本發(fā)明涉及一株新篩選的枯草芽孢桿菌CF-3及其培養(yǎng)方法。

背景技術：

果蔬采后因病原菌引起的果蔬腐爛造成了嚴重的經濟損失。長期以來為了控制采后果蔬的病害發(fā)生，主要采用化學殺菌劑的方法，但是化學殺菌劑的使用往往容易引起病原菌抗藥性的產生，影響食品的安全性，造成環(huán)境污染等問題，生物保鮮方法被認為是最具有潛力的方法之一。所以，高效低毒低殘留且與環(huán)境相容性好的果蔬采后保鮮方法成為了現在研究的熱點。

枯草芽孢桿菌是一種對許多植物病原生物具有拮抗作用的非病原微生物，其代謝系統(tǒng)發(fā)達，能夠產生對高溫、干旱和紫外線照射等不良環(huán)境具有良好抵御能力的內生芽孢，而且具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力，安全，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境，能產生多種拮抗物質和一些高分子量的拮抗蛋白質，包括磷脂類、氨基酸類、核酸類、肽類、脂肽類與多烯類等多種化合物，具有潛在的醫(yī)學應用與病害防治的價值，能夠抑制病毒、細菌、真菌和菌原體等，并且在其生長代謝過程中還會產生許多揮發(fā)性物質(VOCs)，包括酯類、酮類、酸類、醛類與醇類等，在抑制病原菌生長方面也有不同程度上的功效。因此在生物防治殺菌劑中占主導地位，具有廣闊的應用前景。

病原真菌侵染一直是影響果蔬采后品質的主要原因，目前國內和國際上有許多關于利用生防菌防治植物病害的文獻報道，對生防菌應用于果蔬采后真菌病害的防治作用研究較少，從整體上來看，抑菌譜窄、效力低是影響生防菌商業(yè)化應用的主要問題，因而篩選抑菌譜廣、效力高的生防菌應用于果蔬采后生物防治成為一個新的研究熱點。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供了一株新的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株，已于2016年3月15日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學校內(武漢大學第一附小對面)，武漢大學保藏中心,保藏名為Bacillus subtilis CF-3，保藏編號CCTCC No:M 2016125。

本發(fā)明的目的之二在于提供了該菌株的分離及培養(yǎng)方法。該枯草芽孢桿菌菌株是從購買的豆腐乳中分離、篩選而得，將每塊豆腐乳(10克)放入裝有100mL無菌水的錐形燒瓶中震蕩10分鐘，連續(xù)稀釋至1～1×10^-6倍，制備稀釋液；將1mL不同濃度的懸液與冷卻至55～60℃滅菌的NA固體培養(yǎng)基(牛肉浸膏5.0g，酵母浸膏5.0g，魚粉蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000mL，pH值7.0～7.2)混合，待其凝固后在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；待平板上長出菌落后，挑取單個菌落分別接種于NA固體培養(yǎng)基進行平板培養(yǎng)；隨后采用劃線法對病原真菌進行菌絲抑制實驗，選取抑制效果良好的生防菌菌株，于20mL滅菌的NA液體培養(yǎng)基中(牛肉浸膏5.0g，酵母浸膏5.0g，魚粉蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，蒸餾水1000mL，pH值7.0～7.2)，37℃，150rpm，搖瓶培養(yǎng)24h后，采用平板劃線分離純化，再次進行病原真菌的抑制實驗，二次篩選后選取對病原真菌抑制效果最好的菌株，經過形態(tài)學以及生理生化與DNA鑒定后，命名為枯草芽孢桿菌CF-3。

在NA固體培養(yǎng)基(牛肉浸膏5.0g，酵母浸膏5.0g，魚粉蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000mL，pH值7.0～7.2)及NA液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時間為24～48小時，在NA液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)時轉速為150rpm。在以上條件下，該菌株鑒定特征如下：為桿狀細菌，革蘭氏染色陽性，具有周生鞭毛，無莢膜。NA固體培養(yǎng)基：菌落顏色為淡黃色，半透明至不透明，邊緣比中心厚。NA液體培養(yǎng)基：接種培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)液為不透明的棕黃色液體。該菌生防活性具有紫外光穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性等優(yōu)點，以對荔枝炭疽菌的抑制率為指標，CF-3發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、復合碳源、氮源、復合氮源、微量元素的最優(yōu)的種類和濃度為甘露醇34.64g/L，玉米漿粉20.87g/L，果糖10g/L，硝酸鉀濃度為1g/L，硫酸亞鐵濃度為0.13g/L，氯化鈣濃度為0.1g/L，pH為7.2。該菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一株枯草芽孢桿菌CF-3，該菌株的保藏編號CCTCC No:M 2016125。

一種制備上述的一株枯草芽孢桿菌CF-3的方法，其特征在于該方法的具體步驟為：將每10克豆腐乳放入裝有100mL無菌水的錐形燒瓶中震蕩10分鐘，連續(xù)稀釋至1～1×10^-6倍，制備稀釋液；將1mL不同濃度的稀釋液與冷卻至55～60℃滅菌的NA固體培養(yǎng)基混合，待其凝固后在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；待平板上長出菌落后，挑取單個菌落分別接種于NA固體培養(yǎng)基進行平板培養(yǎng)；隨后采用劃線法對病原真菌進行菌絲抑制實驗，選取抑制效果良好的生防菌菌株，于20mL滅菌的NA液體培養(yǎng)基中，37℃，150rpm，搖瓶培養(yǎng)24h后，采用平板劃線分離純化，再次進行病原真菌的抑制實驗，二次篩選后選取菌株，經過形態(tài)學以及生理生化與DNA鑒定后，命名為枯草芽孢桿菌CF-3。

上述的NA固體培養(yǎng)基為：牛肉浸膏5.0g，酵母浸膏5.0g，魚粉蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000mL，pH值7.0～7.2。

上述的NA液體培養(yǎng)基為：牛肉浸膏5.0g，酵母浸膏5.0g，魚粉蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，蒸餾水1000mL，pH值7.0～7.2。

與現有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：該菌株對多達8種導致采后水果腐爛的常見病原真菌生長具有明顯的抑制作用，抑菌譜廣、效力高，并且其發(fā)酵條件簡單，制備容易，可應用于果蔬采后保鮮。

附圖說明

附圖1為實施例2中枯草芽孢桿菌CF-3的顯微鏡照片。

附圖2為實施例3中枯草芽孢桿菌CF-3的系統(tǒng)發(fā)育樹。

附圖3為實施例4中枯草芽孢桿菌CF-3的發(fā)酵培養(yǎng)液對于番茄灰葡萄孢霉菌(Botrytis Cinerea，A組。A1為空白對照組，A2為處理組，后面以此類推)、草莓灰葡萄孢霉菌(Botrytis Cinerea，B組)與3株荔枝炭疽菌(Colletotrictum gloeos，C、D、E組)的抑制作用。

附圖4為實施例4中枯草芽孢桿菌CF-3的發(fā)酵培養(yǎng)液對于蘋果黑腐皮殼菌(Valsa mali Miyabe et Yamada，F組。F1為空白對照組，F2為處理組，后面以此類推)、擴展青霉菌(Penicillium expansum，G組)、桃褐腐菌(Monilinia fructicola，H組)、仁果莖點霉菌(Phoma pomirum Thum，I組)與鏈格孢霉(Alternaria alternata(Fr.)Keissler，J組)的抑制作用。

具體實施方式

以下結合說明書附圖和具體實施例進行進一步解釋本發(fā)明，但不對本發(fā)明構成任何限定。以下實施例中除了特殊說明外，均為本領域常規(guī)試劑與方法步驟。

實施例1：枯草芽孢桿菌CF-3的分離純化

該枯草芽孢桿菌菌株是采用稀釋平板法從購買的豆腐乳中分離、篩選而得。將每塊豆腐乳(10克)放入裝有100毫升無菌水的錐形燒瓶中震蕩10分鐘，之后連續(xù)稀釋至10^-6倍，制備稀釋液；將1毫升不同濃度的懸液與冷卻至55～60℃滅菌的NA固體培養(yǎng)基中混合，倒入培養(yǎng)皿中，待其凝固后在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；待平板上長出菌落后，挑取單個菌落分別接種于NA固體培養(yǎng)基進行平板培養(yǎng)；隨后采用劃線法對病原真菌進行菌絲抑制實驗，選取抑制效果良好的生防菌菌株，于20mL滅菌的NA液體培養(yǎng)基中，37℃，150rpm，搖瓶培養(yǎng)24h后，采用平板劃線分離純化，再次進行病原真菌的抑制實驗，二次篩選后選取對病原真菌抑制效果最好的菌株，經過形態(tài)學以及生理生化與DNA鑒定后，命名為枯草芽孢桿菌CF-3。

該菌株CF-3的保存方法：短期保存采用NA斜面培養(yǎng)基4℃保存。長期保存采用甘油保存法，在甘油管中加入1mL 50％的甘油，再加入1mL菌液，使甘油最終濃度為25％，-80℃保存。

其制備方法為：

1.培養(yǎng)方法：將菌種接種于NA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于37℃的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24～48小時。

2.發(fā)酵方法：NA種子培養(yǎng)基中最佳培養(yǎng)時間24h，再按照接種量1：20接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵液pH為7.0～7.2，溫度控制在37℃，轉速為150rpm，發(fā)酵時間為24小時。NA培養(yǎng)基的滅菌方式為：121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。

實施例2：枯草芽孢桿菌CF-3的生物學性狀以及生理生化特性的鑒定

1.形態(tài)特征:

枯草芽孢桿菌CF-3在電鏡下形態(tài)見于圖1，該枯草芽孢桿菌在平板上37℃下培養(yǎng)24小時的菌落呈淡黃色，圓形，表面光滑半透明至不透明，邊緣整齊且比中心厚；革蘭氏染色呈陽性，菌體桿狀，具有周身鞭毛，無莢膜。顯微鏡照片見附圖1。

2.生理生化特征：

枯草芽孢桿菌CF-3其生長最適溫度為37℃，最適pH為7.0～7.2。其余如表1所示。

表1枯草芽孢桿菌CF-3的生理生化特性

注：“+”表示陽性或生長，“-”表示陰性或不生長

實施例3：枯草芽孢桿菌CF-3的16S rDNA的序列測定與分析

1.PCR模版DNA的提?。?/p>

由寶日醫(yī)(TAKARA)生物技術公司生產的DNA提取試劑盒提取

2.16S rDNA基因PCR擴增：

PCR引物由寶日醫(yī)(TAKARA)生物技術公司生產

上游引物Primer A：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’(SEQ ID NO:2)

下游引物Primer B：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ ID NO:3)

PCR反應體系如表2所示：

表2PCR反應體系

PCR擴增循環(huán)條件：首先94℃5分鐘循環(huán)1次；接著按照94℃1分鐘、50～55℃1分鐘、72℃1.5分鐘的順序循環(huán)30次；最終72℃5分鐘循環(huán)1次。

3.序列測定：

PCR產物純化之后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，其序列如SEQ ID NO:1所示，該序列在DNA GeneBank中的注冊號為KU531732。該序列與NCBI數據庫中已知的序列進行BLAST比較分析，并從數據庫中獲得相關種屬的16S rDNA序列，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，見于圖2。經比較分析發(fā)現，枯草芽孢桿菌CF-3與菌株(Bacillus subtilis PPB11)親緣關系最近。

綜合16S rDNA序列分析以及生理生化等特性分析，標明本發(fā)明屬于枯草芽孢桿菌，命名為枯草芽孢桿菌CF-3(Bacillus subtilis CF-3)，該菌于2016年3月15日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學校內(武漢大學第一附小對面)，武漢大學保藏中心,保藏名為Bacillus subtilis CF-3，保藏編號CCTCC No:M 2016125。

實施例4：枯草芽孢桿菌CF-3對病原真菌的抑菌效果

1.枯草芽孢桿菌CF-3發(fā)酵培養(yǎng)液的制備：

將枯草芽孢桿菌CF-3放置于NA瓊脂培養(yǎng)基上37℃活化培養(yǎng)24h，然后用接種針取一環(huán)，置于種子液體培養(yǎng)基(NA液體培養(yǎng)基)中37℃恒溫150rpm震蕩培養(yǎng)24h，調整菌體濃度約為1×10⁸CFU/mL。培養(yǎng)結束之后，按5％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基(NA液體培養(yǎng)基)中進行發(fā)酵培養(yǎng)，37℃恒溫150rpm震蕩培養(yǎng)24h。即得到枯草芽孢桿菌CF-3的發(fā)酵培養(yǎng)液。

2.枯草芽孢桿菌CF-3發(fā)酵培養(yǎng)液直接接觸對真菌的抑制實驗：

吸取20μL的枯草芽孢桿菌CF-3培養(yǎng)液用涂布棒均勻涂抹于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，然后將直徑為7mm的病原真菌直接接種于該培養(yǎng)基的中心。將處理后的培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中，28℃培養(yǎng)7d，以無菌水為空白對照，每個樣品設三個平行，通過測量病原真菌的生長直徑，計算抑制率，觀察抑菌效果。

抑制率計算公式：

3.實驗結果：

由附圖3與附圖4可知，枯草芽孢桿菌CF-3的發(fā)酵培養(yǎng)液對于番茄灰葡萄孢霉菌(Botrytis Cinerea，A組。A1為空白對照組，A2為處理組，后面以此類推)、草莓灰葡萄孢霉菌(Botrytis Cinerea，B組)、3株荔枝炭疽菌(Colletotrictum gloeos，C、D、E組)、蘋果黑腐皮殼菌(Valsa mali Miyabe et Yamada，F組)、擴展青霉菌(Penicillium Expansum，G組)、桃褐腐菌(Monilinia Fructicola，H組)、仁果莖點霉菌(Phoma pomirum Thum，I組)與鏈格孢霉(Alternaria alternata(Fr.)Keissler，J組)有非常好的抑制效果，幾乎完全抑制了病原真菌的生長。

表3枯草芽孢桿菌CF-3對病原菌的抑制效果

A-番茄灰葡萄孢霉菌 B-草莓灰葡萄孢霉菌 C-荔枝炭疽菌09619-1-1

D-荔枝炭疽菌09626 E-荔枝炭疽菌09627 F-蘋果黑腐皮殼菌

G-擴展青霉菌 H-桃褐腐菌 I-仁果莖點霉菌 J-鏈格孢霉

抑制率如表3所示。

<110> 上海大學

<120> 枯草芽孢桿菌CF-3及其培養(yǎng)方法

<160> 3

<210> 1

<211> 1278

<212> DNA

<213> 菌株

<400> 1

GATTT GATCT TGGCT ATGAC GACGC TGGCG GCGTG CCTAA TACAT GCAAG TCGAG CGGAC 60

AGATG GGAGC TTGCT CCCTG ATGTT AGCGG CGGAC GGGTG AGTAA CACGT GGGTA ACCTG 120

CCTGT AAGAC TGGGA TAACT CCGGG AAACC GGGGC TAATA CCGGA TGGTT GTTTG AACCG 180

CATGG TTCAG ACATA AAAGG TGGCT TCGGC TACCA CTTAC AGATG GACCC GCGGC GCATT 240

AGCAA GTTGG TGAGG TAACG GCTCA CCAAG GCGAC GATGC GTAGC CGACC TGAGA GGGTG 300

ATCGG CCACA CTGGG ACTGA GACAC GGCCC AGACT CCTAC GGGAG GCAGC AGTAG GGAAT 360

CAACC GCAAT GGACG AAAGT CTGAC GGAGC AACGC CGCGT GAGTG ATGAA GGTTT TCGGA 420

TCGTA AAGCT CTGTT GTTAG GGAAG AACAA GTGCC GTTCA AATAG GGCGG CACCT TGACG 480

GTACC TAACC AGAAA GCCAC GGCTA ACTAC GTGCC AGCAG CCGCG GTAAT ACGTA GGTGG 540

CAAGC GTTGT CCGGA ATTAT TGGGC GTAAA GGGCT CGCAG GCGGT TTCTT AAGTC TGATG 600

TGAAA GCCCC CGGCT CAACC GGGGA GGGTC ATTGG AAACT GGGGA ACTTG AGTGC AGAAG 660

AGGAG AGTGG AATTC CACGT GTAGC GGTGA AATGC GTAGA GATGT GGAGG AACAC CAGTG 720

GCGAA GGCGA CTCTC TGGTC TGTAA CTGAC GCTGA GGAGC GAAAG CGTGG GGAGC GAACA 780

GGATT AGATA CCCTG GTAGT CCACG CCGTA AACGA TGAGT GCTAA GTGTT AGGGG GTTTC 840

CGCCC CTTAG TGCTG CAGCT AACGC ATTAA GCACT CCGCC TGGGG AGTAC GGTCG CAAGA 900

CTGAA ACTCA AAGGA ATTGA CGGGG GCCCG CACAA GCGGT GGAGC ATGTG GTTTA ATTCG 960

AAGCA ACGCG AAGAA CCTTA CCAGG TCTTG ACATC CTCTG ACAAT CCTAG AGATA GGACG 1020

TCCCC TTCGG GGGCA GAGTG ACAGG TGGTG CATGG TTGTC GTCAG CTCGT GTCGT GAGAT 1080

GTTGG GTTAA GTCCC GCAAC GAGCG CAACC CTTGA TCTTA GTTGC CAGCA TTCAG TTGGG 1140

CACTC TAAGG AGACT GCCGG TGACA AACCG GAGGA AGGTG GGGAT GACGT CAAAT CATCA 1200

TGCCC CTTAT GACCT GGGCT ACACA CGTGC TACAA TGGAC AGAAC AAAGG GCAGC GAAAC 1260

CGCGA GGTTA AGCCA ATCCC ACAAA TCTGT TCTCA GTTCG GATCG CAGTC TGCAA CTCGA 1320

CTGCG TGAAG CTGGA ATCGC TAGTA ATCGC GGATC AGCAT GCCGC GGTGA ATACG TTCCC 1380

GGGCC TTGTA CACAC CGCCC GTCAC ACCAC GAGAG TTTGT AACAC CCGAA GTCGG TGAGG 1440

TAACC TTTAT GGAGC CAGCC GCCGA AGGTG GGACA GATGA TGGGG GAAGT CGTAA CAAGT 1500

TCC 1503

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

GAGCG GATAA CAATT TCACA CAGG 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

CGCCA GGGTT TTCCC AGTCA CGAC 24