子的方法，包含以下步驟(i)使細胞接觸(a)第一核酸序列，包含i.包含編碼IGF-I或其同功能變體的序列的表達框，該序列可操作地與肝特異性啟動子連接，和ii.位于⑴中定義的表達框的兩側(cè)的AAV 5，-ITR和3，-ITR(b)編碼AAV rep蛋白的第二核酸序列(c)編碼AAV cap蛋白的第三核酸序列，和任選地，(d)編碼AAV依賴其復(fù)制的病毒和/或細胞功能的第四核酸序列和(ii)從細胞中回收重組AAV病毒粒子。在還另一方面，本發(fā)明涉及用于制備重組SV40病毒粒子的方法，包含-使細胞與包含復(fù)制缺陷的SV40基因組的多核苷酸接觸，該基因組包含表達框， 其包含編碼IGF-I或其同功能變體的序列，該序列可操作地與肝特異性啟動子連接，而且其中在足以使所述多核苷酸進入細胞內(nèi)的條件下細胞表達SV40基因，該SV40基因補足所述多核苷酸的復(fù)制缺陷，和-從細胞中回收重組SV40病毒粒子。


圖1.建立的肝硬化模型的分析。A.用于模型分析而施行的實驗的示意圖。B.轉(zhuǎn)氨酶的分析。在標明的時間上從健康鼠或肝硬化對照動物的血清中評估轉(zhuǎn)氨酶(AST、ALT 和ALP)。C和D.肝纖維化的評定。在標明的時間上使用天狼猩紅(C)染色和由圖像分析 (D)定量細胞外沉積。圖2.用于評估dsAAVIGF-I在肝硬化中的效果而施行的實驗的示意圖。誘導(dǎo)8周的肝硬化，處死動物，并在施用載體4天、2周、8周、16周和1年后評估血樣。圖3.在IGF-I治療的肝和對照中IGF-I表達的分析。通過qRT_PCR(A)或 ELISA(B和C)從健康或肝硬化對照動物(Ci)或從標明的時間上用dsAAVLuc (Ci+Luc)或 dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I)治療的動物中獲得的肝(A和B)或血清(C)定量IGF-I mRNA(A)和蛋白(B和C)。同樣通過RT-PCR對來自用于上述IGF-I的動物組的肝進行定量。圖4.來自IGF-I治療的鼠和對照的血清參數(shù)的分析。在來自健康鼠、來自肝硬化對照動物(Ci)或來自標明的時間上用dsAAVLuc (Ci+Luc)或dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I)治療的肝硬化動物的血清中評估轉(zhuǎn)氨酶(AST、ALT和ALP) (A)、膽紅素⑶和白蛋白(C)。圖5.在IGF-I治療的鼠和對照中肝纖維化的評定。使用天狼猩紅㈧染色和通過圖像分析(B)定量細胞外沉積。通過qRT-PCR定量I型膠原(C)和IV型膠原(D) mRNA。所有樣品從健康鼠、對照肝硬化動物(Ci)或從標明的時間上用dsAAVLuc (Ci+Luc) 或dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I)治療的肝硬化動物中獲得。圖6.在IGF-I治療的肝和對照中MMPs和MMP活性表達的分析。使用熒光底物 (A)測量MMP活性，通過ELISA定量MMP2⑶和MMP9 (C)蛋白，并通過qRT-PCR從健康肝或從對照動物(Ci)或從用dsAAVLuc (Ci+Luc)或dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I)在標明的時間上治療的動物中獲得的硬化肝中定量匪P 1⑶、2 (E)、9 (F)、14 (G)mRNA和TIMP2 (H)。圖7.在IGF-I治療的動物和對照中致纖維性因子(profibrogenic factor)、 TNFa和IL6的分析。通過免疫組織化學(A)檢測或通過qRT-PCR(B)從健康肝或從對照動物(Ci)或從用dsAAVLuc (Ci+Luc)或dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I)在標明的時間上治療的動物中獲得的硬化肝中定量a SMA蛋白㈧和mRNA⑶。在這些動物中，在肝(C和D)或血液 (E)中也分析了 TGF β mRNA (C)和蛋白(D 和 E)，并通過 qRT-PCR 定量肝 CTGF(F)、PDGF (G)、 VEGF(H)、雙調(diào)蛋白(AR、I)、TNF a (J)和 IL6 (K)mRNA。圖8.在IGF-I治療的動物和對照中HGF、HNF4 α和WT的分析。通過qRT-PCR從健康肝或從對照動物(Ci)或從用dsAAVLuc (Ci+Luc)或dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I)在標明的時間上治療的動物中獲得的硬化肝中定量HGF (A)、HNF4 α⑶和WT-ImRNA (C)。圖9.在IGF-I治療的動物和對照中增殖的分析。從組織學樣品(A)中定量 Κ 67染色，并通過qRT-PCR從健康肝或從對照動物(Ci)或從用dsAAVLuc (Ci+Luc)或 dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I)在標明的時間上治療的動物中獲得的硬化肝中定量PCNA mRNA。圖10.在用SVIGF-I、dsAAV-IGF_I治療的鼠和對照中肝纖維化的評定。用天狼猩紅染色并通過圖像分析(A和B)定量細胞外沉積。通過qRT-PCR定量I型膠原(C)mRNA和IV 型膠原(D)mRNA。所有樣品從健康鼠、對照肝硬化動物(Ci)或從用dsAAVLuc (Ci+AAVLuc)、 dsAAVIGF-I (Ci+AAVIGF-I)、SVLuc (Ci+SVLuc)或 SVIGF-I (Ci+SVIGF-I)在標明的時間上治療的肝硬化動物中獲得。圖11.用SVIGF-I、dsAAV-IGF-I治療的鼠和對照中IGF-I表達的分析。通過Elisa(A和B)或qRT-PCR(C)從健康鼠、對照肝硬化動物(Ci)或從用 dsAAVLuc (Ci+AAVLuc) ,SVIGF-I (Ci+SVIGF-I)或 dsAAVIGF-I (Ci+AAVIGF-I)在標明的時間上治療的肝硬化動物中獲得的肝中定量總㈧和游離(B) IGF-I蛋白以及mRNA(C)。圖12.用SVIGF-I、AAV-IGF-I治療的鼠和對照中活化的HSC的分析。通過免疫組織化學㈧檢測并通過qRT-PCR⑶從健康鼠、對照肝硬化動物(Ci)或從用 dsAAVLuc (Ci+AAVLuc) ,SVIGF-I (Ci+SVIGF-I)或 dsAAVIGF-I (Ci+AAVIGF-I)治療 4 天(Α 和 B)或8周⑶的肝硬化動物中獲得的肝中量化a SMA蛋白㈧和mRNA (B)。圖 13.用 SVIGF-I、dsAAV-IGF-I 治療的鼠禾Π 對照中 TGF β、CTGF 禾Π VEGF 分析。通過qRT-PCR㈧或ELISA(B和C)從健康鼠、對照肝硬化動物(Ci)或從用dsAAVLuc (Ci+AAVLuc)、SVIGF-I (Ci+SVIGF-I)或 dsAAVIGF-I (Ci+AAVIGF-I)治療 4 天或 8 周的肝硬化動物中獲得的肝(A和B)或血清(C)中定量TGFiimRNA㈧和蛋白(B和C)。圖14.用SVIGF-I、dsAAV-IGF-I治療的鼠和對照中HGF和HNF4 α的分析。從健康鼠、對照肝硬化動物(Ci)或從用 dsAAVLuc (Ci+AAVLuc)、SVIGF-I (Ci+SVIGF-I)或 dsAAVIGF-I (Ci+AAVIGF-I)治療4天或8周的肝硬化動物中分離的肝中定量HGFmRNA (A)和 HNF4α mRNA(B)。圖15.肝IGF-I表達和活性分析。A 在治療后4天或8周在肝提取物中IGF-ImRNA 的表達水平。B 在施用載體(低劑量4. 8x IO10Vp/鼠)后16周在肝提取物中IGF-I mRNA的表達水平。C 在肝提取物中IGF-I蛋白水平。D和E 治療后4天定量總血清IGF-I⑶和游離血清IGF-I (E)水平；在ssAAVLuc的情況下，示出的IGF-I水平對應(yīng)高劑量1. 2x 1012vp/ 鼠和極低劑量9. 7x IO9Vp/鼠。F 在治療后4天或8周在肝提取物中IGF_IBP3mRNA的表達水平。G 在施用載體(低劑量4. 8x IO10Vp/鼠)后16周在肝提取物中IGF_IBP3mRNA的表達水平。H 在肝提取物中IGF-I受體(IGF-IIOmRNA的表達水平。通過qRT-PCR定量所有mRNA表達水平，并通過ELISA定量IGF-I蛋白水平。三角形表明劑量遞減。圖16.血清轉(zhuǎn)氨酶的分析。在施用載體后4天㈧、8周(B)、12周(C)和1年⑶ 在血清中定量轉(zhuǎn)氨酶水平(AST、ALT和ALP)。在第12周，示出的水平對應(yīng)于低劑量載體 (4. 8x IO10Vp/鼠)。在第1年，示出的水平對應(yīng)于高劑量載體(1. 2x 1012vp/鼠)。三角形表明劑量遞減。圖17.血清膽紅素的分析。在施用載體后4天㈧、8周(B)、12周(C)和1年⑶ 在血清中定量膽紅素水平。在第12周，示出的水平對應(yīng)于低劑量載體(4. 8x IO10Vp/鼠)。 在第1年，示出的水平對應(yīng)于高劑量載體(1. 2x IO12Vp/鼠)。三角形表明劑量遞減。圖18.血清白蛋白的分析。在施用載體后4天㈧、8周(B)、12周(C)和1年⑶ 在血清中定量白蛋白水平。在第12周，示出的水平對應(yīng)于低劑量載體(4. 8x IO10Vp/鼠)。 在第1年，示出的水平對應(yīng)于高劑量載體(1. 2x IO12Vp/鼠)。三角形表明劑量遞減。圖19.肝纖維化的評定。通過在用天狼猩紅(A和C)染色的組織樣品中細胞外沉積的圖像分析定量；通過qRT-PC在肝組織中I型膠原(B和D)和IV型膠原(C和F)mRNA 的表達水平定量來評估肝纖維化。示出的數(shù)據(jù)對應(yīng)于治療后8周(A至C)和治療后16周 (D至F)采集的樣品。在后一種情況下，示出的數(shù)據(jù)對應(yīng)于低劑量ssAAVLuc和ssAAVIGF_I。 三角形表明劑量遞減。圖20. MMPs和MMP抑制劑的分析。在治療后8周(A至H)或16周(I-M)獲得肝提取物樣品。ssAAVIGF-I的E和F示出數(shù)據(jù)對應(yīng)于高劑量和極低劑量。在后一種情況下， 示出的數(shù)據(jù)對應(yīng)于低劑量(4. 8x IO10Vp/鼠)ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。通過qRT-PCR定量 MMP1(A，I)、MMP2(B，J)、MMP9(C，K)、MMP14(D，L)和 TIMP_2(E，M)的 mRNA 表達。通過 ELISA 定量MMP2(F)和MMP9(G)蛋白水平。還評估了總MMP活性(H)。三角形表明劑量遞減。圖21.肝星狀細胞(HSCs)的分析。在治療后8周(A-B)或16周(C)獲得的肝樣品中分析α SMA表達。在后一種情況下，顯示的數(shù)據(jù)對應(yīng)于低劑量ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。 A 通過α SMA特異性免疫組織化學定位肝組織中的α SMA。B和C 通過qRT-PCR定量α SMA mRNA。三角形表明劑量遞減。圖22.炎癥和致纖維性因子的分析。在治療后8周(A、C、E、G、I、K和M)或16周(B、D、F、I、J、L和N)獲得肝提取物樣品。在后一種情況下，示出的數(shù)據(jù)對應(yīng)于低劑量 ssAAVLuc 和 ssAAVIGF-L· 通過 qRT-PCR 定量 TGF β ,TNFa、IL-6、CTGF、VEGF、PDGF 和雙調(diào)蛋白(AR)mRNA的表達水平。三角形表明劑量遞減。圖23.肝細胞生長因子HGF的分析。在治療后4天(A-B)、8周(C-D)和16周(E) 獲得肝提取物樣品。A和B示出的ssAAVIGF-I數(shù)據(jù)對應(yīng)于高劑量和極低劑量。在后一種情況下，示出的數(shù)據(jù)對應(yīng)于低劑量ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。通過qRT-PCR定量HGF mRNA表達(A、C和E)；通過ELISA定量HGF蛋白水平(B和D)。三角形表明劑量遞減。圖24.分化因子的分析。在治療后4天㈧、8周(B，D)和16周(C，E)獲得肝提取物樣品。第4天示出的ssAAVLuc劑量對應(yīng)于極低劑量。第16周示出的數(shù)據(jù)對應(yīng)于低劑量ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。通過qRT-PCR定量成熟因子HNF4a(A、B和C)和分化因子 WT-I (D和E)mRNA的表達水平。三角形表明劑量遞減。圖25.增殖的分析。在治療后4天獲得的肝組織樣品中Ki67染色細胞核的定量。 B、C和D 通過qRT-PCR在治療后4天⑶、8周(C)或16周⑶獲得的肝提取物樣品中定量增殖因子PCNA mRNA的表達水平。第4天示出的ssAAVLuc數(shù)據(jù)對應(yīng)于極低劑量。第16 周示出的數(shù)據(jù)對應(yīng)于低劑量的ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。三角形表明劑量遞減。發(fā)明詳述本發(fā)明的作者已經(jīng)觀察到，對患有既定肝硬化的鼠施用編碼IGF-I的病毒載體 (其中編碼IGF-I的多核苷酸在肝特異性啟動子的控制下)激活了強大的組織修復(fù)程序，其特征在于刺激纖維分解、下調(diào)致纖維性因子并誘導(dǎo)細胞保護分子。這些改變與肝結(jié)構(gòu)和肝細胞功能的明顯改善有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明，用AAV載體將IGF-I基因向硬化肝的轉(zhuǎn)移可以是患者的潛在治療選擇，所述患者罹患晚期肝硬化而不能接受肝移植或在等候移植的名單上病情惡化。病毒基因組本發(fā)明的作者已經(jīng)觀察到，使用病毒載體(其中編碼IGF-I的序列在肝特異性啟動子的控制下)將IGF-I轉(zhuǎn)移到硬化肝中導(dǎo)致肝功能改善并降低肝纖維化(參見本發(fā)明的實施例3和10)。因此，第一方面，本發(fā)明涉及包含編碼IGF-I或其同功能變體的核苷酸序列(其可操作地與肝特異性啟動子連接)的病毒基因組。如本文所使用的，術(shù)語“病毒基因組”是指包含一個或多個異源性核苷酸序列的重組病毒基因組(即病毒DNA)。優(yōu)選地，所有其他結(jié)構(gòu)性和非結(jié)構(gòu)性編碼序列都不存在于病毒載體中，因為它們能夠通過載體，如質(zhì)?；蛲ㄟ^將序列穩(wěn)定并入包裝細胞系中反式提供。 載體可以用于在體外、在體內(nèi)或在活體外將DNA轉(zhuǎn)移到細胞中。在本發(fā)明中適合使用的病毒基因組包括但不限于，腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、牛痘病毒載體，包括基于痘病毒的載體、腺伴隨病毒載體、多瘤病毒載體、甲病毒載體或桿狀病毒載體、小核糖核酸病毒載體、 皰疹病毒載體，包括EBV載體(包括慢病毒載體、基于MMLV的載體)。本文中使用的術(shù)語“核苷酸序列，，與“多核苷酸”可交換使用，涉及任何長度的由核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸組成的任何聚合形式的核苷酸。此術(shù)語包括單鏈和雙鏈多核苷酸以及修飾的多核苷酸(甲基化的、保護的，等等)。如本文所使用的，術(shù)語“IGF-I”與術(shù)語“胰島素樣生長因子I”和生長調(diào)節(jié)素C可交換使用，涉及多肽家族，其特征在于該多肽家族示出了胰島素樣效果和胰島素樣結(jié)構(gòu)，與胰島素共享近50%的氨基酸同源性。此外，通過三維建模，已經(jīng)示出了 IGF的結(jié)構(gòu)與作為單鏈肽的胰島素原相似，通過三個二硫橋鍵交聯(lián)并由B鏈樣氨基末端部分(B域)、連接肽 (C域)和A鏈樣部分(A域)組成。另外，存在在胰島素原中未發(fā)現(xiàn)的羧基端延伸(D域)。 IGF-I多肽還包含另一個在胰島素原中未發(fā)現(xiàn)的羧基末端延伸，已經(jīng)命名為E域。用于本發(fā)明的合適的IGF-I分子包括但不限于-在NCBI上以登錄號NP_001104753(SEQID NO 1)描述的多肽的氨基酸1至158、 49至158或49至116，分別對應(yīng)于預(yù)前IGF-I、前IGF-I或成熟IGF-I的人同工型1。-在NCBI上以登錄號NP_0011047M(SEQID NO :2)描述的多肽的氨基酸1至137、 33至137或33至102，分別對應(yīng)于預(yù)前IGF-I、前IGF-I或成熟IGF-I的人同工型2。-在NCBI上以登錄號NP_001104755(SEQID NO :3)描述的多肽的氨基酸1至195、 49至195或49至118，其分別對應(yīng)于預(yù)前IGF-I、前IGF-I或成熟IGF-I的人同工型3。本發(fā)明還仔細考慮了來自不同動物種的編碼IGF-I的多核苷酸的用途，如但不限于馬鹿胰島素樣生長因子I(IGF-I)mRNA(GenBank登錄號TO2106)；馬胰島素樣生長因子 I前體(IGF-I)mRNA，(GenBank登錄號U28070)；山羊mRNA胰島素樣生長因子I (GenBank登錄號D11378)；兔胰島素樣生長因子I前體(IGF-I) mRNA，(GenBank登錄號U75390)；豬胰島素樣生長因子I (PlGF-I) mRNA，(GenBank登錄號M31175)；綿羊胰島素樣生長因子I (IGF-I) mRNA, (GenBank登錄號M89787)；人胰島素樣生長因子(IGF-I) IA和IB基因，外顯子1， (GenBank登錄號MU659和M77496)；鼠胰島素樣生長因子I (IGF-I) mRNA，(GenBank登錄號 M15480)；雞胰島素樣生長因子(IGF-I)mRNA，(GenBank登錄號M32791和]\C9720)；大馬哈魚胰島素樣生長因子I(IGF-I)mRNA，(GenBank登錄號M32792)；非洲爪蟾胰島素樣生長因子 I (IGF-I) mRNA，(GenBank 登錄號]\C9857)。技術(shù)人員將會理解的是，IGF-I以前體形式合成，一旦進入分泌途徑便通過信號肽酶首先經(jīng)歷裂解步驟裂解產(chǎn)生前IGF-I，然后通過其C端區(qū)域的內(nèi)切蛋白酶解處理而變?yōu)槌墒霫GF-I。因此，本發(fā)明載體中存在的核苷酸序列可以編碼全長前體形式，其然后應(yīng)該通過基于IGF-I內(nèi)源性信號肽存在的靶細胞機制處理?？蛇x地，還可能包括編碼融合于異源信號序列的前IGF-I的多核苷酸。如本文所使用的，表述“信號序列”是指在結(jié)構(gòu)基因5' 端的DNA序列，其與該基因一起轉(zhuǎn)錄并翻譯。前導(dǎo)序列通常使蛋白質(zhì)具有η端肽延伸，有時稱為前序列。對指定分泌到細胞外介質(zhì)或膜的蛋白，該信號序列將蛋白引入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，其從當中釋放到適當?shù)慕K點。前導(dǎo)序列正常地由人造地源于不同基因序列或從不同基因序列分離的所需的核酸編碼。適于作信號序列用于促進本發(fā)明的多核苷酸分泌的合適的異源性序列包括凝溶膠蛋白、白蛋白、血纖蛋白原的信號序列，除了別的以外，來自組織纖維蛋白溶酶原活化因子、胰島素和神經(jīng)生長因子(NGF)的信號肽。技術(shù)人員還會理解的是，只要病毒基因組的長度不超過病毒衣殼的包裝大小限度，本發(fā)明的病毒基因組可以包含編碼IGF-I的部分或全部基因組序列，在此情況下， IGF-I的編碼區(qū)將被內(nèi)含子區(qū)域隔開。本發(fā)明還仔細考慮了病毒基因組，其包含編碼本領(lǐng)域已知的IGF-I變體和片段的序列，如由 Sara, V. R.等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986,83 :4904-4907)、Ballard, F. J. φ (Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987, 149 :398-404) ；Bayne φ (J. Biol. Chem. 1988,263 :6233-6239) ；Sara V. R.等(Biochem.Biophys. Res. Commun. ,1989,165 :766-771) ；Forsberg 等，1990，Biochem. J. 271 :357-363)；美國專利號 4，876，242 和 5，077，276 ；和國際專利
發(fā)明者盧西亞諾馬蒂亞斯·索夫雷維斯, 哈拉爾德·佩特里, 瑪麗亞普里菲卡西·福特斯阿隆索, 艾瑞克雅各布斯胡貝圖斯·蒂默曼斯, 赫蘇斯瑪麗亞·普列托巴爾圖埃徹 申請人:西馬生物醫(yī)學計劃公司