本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
我國是馬鈴薯生產(chǎn)和消費(fèi)大國，隨著國家馬鈴薯主食化戰(zhàn)略的提出和實(shí)施，作為主食化基本原料的馬鈴薯淀粉市場需求量將會迅速增加。然而目前我國馬鈴薯淀粉加工生產(chǎn)過程會產(chǎn)生大量的廢水，每生產(chǎn)1噸淀粉約產(chǎn)生7噸左右的廢水。廢水直接排放會導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化等環(huán)境問題，必須經(jīng)處理達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)后才能排放入水體等環(huán)境中。而大部分企業(yè)受到技術(shù)成本等因素的限制，處理的積極性不高，往往存在偷偷排放的違法行為。因此簡單易行，且能增加企業(yè)生產(chǎn)效益的馬鈴薯淀粉加工廢水的資源化處理技術(shù)受到加工企業(yè)的青睞。
解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生抑菌蛋白、脂肽類及聚酮類化合物等抑菌活性物質(zhì)，在生物醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)生物防治和食品抑菌保鮮領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。培養(yǎng)基是進(jìn)行相關(guān)抑菌活性物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)的基礎(chǔ)，其成本是制約產(chǎn)品工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)和市場應(yīng)用的重要因素。
目前解淀粉芽孢桿菌抑菌活性物質(zhì)合成培養(yǎng)基組成相對均較為復(fù)雜，如研究使用較多的Landy培養(yǎng)基等，包含了多種微量元素和無機(jī)鹽成分，原料成本相對較高。而在通用培養(yǎng)基中，雖然馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基利用了馬鈴薯作為原料，但并不能解決馬鈴薯淀粉加工廢液的處理問題。
重要的是，目前利用馬鈴薯淀粉廢液作為主要原料的培養(yǎng)基并不能使得解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，而僅僅只能供細(xì)菌進(jìn)行菌體生長繁殖(如“Bioconversion of potato starch wastewater into biofertilizer by Bacillus amyloliquefaciens for improving tea yield”和《檸檬酸廢水和馬鈴薯淀粉廢水資源化培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用》)，這極大的限制了解淀粉芽孢桿菌對馬鈴薯淀粉廢水資源的充分利用。
因此，本領(lǐng)域亟需一種成本低且能使得解淀粉芽孢桿菌分泌抑菌活性物質(zhì)的以馬鈴薯淀粉廢液為主要原料的培養(yǎng)基。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由如下組分組成：
如本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)例所示，利用本發(fā)明的培養(yǎng)基對解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，可使其分泌抑菌活性物質(zhì)，從而對金黃色葡萄球菌有抑菌作用。而利用“Bioconversion of potato starch wastewater into biofertilizer by Bacillus amyloliquefaciens for improving tea yield”和《檸檬酸廢水和馬鈴薯淀粉廢水資源化培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用》所報(bào)道的培養(yǎng)基，均不能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)。
需要指出的是，本發(fā)明并不限于只進(jìn)行1L培養(yǎng)基的配制，只要按照上述配方比例制備得到的培養(yǎng)基，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述培養(yǎng)基的pH為7.0±0.2。
所述馬鈴薯廢水的制作方法為：馬鈴薯削皮切塊后，按質(zhì)量比1:4加水打汁，過濾后離心，取上清液，即得。
優(yōu)選的，所述馬鈴薯廢水的制作方法為：馬鈴薯削皮切塊后，按質(zhì)量比1:4加水絞碎打汁，靜置15min，用四層紗布過濾，濾液靜置2h后，在8000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液，即得。
優(yōu)選的，所述養(yǎng)基由如下組分組成：
優(yōu)選的，所述養(yǎng)基由如下組分組成：
本發(fā)明的有益效果：
1、本發(fā)明的培養(yǎng)基能使得解淀粉芽孢桿菌分泌抑菌活性物質(zhì)；
2、本發(fā)明的培養(yǎng)基成分簡單，成本低廉。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只是用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容所做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1
按如下配方制備培養(yǎng)基：
其中，馬鈴薯淀粉廢水由如下方法獲得：馬鈴薯削皮切塊后，按質(zhì)量比1:4加水絞碎打汁，靜置15min，用四層紗布過濾，濾液靜置2h后，在8000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液，即得。
實(shí)施例2
按如下配方制備培養(yǎng)基：
其中，馬鈴薯淀粉廢水由如下方法獲得：馬鈴薯削皮切塊后，按質(zhì)量比1:4加水絞碎打汁，靜置15min，用四層紗布過濾，濾液靜置2h后，在8000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液，即得。
實(shí)施例3
按如下配方制備培養(yǎng)基：
其中，馬鈴薯淀粉廢水由如下方法獲得：馬鈴薯削皮切塊后，按質(zhì)量比1:4加水絞碎打汁，靜置15min，用四層紗布過濾，濾液靜置2h后，在8000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液，即得。
實(shí)施例4
按如下配方制備培養(yǎng)基：
其中，馬鈴薯淀粉廢水由如下方法獲得：馬鈴薯削皮切塊后，按質(zhì)量比1:4加水絞碎打汁，靜置15min，用四層紗布過濾，濾液靜置2h后，在8000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液，即得。
對比實(shí)施例1
按“Bioconversion of potato starch wastewater into biofertilizer by Bacillus amyloliquefaciens for improving tea yield”的記載，配制馬鈴薯廢液培養(yǎng)基。
對比實(shí)施例2
按《檸檬酸廢水和馬鈴薯淀粉廢水資源化培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用》中第3.1.1部分的記載，配制發(fā)酵培養(yǎng)基。
實(shí)施例
抑菌實(shí)驗(yàn)
1.1供試菌株
解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens PC2，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO：M2015435；金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusATCC25923。
1.2培養(yǎng)基
牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(g/L)：牛肉浸膏5.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、葡萄糖10.0、瓊脂10.0，pH 7.0±0.2。用于抑菌活性檢測。
馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基：取已去皮切塊的馬鈴薯200g，加水煮沸30min，紗布過濾，20g/L葡萄糖，補(bǔ)水至1L，調(diào)節(jié)pH 7.0±0.2。用于解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)與活化。
1.3馬鈴薯淀粉廢水制備
實(shí)驗(yàn)室模擬制備馬鈴薯淀粉廢水：馬鈴薯削皮切塊后，按質(zhì)量比1:4加水絞碎打汁，靜置15min，用四層紗布過濾，濾液靜置2h后，在8000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液作為實(shí)驗(yàn)廢水，調(diào)整pH到7.0±0.2。
1.4發(fā)酵液抑菌肽的制備
挑取解淀粉芽孢桿菌新鮮斜面接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(250mL搖瓶，裝液量100mL)，37℃、160r/min搖床培養(yǎng)24h作為種子液。取解淀粉芽孢桿菌種子液接種于淀粉廢水發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)。取發(fā)酵液于4℃、10000r/min離心10min，上清液用孔徑0.45μm濾膜過濾獲得去細(xì)胞發(fā)酵液。取10mL無菌發(fā)酵液，緩慢加入硫酸銨調(diào)節(jié)飽和度至60％，4℃靜置12h，10000r/min、4℃離心20min，收集沉淀，加入0.02mol/LpH 7.0磷酸鹽緩沖液5mL溶解，透析12h除鹽，獲得抑菌肽溶液。
1.5抑菌活性檢測
挑取金黃色葡萄球菌新鮮斜面接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基250mL搖瓶，裝液量100mL，37℃、160r/min搖床培養(yǎng)24h，獲得指示菌菌懸液。采用改良雙層平板法檢測抑菌活性：在直徑9cm的無菌培養(yǎng)皿中加入10mL牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，冷卻凝固作為底層平板。將無菌牛津杯(外徑8mm)均勻置于底層平板表面，再加入20mL冷卻至約50℃的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，冷卻凝固后取出牛津杯，作為抑菌活性檢測指示平板。在此平板上加200μL指示菌菌懸液，涂布均勻，然后在牛津杯孔中加入解淀粉芽孢桿菌抑菌肽溶液100μL，37℃培養(yǎng)12h，用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈的直徑，以抑菌圈直徑(mm)表示抑菌活性大小。
1.6培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化
采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選外加碳源、氮源、無機(jī)鹽等篩選影響發(fā)酵液抑菌活性的關(guān)鍵因素，最陡爬坡試驗(yàn)確定主要因素響應(yīng)面設(shè)計(jì)的最適范圍，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化并驗(yàn)證結(jié)果。結(jié)果見1。根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果可知：蔗糖30.2g/L、谷氨酸鈉3.96g/L、(NH4)2SO46.0g/L，馬鈴薯淀粉廢水1000mL，可達(dá)到發(fā)酵液抑菌圈的最大預(yù)測響應(yīng)值21.30mm。通過該優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，平均抑菌圈直徑為21.74mm，與預(yù)測值21.30mm非常接近，發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果可靠。
表1發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果
表2對比實(shí)施例抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果