專利名稱：用于生產和/或純化多核苷酸的方法和裝置及其可獲得的產物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于獲得(生產和/或純化)多核苷酸序列(如(藥物級)質粒DNA) 的方法和裝置。
現(xiàn)有技術多核苷酸的純化通常獲自能夠產生大量這些多核苷酸的宿主細胞，可能在遺傳工程后。Birnboim 等，(Nucleic acids research (核酸研究)，1979，7，1513-1523)描述了將堿性溶液添加至細胞培養(yǎng)物上以分解這些細胞并可能使基因組DNA變性，但不會影響質粒DNA。將這種堿性裂解與使用足量的醋酸鹽/醋酸的中和、一個或多個過濾步驟和在色譜柱上的截留步驟結合。已知可以裂解革蘭氏陰性細菌(如，大腸桿菌)的生物質，并通過包括沉淀、過濾、 選擇性沉淀和在柱子上的特異性截留的連續(xù)步驟從大量核酸和蛋白質中分離出目標核苷酸序列。根據所用的實驗方案，這些目標核苷酸序列會與污染物(或雜質)，如內毒素、酚類、氯化銫、溴化乙錠、Triton 、結合的蛋白質或其他核酸相結合。因為對于實驗室中的特定用途或對于臨床目的而言，需要高度純化的核苷酸序列，因此提出了幾種嘗試來降低污染物的量。EP 0880536B1描述了基于使用羥磷灰石色譜的分離來獲得內毒素純的DNA質粒的方法。US 6410274B1 (WO 9916869A1)描述了通過加入0. 1-0. 4M CaCl2 以沉淀污染物，如基因組DNA和RNA分子進行質粒DNA純化的分批方法。處理方法必須保證核苷酸序列(優(yōu)選質粒DNA)的完整性。主要障礙會阻礙這些核苷酸序列的容易回收。例如，使用堿性溶液或加熱步驟和/或長程序將會分解這些核苷酸序列。此外，DNA分子，包括質粒，對機械應力敏感。此外，高粘度的溶液可能引起局部不均勻性或需要強烈攪拌，這兩者都可能分解這些核苷酸序列。當使用濃縮的二價金屬氯化物(如CaCl2)溶液時，這種情況尤其明顯。為了避免分解，現(xiàn)有技術的一些處理方法需要在4°C下操作溶液，這導致較高的操作限制和成本。還已知分批方法進一步呈現(xiàn)出污染的風險。美國專利申請2005/0026177描述了用于獲得藥物級質粒DNA的裝置和連續(xù)方法， 包括堿性裂解、中和和出口上方截留層中的沉淀物的沉降，在出口處澄清的裂解產物離開截留反應器。發(fā)明目的本發(fā)明涉及不呈現(xiàn)現(xiàn)有技術的方法和裝置的缺陷的方法和裝置，尤其是不需要色譜步驟或色譜裝置的廉價且簡化的方法和裝置，并且可以優(yōu)選地在室溫下進行或使用，用于有效且快速地生產和/或純化一種或多種目標(多)核苷酸序列，如目標病毒序列或(可能是藥物(臨床)級)DNA質粒。發(fā)明概述用于獲得(通過生產和/或純化)目標(多)核苷酸序列的本發(fā)明方法包括步驟 (或由這些步驟組成)a)可能培養(yǎng)生產(涉及合成)該(多)核苷酸序列(尤其是目標DNA質粒)的宿主細胞(優(yōu)選重組的)，并收獲這些含有該(多)核苷酸序列(優(yōu)選該質粒)的細胞；b)將這些細胞(生產該(多)核苷酸序列，優(yōu)選該目標DNA質粒)引入通道中并在連續(xù)的方法中(即，在連續(xù)流動裝置中連續(xù)地)(通過該通道)分解這些細胞；c)在這種連續(xù)的方法中(即，在這個連續(xù)流動裝置中連續(xù)地)，通過將這些(分解的)細胞與一種或多種二價離子的(水合)鹽混合，在該通道中進行該(多)核苷酸序列 (尤其是該DNA質粒)的污染物(或雜質)的(連續(xù))沉淀，優(yōu)選地鹽選自(水合)CaCl2、 (水合)MgCl2、(水合)ZnCl2、(水合)SrCl2和(水合)BaCl2，或(不太優(yōu)選)其他(水合) 鹽，如LiCl、醋酸銨、硫酸銨、硫酸鈉或硫酸鎂(優(yōu)選的鹽是(水合)&(12和(水合)MgCl2)；d)收集所獲得的混合物(在一個小瓶中)并且使沉淀物分離(從混合物的溶液中分離出來)，優(yōu)選地浮選和/或沉淀介于約1小時和約48小時之間的時間段；e)優(yōu)選地通過抽空，從該溶液中收集包含該多核苷酸序列(尤其是該DNA質粒) 的可溶性材料，同時排除收集沉淀物；f)優(yōu)選地在一個或多個具有約0. 22 μ m至約1. 5 μ m孔徑的濾器上進行該可溶性材料的一個或多個過濾步驟，優(yōu)選地接著在約50kDa膜至約500kDa膜(優(yōu)選約50至約 250kDa，更優(yōu)選約70至約IOOkDa)上進行超濾步驟，以保留第一個膜截留物并從該第一個截留物中收集待純化的目標核苷酸序列，優(yōu)選目標DNA序列。更精確地，本發(fā)明涉及(通過生產和/或純化)獲得大小小于約3000個堿基(堿基對)的目標DNA質粒的方法，并且包括步驟(由這些步驟組成)a)可能培養(yǎng)包含該目標DNA質粒的宿主細胞(優(yōu)選重組的)，并且收獲含有該質粒的這些細胞；b)將這些細胞(包含目標DNA質粒)引入通道中，使用足量的RNA酶進行處理并在連續(xù)的方法中(在連續(xù)流動裝置中連續(xù)地)分解這些細胞；c)在這個連續(xù)的方法中(在連續(xù)流動裝置中連續(xù)地)，通過將這些(分解的)細胞與一種或多種二價離子的(水合)鹽混合，在該通道中進行該質粒的污染物(或雜質) 的(連續(xù))沉淀，優(yōu)選地鹽選自(水合)CaCl2、(水合)MgCl2、(水合)ZnCl2,(水合)SrCl2 和(水合)BaCl2，或(不太優(yōu)選的)其他(水合)鹽，如LiCl、醋酸銨、硫酸銨、硫酸鈉或硫酸鎂(優(yōu)選的鹽是(水合)CaCl2和(水合)MgCl2)；d)收集所獲得的混合物(在一個小瓶中)并且使沉淀物分離(從混合物的溶液中分離出來)，優(yōu)選地浮選和/或沉淀約1小時至約48小時之間的時間段；e)優(yōu)選地通過抽空，從該溶液中收集包含質粒的可溶性材料，同時排除收集沉淀物(以及沉淀和浮選單元)；f)優(yōu)選地在一個或多個具有約0. 22 μ m至約1. 5 μ m孔徑的濾器上進行該可溶性材料的一個或多個過濾步驟，優(yōu)選地接著在約50kDa膜至約500kDa膜(優(yōu)選約50至約250kDa,更優(yōu)選約70至約IOOkDa)上進行超濾(步驟)，以保留第一個膜截留物并從該第一個截留物中收集目標質粒。根據本發(fā)明的方法中所用的宿主細胞是原核生物細胞，如細菌，或真核生物細胞， 優(yōu)選選自酵母、植物、真菌、昆蟲或哺乳動物細胞(包括人細胞，限制條件是這些哺乳動物細胞不是人胚胎細胞)。本發(fā)明的優(yōu)選的真核生物細胞是酵母，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 細胞或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞和/或動物細胞，如果蠅(Drosophi 1 la) S2 細胞或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。優(yōu)選地，宿主細胞是原生生物細胞，如革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌 (Escherichia coli)或枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)細胞。術語“(多)核苷酸”意思是任何超過50個堿基的核苷酸序列，優(yōu)選超過50個堿基對。更優(yōu)選地，該(多)核苷酸序列是DNA分子。優(yōu)選地，本發(fā)明的(多)核苷酸序列是(DNA)質粒形式的，可能是大小小于3000 個堿基對的(DNA)質粒。有利地，在本發(fā)明的方法中，通過加入裂解溶液來分解細胞(懸浮液)。有利地，用于分解細胞(懸浮液)的(裂解)溶液是堿性溶液，優(yōu)選以約11至約 12. 5的pH存在，優(yōu)選約12至約12. 5的pH。分解這些細胞的優(yōu)選方法包括將細胞(懸浮液)與堿性(裂解)溶液混入(連續(xù)添加)通道中的步驟，此后在該通道中通過將由足量醋酸/醋酸鹽組合物(溶液)組成的中和溶液(優(yōu)選約5. 0至約6. 0的pH)加入裂解的細胞中(連續(xù))來獲得中和，以形成第一種混合物。有利地，該進行分解(裂解)組合物(溶液)的pH為約12至約12. 5，并且給該溶液補充足量的一種或多種凈化劑。優(yōu)選地，該堿性裂解溶液由足量的NaOH、Na2CO3或其混合物組成，并且優(yōu)選是足量的 NaOH。用于分解細胞的裂解溶液可以進一步包含約0. 01至約5 %的一種或多種凈化劑，優(yōu)選約0.1至約2%，更優(yōu)選約0.5至約(w V)，優(yōu)選凈化劑選自十二烷基硫酸鈉(SDS)、去氧膽酸鈉、Triton (R) X-100、Triton (R) X-114、Nonidet (R) Ρ-40、辛基-葡糖苷、 Brij (R) 35,Brij (R) 56,Tween (R) 20 和 CHAPS (3-[(3-膽酰胺丙基)二甲氨基]丙烷磺酸鹽)，或其混合物。有利地，包含目標生物分子的細胞(懸浮液)和用于(連續(xù))分解這些細胞的(裂解)溶液之間的最佳接觸時間為約15秒鐘至約15分鐘，優(yōu)選約3分鐘至約10分鐘，更優(yōu)選約5分鐘?；蛘?，包含目標生物分子的細胞(懸浮液)和用于(連續(xù))分解這些細胞的(裂解)溶液之間的最佳接觸時間優(yōu)選為約2分鐘至約3分鐘。優(yōu)選地，醋酸/醋酸鹽組合物具有約5. 0至約6. 0的pH，優(yōu)選約5. 5。優(yōu)選地，醋酸/醋酸鹽組合物具有3M(mol/l)醋酸鹽和15% (ν/ν)醋酸的濃度。優(yōu)選地，醋酸/醋酸鹽組合物在約4°C下冷藏。有利地，這些包含目標生物分子的裂解的細胞和中和溶液的最佳接觸時間為約15秒鐘至約5分鐘，優(yōu)選約30秒鐘至約2分鐘，更優(yōu)選約1分鐘。有利地，這些裂解的細胞和該沉淀溶液的最佳接觸時間為15秒鐘至約5分鐘，優(yōu)選約30秒鐘至約2分鐘，更優(yōu)選約1分鐘。有利地，涉及傾析、沉淀和/或浮選的步驟d)的最佳時間為約5小時至約M小時， 優(yōu)選約8小時至約M小時，更優(yōu)選約20小時至約M小時。約優(yōu)選地意指一個值加上或減去20或10% (例如，約5分鐘意思是從4分30秒至5分30秒的每一個值)。本發(fā)明的方法可以任選包括預備步驟，該步驟由將足量的RNA酶加入包含目標質粒的(完整)細胞(懸浮液)中并可以通過細胞膜擴散組成。這種RNA酶處理對于大小小于3000個堿基(堿基對)的質粒DNA的純化尤其有用。優(yōu)選地，(水合)鹽選自(水合)CaCl2、(水合)MgCl2、(水合)ZnCl2、(水合)SrCl2 和(水合)BaCl2，或(不太優(yōu)選的)其他(水合)鹽，如LiCl、醋酸銨、硫酸銨、硫酸鈉或硫酸鎂(優(yōu)選的鹽是(水合)&(12和(水合)MgCl2)，并且以約2M至約6M的濃度(連續(xù))加入溶液中的這些(分解的)細胞中。優(yōu)選的水合鹽是CaCl2. 2H20,并且以約2M至約6M，優(yōu)選約5M的濃度加入。有利地，這些(分解的)細胞和加入的鹽之間的最佳接觸時間為約15秒至約5分鐘，優(yōu)選約30秒至約2分鐘，更優(yōu)選約1分鐘，該階段適于獲得所需的沉淀，而沒有引起剪切力，剪切力可能破壞待純化的目標生物分子。有利地，進行本發(fā)明的連續(xù)方法，而沒有接觸含有本發(fā)明的(多)核苷酸序列(優(yōu)選質粒)的溶液和非一次性的材料(如泵和控制泵輸出的裝置)。在本發(fā)明的方法中，通過入口 /出口、泵或閥的打開來進行連續(xù)處理過程(或連續(xù)添加步驟)，并且通過稱量本發(fā)明進料溶液的小瓶或容器來有利地控制這些泵的輸出。優(yōu)選地，連續(xù)處理過程中和本發(fā)明裝置中所用的泵是蠕動泵。在不太優(yōu)選的實施方案中，通過入口出口、泵或閥的打開來進行該連續(xù)處理過程， 并且通過進入不同管狀元件中的泵輸出的測量來控制這些泵輸出。在本發(fā)明的方法中，在深床濾器上進行過濾步驟。或者，在本發(fā)明的方法中，在表面濾器上進行過濾步驟。本發(fā)明的方法優(yōu)選進一步包括步驟g):進行陰離子交換色譜(濾清(polishing) 步驟)，使用洗滌子步驟，優(yōu)選確切地在(陰離子交換)色譜上進行一個(濾清)步驟。陰離子交換色譜(步驟g)包括(或由其組成)本領域技術人員公知的經典純化步驟并包括子步驟-結合第一個截留物中存在的(多)核苷酸序列-洗滌-洗脫目標(多)核苷酸序列。優(yōu)選地通過使用pH為約6至約10的緩沖溶液來進行洗滌子步驟，優(yōu)選地包括約 50mM Tris (HCl)和約 0. 4 至約 0. 6M NaCl。任選地，在該洗滌子步驟后(并且在洗脫子步驟前)，使用補充了一種或多種中性凈化劑的相同溶液來進行另一個洗滌子步驟，優(yōu)選凈化劑選自Triton X-100、Triton X-114、Tween 20、Nonidet P-40、辛基葡糖苷、Brij !35、Brij 56，或其混合物，優(yōu)選地以約0. 至約存在于溶液中，并且接著進行第三個未用中性凈化劑的洗滌子步驟。通過使用鹽梯度進行第一個截留物級分的洗脫步驟(以收集第一個截留物并回收目標(多)核苷酸序列)，優(yōu)選地通過加入PH為約6至約10并且具有從約0. 4M遞增至約2M NaCl，優(yōu)選約0. 5至約IM NaCl的鹽濃度的緩沖溶液來形成鹽梯度。有利地，對于每種溶液，通過添加至少三倍柱體積來進行根據本發(fā)明方法的陰離子色譜的這些洗滌和洗脫(子)步驟，優(yōu)選對于每種溶液，通過添加(至少)五倍柱體積。本發(fā)明的方法優(yōu)選地進一步包括步驟h)在約30kDa膜上進行第一個截留物的超濾并收集(新)獲得的第二個(約30kDa)膜截留物，并可能在約0. 22 μ m膜上進行該(新) 獲得的(約30kDa)第二個截留物的(最終)過濾，以在滲透物中收集(從這些污染物或雜質)純化的(多)核苷酸序列，優(yōu)選本發(fā)明的質粒。有利地，本發(fā)明的方法使得現(xiàn)有技術的方法變得簡單并且成本降低，因為其有利地在室溫下進行約15°C至約35°C的溫度，優(yōu)選約20至約25°C的溫度。有利地，本發(fā)明的整個方法在室溫下進行(約15°C至約35°C的溫度)，除了步驟 d)在約4°C下進行，使用合適的可以用于獲得包含目標(多)核苷酸序列的溶液冷卻的培養(yǎng)基，以改進混合并避免核酸損壞。本發(fā)明還涉及用于進行該方法的裝置(設備、設施或成套裝備)，優(yōu)選地進行該方法的步驟b)至C)或所有步驟。有利地，本發(fā)明的裝置包括(或由其組成)用于獲得連續(xù)流動的部件，并且由一次性(單次使用)管狀元件制得，使用圓管形成，可能連接合適的存儲器或容器，并且具有用于引入培養(yǎng)基和細胞(或細胞級分)的入口部件和用于收集污染物和從收集的目標(多) 核苷酸序列中分離出來的培養(yǎng)基的出口部件，目標(多)核苷酸序列獲自這些細胞并從這些污染物中純化出來。有利地，本發(fā)明的管狀元件是根據用于人類藥物中的需求(藥物品質)。有利地，本發(fā)明的管狀元件是不可浙濾的。本發(fā)明的裝置包括(或由其組成)(第一個)泵1，具有約0. IL/分鐘至約IL/分鐘，優(yōu)選約0. 30L/分鐘的泵輸出，并連接到管狀元件2。在本發(fā)明的裝置中，該(第一個)泵1連接到能夠包含優(yōu)選懸浮于PH為約5至約 8緩沖的10% (ν ν)等滲水溶液中的細胞混合物的小瓶3(或相似的包括或呈現(xiàn)一定體積的容器)。本發(fā)明的裝置進一步包括置于管狀元件2末端的混合室4 (具有合適體積的容器或袋子)。優(yōu)選地，該管狀元件2具有0. 5m至約5m，優(yōu)選約1. 5m的總長度。該管狀元件2具有約5mm至約25mm的優(yōu)選內徑，優(yōu)選約7mm至約15mm，更優(yōu)選約 9mm 至約 Ilmm0本發(fā)明的裝置可以進一步包括(第二個)泵11，通過管狀元件14連接含有裂解溶液的存儲器13或容器，該泵具有約0. IL/分鐘至約IL/分鐘的泵輸出，優(yōu)選約0. 30L/分鐘，并通過該混合室4或等價容器連接到設備的(管狀)元件。有利地，混合室4裝備有一次性軌道式均質機。優(yōu)選地，混合室4是約11至約31的一次性圓錐形小瓶。6/10 頁有利地，(第二個)泵11的泵輸出等于第一個泵1的泵輸出。本發(fā)明的裝置可以進一步包括從該混合室4或等價容器開始的管狀元件12，這些管狀元件12具有約0. 5cm至約5cm，優(yōu)選約Icm至約2cm，更優(yōu)選約1. 27cm的內徑。管狀元件12有利地具有約5m至約60m，優(yōu)選約IOm至約30m，更優(yōu)選約20m至約 25m的總長度。優(yōu)選地，在管狀元件12開始處，本發(fā)明的裝置進一步包括(第三個)泵21，具有約
0.2至約3L/分鐘，優(yōu)選約0. 4至約IL/分鐘，更優(yōu)選約0. 61/分鐘的泵輸出。管狀元件12中的流動為約0. 2至約3L/分鐘，優(yōu)選約0. 4至約IL/分鐘，更優(yōu)選約0. 6L/分鐘。優(yōu)選地，(第三個)泵21的泵輸出等于管狀元件12的泵輸出。任選地，(第四個)泵31連接到管狀元件12的末端。該(第四個)泵31具有約0.2至約3L/分鐘，優(yōu)選約0.4至約IL/分鐘，更優(yōu)選約0. 6L/分鐘的泵輸出。優(yōu)選地，(第四個)泵31的泵輸出等于管狀元件12的泵輸出。所述(第四個)泵31在管狀元件12的末端與可能含有中和溶液的存儲器32 (具有適當體積的袋子或等價容器)連接，并通過Y-型(或T-型)接頭連接以形成管狀元件 33。優(yōu)選地，這些管狀元件33呈現(xiàn)部件34，以促使(促進)管狀元件33中的有效文丘里(混合)效應。優(yōu)選地，管狀元件33的內徑為約0. 5至約5cm，優(yōu)選約Icm至約2cm，更優(yōu)選約
1.27cm,除去用于促使(促進)上述文丘里(混合)效應的部件34 (這些管狀部件的直徑改變了)。該管狀部件33的長度為約Im至約20m，優(yōu)選約5m至約15m，更優(yōu)選約8m至約12m。有利地，通過將管狀元件33的內徑縮減約40% (約50%至約80%的初始內徑) 來促使(獲得或促進)該文丘里(混合)效應。如附

圖1中所示的泵的位置，由于如所示的各自的位置，也提高了處理效率，這些泵可以有利地推動管狀元件中流體(的流動)，替代牽引這些管狀元件中存在的流體，這樣的牽引移動可能促使管狀元件的扁平效應，這將改變待收集產物的品質。本發(fā)明的裝置進一步包括在管狀元件12或33的末端處連接的(第五個)泵41，并且呈現(xiàn)出約0. IL/分鐘至約IL/分鐘，優(yōu)選約0. 3L/分鐘的泵輸出，通過Y-型(或T-型) 接頭連接到管狀元件42。(第五個)泵41與含有沉淀溶液的存儲器43(適當體積的袋子或容器)連接并通過Y-型(或T-型)接頭連接于管狀元件42的開始處。有利地，本發(fā)明裝置的泵是蠕動泵。這些管狀元件42還可以包括部件44，以促使(促進)文丘里(混合)效應。有利地，通過將內徑縮減約40% (約50%至約80%的初始內徑)來促使(獲得或促進)管狀元件42中的這種文丘里(混合)效應。文丘里(混合)效應意思是從系統(tǒng)(促使)獲得的紊流，其中迫使層流中的流體在流體具有提高的速度和恰在縮減直徑后引起低壓的程度上通過縮減的管道。
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優(yōu)選地，將引起文丘里(混合)效應的部件放置在管狀元件33和/或42開始后的約1至約IOOcm處，優(yōu)選約5至約20cm，更優(yōu)選約9至約30cm，優(yōu)選管狀元件33和/或 42中的流動是層流之后。有利地，根據本發(fā)明的文丘里(混合)效應使得粘性(非牛頓)流體混合，形成適當?shù)木|液體。管狀部件42具有約Im至約45m的總長度，優(yōu)選約5m至約15m，更優(yōu)選約IOm至約 14m。管狀部件42具有約0. 5cm至約5cm的內部管徑，優(yōu)選約Icm至約2cm，更優(yōu)選約 1.27cm，除去產生這種文丘里(混合)效應的所述部件。優(yōu)選地，本發(fā)明的裝置進一步包括稱重不同存儲器(袋子或容器)中存在的(不同)料液的部件。本發(fā)明還涉及(從其污染物)新分離和純化的組合物，其包含可獲得的目標生物分析，優(yōu)選地通過上述方法獲得。更特別地，所獲得的這種純化和分離的生物分子是DNA質粒，包括具有低于3000 個堿基(堿基對)大小的DNA質粒。優(yōu)選地，本發(fā)明的這種純化和分離的質粒DNA組合物是至少無污染物的無基因組DNA、無RNA并且包括約40至約100內毒素單位/mg DNA (更優(yōu)選質粒DNA組合物包括約 55內毒素單位/mg DNA)。這種還有利地不含可能在本發(fā)明不同方法步驟中加入培養(yǎng)基中的化學物質(包括RNA酶)的組合物還可以對應于包含適當?shù)乃幬镙d體(或稀釋劑)和足量的(從其污染物純化的)上述這種目標生物分子的藥物組合物。有利地，本發(fā)明這種純化和分離的質粒DNA組合物至少是無污染物的無基因組 DNA、無RNA并且包括約0. 2至約100 (優(yōu)選約2至約10)內毒素單位/mg DNA。這種還有利地不含可能在本發(fā)明不同方法步驟中加入培養(yǎng)基中的化學物質(包括RNA酶)的組合物還可以對應于包含適當?shù)乃幬镙d體(或稀釋劑)和足量的(從其污染物純化的)上述這種目標生物分子的藥物組合物。有利地，質粒DNA組合物的內毒素含量為約55?；蛘?，質粒DNA組合物的內毒素含量為約0. 2至約2內毒素單位/mgDNA。術語“不含”意思是組合物中污染物的剩余含量低于2% (w w)，優(yōu)選低于 (w w)，或低于 0.5% 或 0. (w W)。在以下作為本發(fā)明的非限制性實施方案呈現(xiàn)的優(yōu)選實施例中，參照附圖描述了本發(fā)明。發(fā)明詳述圖1說明了根據本發(fā)明的裝置或設備，可以進行本發(fā)明方法的步驟3至c并且是用圓管(管狀元件)形成的約45. 6米長的一次性管。該裝置或設備插入包含以0. 30L/分鐘流動的收集細胞的管狀元件2中。在約1. 5m 處，具有0.30L/分鐘泵輸出的泵11連接到含有裂解溶液(用于分解細胞)的存儲器或容器13，其通過混合室4連接到管狀元件2。流動為0. 61/分鐘。任選地，在21. 3m處，另一個具有0. 61/分鐘泵輸出的泵31連接到含有中和溶液的存儲器32，其通過Y-型(或T-型)接頭連接，并且其中通過文丘里效應來促進均質非機械混合。在約9. 5m處，另一個具有0. 30L/分鐘泵輸出的泵41連接到含有沉淀溶液的存儲器43，其通過Y-型(或T-型)接頭連接，并且其中通過另一個文丘里效應來促進均質非機械混合。在約11. 8m處，存在用于收獲混合物的部件。 實施例培養(yǎng)物從氮氣瓶(_170°C )取出一小瓶GMP主種子(master seed)，并且在使用前5分鐘在室溫下解凍，然后在37°C下在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。使具有目標質粒的大腸桿菌生長至OD6tltl獲得0. 8單位。選擇該規(guī)格(0D_-純度) 下的一個培養(yǎng)物接種發(fā)酵罐。取出選定培養(yǎng)物的樣品用于質量控制Oic)測試。通過定期添加NaOH和HNO3，將pH維持在7. 0+/-0. 2。將溫度維持于37+/-0. 5°C，并且將氣流固定于lvvm( = 150L/分鐘)；將壓力調節(jié)至360mbar并且將攪拌固定于700RPM。 發(fā)酵過程中的發(fā)酵參數(shù)是恒定的。如果需要，加入少量消泡劑。在發(fā)酵15小時后，每小時取樣，以追蹤0D·。當0D_達到至少35個單位時，將培養(yǎng)物冷卻低于20°C。在冷卻步驟過程中，將攪拌和氣流各自降至200RPM和40L/分鐘。當培養(yǎng)物溫度低于20°C時，在無菌條件下取樣(用于QC測試)并且將培養(yǎng)物在兩個裝備有幾A-8. 1000轉子的Beckman Avanti J-20間歇式離心機中在6700g下離心20分鐘。收集沉淀并保存在4°C下，直至發(fā)酵罐收集(和離心)步驟結束。然后將沉淀重懸浮于用于裂解的無菌袋中，或存儲在_20°C下。裂解和過濾下文證明的生產規(guī)模對應于4000g新鮮細胞糊狀物，等于100L發(fā)酵罐中所生產批次的大約1/3。在18+/-3小時的過程中，將4000g新鮮細胞糊狀物在2_8°C下解凍。將解凍的懸浮液稀釋于RMl緩沖液中，以獲得401懸浮液(稀釋10倍的細胞糊狀物)。然后將懸浮液以0. 3L/分鐘引入通道中；參見圖1。有利地，因為通道是用于單次使用的，因此不需要清洗和/或凈化。使用連續(xù)系統(tǒng)進行裂解(細胞分解)，使用2步的緩沖液添加(60LRM2 :200mM NaOH ； 1 % w ν SDS 和 100L RM3 :3M CH3COOK, CH3COOH 15% ν ν)。將細胞懸浮液和RM2在混合室中在軌道式攪拌下(使用一次性使用的塑料(聚四氟乙烯PTFE)螺旋狀物)混合來進行裂解(細胞分解)的第一個步驟。發(fā)明人觀察到盡管裂解的溶液(分解的細胞)是粘稠的，但獲得了有效的均質，而沒有破壞質粒。發(fā)明人進一步優(yōu)化管道長度和泵輸出，以評價細胞和裂解混合物的最佳平均接觸時間。他們發(fā)現(xiàn)了他們研發(fā)的系統(tǒng)允許短的持續(xù)時間，如少于5分鐘，這有利地減少了受基因組DNA的污染，并且觀察到2或3分鐘的最佳時間。在管狀系統(tǒng)中進行了第二次緩沖液添加，利用管狀元件33中的文丘里(混合)效應。
發(fā)明人觀察到盡管中和的混合物非常粘稠，但文丘里的利用引起了所獲得的有效混合，而沒有破壞質粒(沒有在液體中形成高剪切力)。對于連續(xù)方法，細胞懸浮液和RM2培養(yǎng)基之間的接觸時間為5分鐘，而裂解的(分解的)細胞和RM3之間的接觸時間為一分鐘。然后將5M CaCl2. 2H20的溶液連續(xù)加入中和的懸浮液中，并且在通道中的接觸時間為1分鐘。有利地，不需要攪拌來確保該均質混合，因為上述通道包括具有文丘里(混合)效應的管狀結構，并且令人驚訝地可以形成均勻的溶液，即使在加入這種非常粘稠的溶液后。 因此，在本發(fā)明中沒有觀察到DNA分子的分解(已知在強烈攪拌或強剪切力下發(fā)生，必須給予高粘度的5MCaCl2溶液)。將混合物收集于3001袋子中并且存儲在2_8°C或室溫下過夜(20+/-4小時)，使其沉淀。發(fā)明人觀察到污染物沉淀(薄層)和浮選在混合物頂部(大部分)。因此，澄清的相在300L袋子的中部。將澄清的相(表示約80至90%)小心地從3001袋子中泵出(最小化袋子中液體的移動，以避免絮凝物的重懸浮)并且收集在2001 Tankliner中，并進一步在至少20分鐘內析出。將澄清的相在1. 5 μ m和兩個0. 2 μ m的三個濾器上連續(xù)過濾。收獲并存儲濾過的相。在IOOkDa PES膜上進行超濾，或者在70kDa膜上進行(對于短于3000個堿基對的質粒)。發(fā)明人測量了截留質粒的等份試樣的純度，并且觀察到約50至100內毒素單位 (EU)/mg DNA的污染，并且更常見地為約55EU/mg DNA。發(fā)明人推斷該水平是顯著的，因為尚未進行實質的純化步驟。然后將超濾的溶液滲析。將從污染物澄清得到的超濾過的溶液接受陰離子交換色譜。發(fā)明人測試了幾種陰離子交換色譜。本領域技術人員可以容易地發(fā)現(xiàn)最合適的一種。使用50mM Tris (-HC1)、0. 54M NaCl，pH8. 5 的溶液進行洗滌步驟。
任選，在用50mM Tris (-HC1)、0· 54Μ NaCl, ρΗ8· 5的洗滌步驟之前，用補充了 0. 1 至的曲通 Χ-100 的 50mM Tris (-HC1)、0. 54M NaCl，pH8. 5 進行一次洗滌。通過線性梯度進行洗脫，線性梯度由混合補充了 0. 54M NaCl的50mMTris (HCl) ρΗ8· 5的溶液和補充了 IM NaCl的50mM Tris (HCl) pH8. 5的溶液來形成。將洗脫過的材料在30kDa膜上超濾，然后將濃縮的截留物通過0.22 μ m濾器過濾， 收集濾器，并儲存在-20°C。通過HPLC未檢測到RNA水平(低于檢測極限)。蛋白含量低于10 μ g/mg質粒。在色譜步驟后，發(fā)明人測量了約2至約10單位/mg DNA的內毒素含量。通過顯色鱟裂解產物方法(KQCL)來測量內毒素。內毒素激活了 KQCL試劑中的酶原，其催化發(fā)色底物的分解，在整個培養(yǎng)階段中，在405nm處，通過光度連續(xù)測量。顏色消失需要的時間(反應時間)和內毒素之間的log/log相關性從0.005至50EU/ml是線性的。通過與含有已知含量的內毒素標品的反應時間相比，從其反應時間計算樣品中內毒素的濃度。當進行色譜步驟時，內毒素含量降至約1. 42單位/mg DNA。或者，當優(yōu)化整個過程時，包括色譜步驟，內毒素含量降至0. 2單位/mg DNA。質?；厥章蕿榧s30%。然而，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了以純度為代價時，可以提高該比率，并且本領域技術人員將根據實驗需要找到最好的解決辦法。
權利要求
1.一種用于獲得目標多核苷酸序列，優(yōu)選目標DNA質粒的方法，并且包括步驟a)可能培養(yǎng)包含一種或多種目標多核苷酸序列的細胞并收獲所述細胞；b)將所述含有目標多核苷酸序列的細胞引入通道中，并且通過將所述分解的細胞與堿性裂解溶液混合來連續(xù)地分解它們以形成裂解的細胞，并且使用中和溶液進行裂解細胞的中和步驟，所述中和溶液由醋酸/醋酸鹽組合物組成，以形成第一種混合物；c)通過將含有一種或多種鹽的溶液加入步驟b)的第一種混合物中以形成第二種混合物，在通道中連續(xù)進行多核苷酸序列污染物的沉淀，其中所述鹽選自CaCl2、MgCl2, ZnCl2, SrCl2和BaCl2、LiCl、醋酸銨、硫酸銨、硫酸鈉和硫酸鎂或其混合物；d)收集第二種混合物并且使沉淀物從第二種混合物的溶液中分離出來，優(yōu)選從第二種混合物的溶液中浮選和/或沉淀介于1小時和48小時之間的時間段；和e)從第二種混合物的溶液中收集包含目標多核苷酸序列的可溶性材料，同時排除收集第二種混合物的沉淀物。
2.權利要求1的方法，其中加入的鹽是2M至6M濃度的CaCl2。
3.根據之前的權利要求1至2任一項的方法，其中分解的細胞和堿性裂解溶液的接觸時間為15秒至15分鐘。
4.權利要求3的方法，其中分解的細胞和堿性裂解溶液的接觸時間為約2分鐘至約3 分鐘。
5.根據之前的權利要求1至4任一項的方法，其中裂解的細胞和中和溶液的接觸時間為15秒至5分鐘。
6.之前的權利要求1至5任一項的方法，其進一步包括步驟f)在一個或多個具有 0. 22 μ m至1. 5 μ m孔徑的濾器上進行收集的可溶性材料的過濾步驟，可能接著在50kDa至 500kDa膜上進行可溶性材料的超濾，并且收集包含目標多核苷酸序列的第一個截留物。
7.根據權利要求6的方法，進一步包括步驟g)進行第一個截留物的陰離子交換色譜。
8.之前的任一項權利要求的方法，進一步包括步驟h)在30kDa膜上進行第一個截留物的超濾，收集第二個截留物，和此第二個截留物在0. 22 μ m膜上過濾，以收集目標多核苷酸序列。
9.根據之前的權利要求1至8任一項的方法，其中在室溫下，優(yōu)選在15°C至35°C的溫度下進行(方法)步驟。
10.根據之前的權利要求1至8任一項的方法，其中通過使用蠕動泵連續(xù)進行(方法) 步驟b)和c)，并且其中通過稱重進料溶液的小瓶來控制所述泵輸出。
11.一種用于進行根據之前的權利要求1至10任一項的方法的裝置，其由圓管形成，并且包括-具有0. IL/分鐘至IL/分鐘的泵輸出并且連接到含有細胞混合物的小瓶( 和管狀元件O)的(第一個)泵(1)，所述管狀元件O)；-混合室⑷；_(第二個)泵(11)，具有0.11/分鐘至11/分鐘的泵輸出，并且通過所述混合室(4) 連接到該裝置的其他元件；-從所述混合室(4)開始的管狀元件，具有0. 5cm至5cm的內徑，和5m至60m的長度；-任選地，泵(31)，在管狀部件(12)的末端與存儲器(32)連接，通過Y-型接頭連接以形成管狀元件(33)，并且優(yōu)選地具有約0. 2至約3L/分鐘的輸出；-泵(41)，其連接于管狀元件(12或33)的末端，其具有0. IL/分鐘至IL/分鐘的泵輸出，并且其通過Y-型接頭連接到管狀元件G2)；-部件(34，44)，以引發(fā)管狀元件(33或42)中的文丘里效應； -其中管狀元件G2)具有Im至50m的總長，和0. 5cm至5cm的內徑，排除所述誘導這些管狀元件(33或42)中的文丘里效應的部件(34，44)。
12.權利要求11的裝置，其中泵是蠕動泵。
13.權利要求11或12的裝置，進一步包括稱重不同進料溶液的部件。
14.通過根據之前的權利要求1至11任一項的方法可獲得的分離且純化的DNA質粒組合物，其無基因組DNA、無RNA并且包括0. 2至100內毒素單位/mg DNA。
15.權利要求14的質粒，具有約2至10EU/mgDNA的內毒素。
16.權利要求14的質粒，具有約50至100EU/mgDNA的內毒素。
17.權利要求16的質粒，具有約55EU/mgDNA的內毒素。
18.權利要求14的質粒，具有約0.2至2EU/mg DNA的內毒素。
19.根據之前的權利要求14至18任一項的組合物，其是藥物組合物，進一步包含適當?shù)乃幬镙d體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于獲得目標(多)核苷酸序列的裝置和方法，并且包括步驟培養(yǎng)宿主細胞以產生目標核苷酸序列并收獲這些細胞，將這些細胞引入通道中并且在連續(xù)過程中分解它們，在該連續(xù)過程中，通過將這些分解的細胞與含有一種或多種鹽的溶液混合并且獲得混合物，在通道中進行污染物的沉淀，使沉淀物從該混合物的溶液中分離出來，優(yōu)選地從該混合物的溶液中浮選和/或沉淀1-48小時，并且從該溶液中泵出可溶性材料，同時排除收集沉淀物。
文檔編號C12N15/10GK102449150SQ201080022840
公開日2012年5月9日 申請日期2010年5月26日 優(yōu)先權日2009年5月26日
發(fā)明者P·勒登 申請人:歐洲生物技術股份有限公司