本發(fā)明涉及一種微生物芽孢制備領(lǐng)域，具體涉及一種芽孢桿菌芽孢的純化方法。
背景技術(shù)：
芽孢是在一定條件下，細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)高度濃縮脫水所形成的一種抗逆性很強(qiáng)的休眠體，其具有極強(qiáng)的抗逆性，可耐受高溫、低溫、干燥、化學(xué)藥物、營養(yǎng)缺乏等惡劣環(huán)境；依據(jù)其特點(diǎn)，芽孢桿菌的芽孢在各領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。
由于芽孢桿菌的芽孢在顆粒料、粉料的加工過程中以及酸性環(huán)境中具有較高穩(wěn)定性，儲(chǔ)藏時(shí)間長，部分益生芽孢桿菌芽孢作為微生物添加劑，被用于飼料添加劑、口服益生菌制劑等，如枯草芽孢桿菌。同時(shí)，芽孢作為目前整個(gè)微生物界中抗逆性最強(qiáng)的生命體，在抗熱，抗化學(xué)藥物和抗輻射等方面，抵抗力極強(qiáng)，因此是否能消滅芽孢是衡量各種消毒滅菌手段的最重要的指標(biāo)。
生物指示劑以芽孢為指示菌株，用以監(jiān)測(cè)消毒滅菌效果，是判斷滅菌效果的金標(biāo)準(zhǔn)。比如，嗜熱脂肪芽孢桿菌(ATCC 7953)芽孢被用于監(jiān)測(cè)壓力蒸汽滅菌、過氧化氫低溫等離子體滅菌等，枯草芽胞桿菌黑色變種(ATCC 9372)芽胞被用于監(jiān)測(cè)環(huán)氧乙烷滅菌、干熱滅菌等。
芽孢的純度及芽孢抗力是準(zhǔn)確評(píng)價(jià)各種因子對(duì)醫(yī)療器械消毒與滅菌效果的前提。依據(jù)中國藥典及美國藥典的要求，生物指示劑中的芽孢數(shù)量、芽孢與菌體營養(yǎng)細(xì)胞的比例必須達(dá)到一定程度，才能較好的反映滅菌效果。
目前，芽孢生產(chǎn)制備的方案較多，主要集中在提高產(chǎn)孢數(shù)量和芽孢產(chǎn)率方面，但芽孢率均未能達(dá)到100％。因此，為達(dá)到更充分的利用效果，需要對(duì)生產(chǎn)制備的芽孢進(jìn)行分離純化，除去其中的細(xì)菌營養(yǎng)細(xì)胞、其他培養(yǎng)基殘留營養(yǎng)、及菌體裂解產(chǎn)生的酶等芽孢活化因子(誘導(dǎo)芽孢轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)細(xì)胞)。
在現(xiàn)有研究文獻(xiàn)中，將達(dá)到一定芽孢率的芽孢、菌體混合物收集，采用如下方法純化芽孢：
(1)離心法：如將混合物2000rpm離心，(芽孢為白色，菌體及培養(yǎng)基雜質(zhì)近乎灰色)，芽孢位于離心管底部，菌體雜質(zhì)位于芽孢上面，通過用小心刮取，去除菌體雜質(zhì)。
(2)熱激法：將裝載混合物的離心管，置于100℃水浴，加熱5min。離心3次，去除上清，獲得芽孢沉淀。
(3)玻璃珠破碎法：將混合物中加入玻璃珠，渦旋震蕩，破碎5min不等。再紗布過濾，收集后離心洗滌3次，懸于純水，4℃保存。
上述三種方法缺點(diǎn)分別為：(1)離心法：操作可控性差。(2)熱激可能激活芽孢，使之發(fā)芽轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)細(xì)胞。(3)玻璃珠破碎法：芽孢損失嚴(yán)重。且這三種方法的操作性較差，純度不能達(dá)到100％，工藝放大衰減嚴(yán)重，重現(xiàn)性較差。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提出一種芽孢桿菌芽孢的純化方法，其在不損傷芽孢，保證芽孢抗力的前提下，去除芽孢懸液中的培養(yǎng)基殘留營養(yǎng)、菌體營養(yǎng)細(xì)胞及破裂營養(yǎng)細(xì)胞釋放的蛋白酶等活性物質(zhì)，保證芽孢在水溶液中長期保存。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
一種芽孢桿菌芽孢的純化方法，其包括以下步驟：
1)無菌水洗滌：將芽孢桿菌芽孢粗品用無菌水在5000rpm、4℃下離心洗滌；并將芽孢桿菌芽孢的濃度調(diào)節(jié)至105-108/mL，得到芽孢菌體混合液；
2)重鹽洗滌：向所述芽孢菌體混合液中加入5-15倍重量的重鹽洗液，混勻，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉淀一；
3)酶溶液孵育：向所述沉淀一中加入酶消化液，懸浮沉淀，調(diào)節(jié)芽孢濃度至104-106/mL，37℃水浴加熱1h后，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉淀二；
4)表面活性劑溶液洗滌：向所述沉淀二中加入表面活性劑溶液，使芽孢濃度達(dá)到104-106/mL，混勻后，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉淀三；
5)酶抑制劑溶液洗滌：向沉淀三中加入酶抑制劑溶液，混勻后，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉淀四；
6)無菌水洗滌：向所述沉淀四加入無菌水(洗去殘留的洗滌劑和雜質(zhì))，震蕩混勻后，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉淀五；再次加入無菌水，混勻，置于80℃水浴中滅菌20min，離心；最終得到的芽孢桿菌芽孢以無菌水混懸，保存。
優(yōu)選的是，所述的芽孢桿菌芽孢的純化方法，其中，所述高鹽溶液包括有1M的KCl、0.5M的NaCl和無菌水。高鹽溶液的作用是改變滲透壓，使菌體脫水。
優(yōu)選的是，所述的芽孢桿菌芽孢的純化方法，其中，所述酶消化溶液包括有50μg/ml的溶菌酶和無菌水。溶菌酶有破壁的功能，能去除菌體。
優(yōu)選的是，所述的芽孢桿菌芽孢的純化方法，其中，所述表面活性劑溶液包括有0.05wt％的十二烷基硫酸鈉和無菌水。表面活性劑溶液可使蛋白變性，從而去除營養(yǎng)物質(zhì)及菌體裂解物質(zhì)。
優(yōu)選的是，所述的芽孢桿菌芽孢的純化方法，其中，所述酶抑制劑溶液包括有50mM的Tris-HCl緩沖液、10mM的EDTA、2mM的苯甲基磺酰氟和無菌水。酶抑制劑溶液的作用是抑制酶活性、除去離子等。
優(yōu)選的是，所述的芽孢桿菌芽孢的純化方法，其中，所述高鹽溶液還包括有0.1M的ZnCl2。
優(yōu)選的是，所述的芽孢桿菌芽孢的純化方法，其中，所述高鹽溶液還包括有0.1M的AlCl3。
本發(fā)明的有益效果是：
1、本案在保證制備的芽孢數(shù)量的同時(shí)，極大提高了芽孢純度；
2、通過本案純化方法可有效去除菌體營養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)基殘留物質(zhì)及破裂營養(yǎng)細(xì)胞釋放的蛋白酶等活性物質(zhì)，有效避免上述物質(zhì)對(duì)芽胞的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化；更利于芽孢懸液在水溶液中的長期保存；
3、本工藝操作簡單，工藝易于放大，衰減小，重復(fù)性好，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
實(shí)施例1
一種芽孢桿菌芽孢的純化方法，其包括以下步驟：
1)無菌水洗滌：將芽孢桿菌芽孢粗品(投放量1g)用無菌水在5000rpm、4℃下離心洗滌；并將芽孢桿菌芽孢的濃度調(diào)節(jié)至108/mL，得到芽孢菌體混合液；
2)重鹽洗滌：向芽孢菌體混合液中加入15倍重量的重鹽洗液，混勻，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉淀一；
3)酶溶液孵育：向沉淀一中加入酶消化液，懸浮沉淀，調(diào)節(jié)芽孢濃度至106/mL，37℃水浴加熱1h后，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉淀二；
4)表面活性劑溶液洗滌：向沉淀二中加入表面活性劑溶液，使芽孢濃度達(dá)到106/mL，混勻后，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉淀三；
5)酶抑制劑溶液洗滌：向沉淀三中加入酶抑制劑溶液，混勻后，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉淀四；
6)無菌水洗滌：向沉淀四加入無菌水，震蕩混勻后，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉淀五；再次加入無菌水，混勻，置于80℃水浴中滅菌20min，離心；最終得到的芽孢桿菌芽孢以無菌水混懸，保存。
其中，高鹽溶液包括有1M的KCl、0.5M的NaCl和無菌水。
其中，酶消化溶液包括有50μg/ml的溶菌酶和無菌水。
其中，表面活性劑溶液包括有0.05wt％的十二烷基硫酸鈉和無菌水。
其中，酶抑制劑溶液包括有50mM的Tris-HCl緩沖液、10mM的EDTA、2mM的苯甲基磺酰氟和無菌水。
結(jié)果分析：純化前，芽孢桿菌芽孢粗品的芽孢純度為89％；純化后，芽孢純度為97％，芽孢數(shù)量保持在108/mL，未發(fā)生損失。
實(shí)施例2
一種芽孢桿菌芽孢的純化方法，其包括以下步驟：
1)無菌水洗滌：將芽孢桿菌芽孢粗品(投放量1g)用無菌水在5000rpm、4℃下離心洗滌；并將芽孢桿菌芽孢的濃度調(diào)節(jié)至105/mL，得到芽孢菌體混合液；
2)重鹽洗滌：向芽孢菌體混合液中加入5倍重量的重鹽洗液，混勻，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉淀一；
3)酶溶液孵育：向沉淀一中加入酶消化液，懸浮沉淀，調(diào)節(jié)芽孢濃度至104/mL，37℃水浴加熱1h后，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉淀二；
4)表面活性劑溶液洗滌：向沉淀二中加入表面活性劑溶液，使芽孢濃度達(dá)到104/mL，混勻后，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉淀三；
5)酶抑制劑溶液洗滌：向沉淀三中加入酶抑制劑溶液，混勻后，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉淀四；
6)無菌水洗滌：向沉淀四加入無菌水，震蕩混勻后，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉淀五；再次加入無菌水，混勻，置于80℃水浴中滅菌20min，離心；最終得到的芽孢桿菌芽孢以無菌水混懸，保存。
其中，高鹽溶液包括有1M的KCl、0.5M的NaCl和無菌水。
其中，酶消化溶液包括有50μg/ml的溶菌酶和無菌水。
其中，表面活性劑溶液包括有0.05wt％的十二烷基硫酸鈉和無菌水。
其中，酶抑制劑溶液包括有50mM的Tris-HCl緩沖液、10mM的EDTA、2mM的苯甲基磺酰氟和無菌水。
結(jié)果分析：純化前，芽孢桿菌芽孢粗品的芽孢純度為88％；純化后，芽孢純度為97％，芽孢數(shù)量保持在同一數(shù)量級(jí)，未發(fā)生損失。
實(shí)施例3
將實(shí)施例1的投放量放大100倍，其余與實(shí)施例1相同。
結(jié)果分析：純化前，芽孢桿菌芽孢粗品的芽孢純度為89％；純化后，芽孢純度為96％，芽孢數(shù)量保持在108/mL，未發(fā)生損失。
實(shí)施例4
將實(shí)施例1的投放量放大10000倍，其余與實(shí)施例1相同。
結(jié)果分析：純化前，芽孢桿菌芽孢粗品的芽孢純度為89％；純化后，芽孢純度為95％，芽孢數(shù)量保持在108/mL，未發(fā)生損失。
實(shí)施例5
高鹽溶液中還包括有0.1M的ZnCl2，其余與實(shí)施例1相同。
結(jié)果分析：純化前，芽孢桿菌芽孢粗品的芽孢純度為89％；純化后，芽孢純度為98％，芽孢數(shù)量保持在108/mL，未發(fā)生損失。
實(shí)施例6
將實(shí)施例5的投放量放大10000倍，其余與實(shí)施例5相同。
結(jié)果分析：純化前，芽孢桿菌芽孢粗品的芽孢純度為89％；純化后，芽孢純度為96.5％，芽孢數(shù)量保持在108/mL，未發(fā)生損失。
實(shí)施例7
高鹽溶液中還包括有0.1M的AlCl3，其余與實(shí)施例5相同。
結(jié)果分析：純化前，芽孢桿菌芽孢粗品的芽孢純度為89％；純化后，芽孢純度＞99％，芽孢數(shù)量保持在108/mL，未發(fā)生損失。
實(shí)施例8
將實(shí)施例7的投放量放大10000倍，其余與實(shí)施例7相同。
結(jié)果分析：純化前，芽孢桿菌芽孢粗品的芽孢純度為89％；純化后，芽孢純度為98％，芽孢數(shù)量保持在108/mL，未發(fā)生損失。
上述數(shù)據(jù)表明，將投放量放大后，所得結(jié)果沒有發(fā)生明顯衰減，說明該工藝穩(wěn)定，具備量產(chǎn)基礎(chǔ)。
本案發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)工藝環(huán)節(jié)中，重鹽洗滌的效果對(duì)最終芽孢純度和工藝穩(wěn)定性的影響最大，因?yàn)樗淖饔檬鞘咕w脫水，而脫水效果的好壞將直接影響后續(xù)其他工藝步驟的實(shí)施，因此，對(duì)重鹽洗液配方的改進(jìn)就顯得尤為重要。實(shí)施例5說明了鋅離子的加入有利于芽孢純度在一定程度上的提升；實(shí)施例7說明了鋁離子能夠與鋅離子產(chǎn)生協(xié)效作用，共同提高菌體脫水的效率，從而改善最終芽孢的純度。
表1是對(duì)本工藝重復(fù)性的考察，列出了實(shí)施例4、實(shí)施例6和實(shí)施例8分別重復(fù)10次所得到的芽孢純度的浮動(dòng)情況：
表1
表1表明鋅離子和鋁離子可以減小芽孢純度的波動(dòng)幅度，提高該工藝的重復(fù)性，利于在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)保證產(chǎn)品質(zhì)量。而鋅離子和鋁離子的組合使用相較于單獨(dú)添加鋅離子可以獲得更高的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。
盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)。