本發(fā)明屬生物工程技術(shù)與應(yīng)用領(lǐng)域，具體地涉及一種生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒桿菌工程菌株及構(gòu)建及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

5-氨基乙酰丙酸，分子量為131.13，熔點為118℃。是一種非蛋白氨基酸。由于5-氨基乙酰丙酸具有副作用小、滲透性好的的特點，已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于皮膚癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌的診斷以及光動力治療(PDT)中。

5-氨基乙酰丙酸是生物體內(nèi)吡咯化合物的前體物，具有廣泛的應(yīng)用。在農(nóng)業(yè)上，由于5-氨基乙酰丙酸在環(huán)境中容易降解，對哺乳動物無害，可以選擇性殺死害蟲，因此可以作為光動力學(xué)殺蟲劑被廣泛的應(yīng)用。除此之外，5-氨基乙酰丙酸在提高農(nóng)作物的抗凍害和耐鹽能力以及調(diào)節(jié)植物生長等方面也受到了人們的廣泛關(guān)注。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，5-氨基乙酰丙酸作為第二代光敏劑，不僅可以用于局部或全身的皮膚癌的治療，還可用于膀胱癌、消化道癌以及肺癌等癌癥的診斷。

據(jù)檢索，現(xiàn)在尚未有將谷氨酸棒桿菌5-氨基乙酰丙酸運輸?shù)鞍谆蜻^表達以提高5-ALA產(chǎn)量的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒桿菌工程菌株。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒桿菌工程菌株的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒桿菌工程菌株的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒桿菌工程菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)在谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032中敲除乳酸脫氫酶編碼基因ldhA和乙酸生成基因pta-ackA、pqo和cat，得到的菌株命名為CG4；在CG4菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因ppc前面插入sod啟動子，得到菌株CG5；在CG5菌株中敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶編碼基因pck，得到菌株CG6；

(2)在菌株CG6中轉(zhuǎn)入構(gòu)建好的過表達5-氨基乙酰丙酸合酶基因的質(zhì)粒pXA，得到生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒桿菌工程菌株L；

(3)在菌株L中轉(zhuǎn)入構(gòu)建好的過表達5-氨基乙酰丙酸運輸?shù)鞍踪|(zhì)粒pEP-Ncgl0580，得到生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒桿菌工程菌株L2。

上述方法構(gòu)建的生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒桿菌工程菌株L2。

上述生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒桿菌工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的用途。

本發(fā)明構(gòu)建的生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒桿菌工程菌株能促進5-氨基乙酰丙酸向谷氨酸棒桿菌胞外的運輸，從而使得5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量得到顯著提高。與對照菌株比較，5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量提高了100.4％。

附圖說明

圖1為質(zhì)粒pXA的酶切驗證圖譜。

圖2為基因Ncgl0580過表達的PCR驗證圖譜。

圖3為工程菌株L、L1、L2在搖瓶中的發(fā)酵結(jié)果。

具體實施方式

機理：將Ncgl0580基因過表達質(zhì)粒(pEP-Ncgl0580)導(dǎo)入生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒桿菌的工程菌株，能夠促進5-氨基乙酰丙酸向谷氨酸棒桿菌胞外的運輸，從而使得5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量得到顯著提高。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，下述實施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但對本發(fā)明不作任何限制。

本發(fā)明所用到的：

原始菌株谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)ATCC 13032購于ATCC(American Type Culture Collection，http://www.atcc.org/)；購買時間：2013.10，美國

原始質(zhì)粒pK18mobsacB、pEC-XK99E、pXMJ19和pEP2購買于BioVector NTCC公司(http://www.biovector.net/)。

5-氨基乙酰丙酸標準品從sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)購買。所用限制性內(nèi)切酶、去磷酸化酶、DNA連接酶等分子生物學(xué)試劑從Thermo公司購買(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)，所用其他生化試劑從生工生物工程(上海)股份有限公司購買(http://www.sangon.com/)。

實施例1：敲除質(zhì)粒pD-sacB的構(gòu)建和過表達5-氨基乙酰丙酸合酶基因質(zhì)粒pXA的構(gòu)建

pD-sacB質(zhì)粒的構(gòu)建

首先以HindIII切割后的pK18mobsacB線性片段作為模板，用如下引物sacB-1/sacB-2擴增sacB基因。將sacB基因片段經(jīng)過MunI/EcoRV雙酶切后與經(jīng)過EcoRI/SmalI雙酶切后的質(zhì)粒pEC-XK99E進行連接，得到質(zhì)粒pEC-XK99E-sacB。用如下的引物trcsacB-1/trcsacB-2，以pEC-XK99E-sacB質(zhì)粒作為模板擴增含有trc啟動子的trcsacB片段。

用如下的引物pD-1/pD-2，以pK18mobsacB質(zhì)粒作為模板擴增含有卡那霉素抗性和大腸桿菌復(fù)制子的pD片段，最后將經(jīng)過AatII酶切的片段trcsacB和經(jīng)過相同酶切的pD片段進行連接，得到質(zhì)粒pD-sacB。

pXA質(zhì)粒的構(gòu)建

將類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)的5-氨基乙酰丙酸合酶基因hemA根據(jù)谷氨酸棒桿菌的密碼子偏好性進行密碼子優(yōu)化，將優(yōu)化后的hemA基因用全基因合成的方法進行合成(如SEQ ID NO.39所示)，利用引物hemA-1/hemA-2擴增優(yōu)化后的hemA片段(SEQ ID NO.39)，將得到的hemA片段經(jīng)過PstI/XbaI雙酶切后與經(jīng)過相同雙酶切后的穿梭質(zhì)粒pXMJ19連接，得到pXA質(zhì)粒，質(zhì)粒pXA的酶切驗證圖譜見圖1。

實施例2：乳酸脫氫酶編碼基因ldhA的敲除和乙酸生成途徑基因pta-ackA、pqo和cat的敲除

乳酸脫氫酶編碼基因ldhA的敲除：

以谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)ATCC 13032基因組為模板，以ldh-1/ldh-2為引物擴增基因ldhA的上游片段，ldh-3/ldh-4為引物擴增基因ldhA的下游片段。將兩個片段切膠回收后，以等摩爾比例的片段為模板，以ldh-1/ldh-4為引物，擴增得到兩個片段的融合產(chǎn)物。將融合后的片段用EcoRI/HindIII雙酶切與經(jīng)過同樣雙酶切后的pD-sacB連接，得到質(zhì)粒pD-ldhA。

將pD-ldhA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到C.glutamicum ATCC 13032中，用卡那霉素篩選重組成功的陽性克隆，挑出的轉(zhuǎn)化子接種于5mL BHIS液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm過夜培養(yǎng)，將菌液稀釋1000倍涂布在BHIS-Sucrose固體平板上。將平板上長出的菌落對點無抗的BHIS固體平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固體平板。選擇在無抗平板上生長而卡那霉素平板不生長的菌落接種到5mL BHIS液體培養(yǎng)基中，提取基因組，使用引物ldh-1/ldh-4進行PCR驗證，得到ldhA基因敲除菌株CG1。

pta-ackA操縱子的敲除

以C.glutamicum ATCC13032基因組為模板，以ackA-1/ackA-2為引物擴增操縱子pta-ackA的上游片段，ackA-3/ackA-4為引物擴增操縱子pta-ackA的下游片段。將兩個片段切膠回收后，以等摩爾比例的片段為模板，以ackA-1/ackA-4為引物，擴增得到兩個片段的融合產(chǎn)物。將融合后的片段用SalI/XbaI雙酶切與經(jīng)過同樣雙酶切后的pD-sacB質(zhì)粒連接，得到pta-ackA操縱子敲除質(zhì)粒pD-pta。

將pD-pta質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到菌株CG1中，用卡那霉素篩選重組成功的陽性克隆，挑出的轉(zhuǎn)化子接種于5mL BHIS液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm過夜培養(yǎng)，將菌液稀釋1000倍涂布在BHIS-Sucrose固體平板上。將平板上長出的菌落對點無抗的BHIS固體平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固體平板。選擇在無抗平板上生長而卡那霉素平板不生長的菌落接種到5mLBHIS液體培養(yǎng)基中，提取基因組，使用引物ackA-1/ackA-4進行PCR驗證，在CG1的基礎(chǔ)上得到pta-ackA操縱子敲除菌株CG2。

pqo基因的敲除

以C.glutamicum ATCC13032基因組為模板，以pqo-1/pqo-2為引物擴增pqo基因的上游片段，pqo-3/pqo-4為引物擴增pqo的下游片段。將兩個片段切膠回收后，以等摩爾比例的片段為模板，以pqo-1/pqo-4為引物，擴增得到兩個片段的融合產(chǎn)物。將融合后的片段用XbaI/PstI雙酶切與經(jīng)過同樣雙酶切后的pD-sacB連接，得到pqo基因的敲除質(zhì)粒pD-pqo。

將pD-pqo質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到菌株CG2中，用卡那霉素篩選重組成功的陽性克隆，挑出的轉(zhuǎn)化子接種于5mL BHIS液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm過夜培養(yǎng)，將菌液稀釋1000倍涂布在BHIS-Sucrose固體平板上。將平板上長出的菌落對點無抗的BHIS固體平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固體平板。選擇在無抗平板上生長而卡那霉素平板不生長的菌落接種到5mLBHIS液體培養(yǎng)基中，提取基因組，使用引物pqo-1/pqo-4進行PCR驗證，在CG2的基礎(chǔ)上得到pqo基因的敲除菌株CG3。

cat基因的敲除

以C.glutamicum ATCC13032基因組為模板，以cat-1/cat-2為引物擴增cat基因的上游片段，cat-3/cat-4為引物擴增cat的下游片段。將兩個片段切膠回收后，以等摩爾比例的片段為模板，以cat-1/cat-4為引物，擴增得到兩個片段的融合產(chǎn)物。將融合后的片段用XbaI/SalI雙酶切與經(jīng)過同樣雙酶切后的pD-sacB連接，得到cat基因的敲除質(zhì)粒pD-cat。

將pD-cat質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到菌株CG3中，用卡那霉素篩選重組成功的陽性克隆，挑出的轉(zhuǎn)化子接種于5mL BHIS液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm過夜培養(yǎng)，將菌液稀釋1000倍涂布在BHIS-Sucrose固體平板上。將平板上長出的菌落對點無抗的BHIS固體平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固體平板。選擇在無抗平板上生長而卡那霉素平板不生長的菌落接種到5mL BHIS液體培養(yǎng)基中，提取基因組，使用引物cat-1/cat-4進行PCR驗證，在CG3的基礎(chǔ)上得到cat基因的敲除菌株CG4。

其中BHIS培養(yǎng)基成分為(g/L)：牛腦心浸粉37，山梨醇91，余量為水。

BHIS固體培養(yǎng)基成分為(g/L)：牛腦心浸粉37，山梨醇91，瓊脂2％(W/V)，余量為水

BHIS-Sucrose固體培養(yǎng)基(g/L)：牛腦心浸粉37，山梨醇91，瓊脂2％(W/V)，蔗糖10％(W/V)，余量為水。

實施例3：在ppc基因前面插入強的sod啟動子和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶編碼基因pck的敲除

ppc基因前面插入sod啟動子

以C.glutamicum ATCC13032基因組為模板，以ppc-1/ppc-2為引物擴增基因ppc的上游片段。sod-1/sod-2用于擴增sod基因的啟動子。ppc-3/ppc-4用于擴增ppc基因的下游片段，分別將3個片段切膠回收后，以等摩爾比例的片段為模板，用ppc-1/ppc-4為引物，擴增得到三個片段的融合產(chǎn)物。將融合后的片段用XbaI/HindIII雙酶切后與經(jīng)過同樣雙酶切后的質(zhì)粒載體pD-sacB連接。得到質(zhì)粒pD-ppc。

將構(gòu)建好的質(zhì)粒pD-ppc利用電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入到菌株CG4中，用卡那霉素篩選重組成功的陽性克隆，挑出的轉(zhuǎn)化子接種于5mL BHIS液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm過夜培養(yǎng)，將菌液稀釋1000倍涂布在BHIS-Sucrose固體平板上。將平板上長出的菌落對點無抗的BHIS固體平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固體平板。將在無抗平板上生長而卡那霉素平板不生長的菌落接種到5mLBHIS液體培養(yǎng)基中，提取基因組，送測序，在CG4的基礎(chǔ)上得到在ppc基因前面插入sod啟動子的菌株CG5。

pck基因的敲除

以C.glutamicum ATCC 13032基因組為模板，用如下引物進行PCR擴增。pck-1/pck-2用于擴增基因pck的上游片段。pck-3/pck-4用于擴增基因pck的下游片段。將上游片段經(jīng)過EcoRI/XbaI雙酶切后與經(jīng)過相同雙酶切后的pD-sacB質(zhì)粒連接，得到質(zhì)粒pD-pck(F)，將構(gòu)建的質(zhì)粒pD-pck(F)經(jīng)過PstI/HindIII雙酶切后與經(jīng)過PstI/HindIII雙酶切的下游片段進行連接，得到pD-pck質(zhì)粒。

將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到菌株CG5中，用卡那霉素篩選重組成功的陽性克隆，挑出的轉(zhuǎn)化子接種于5mL BHIS液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm過夜培養(yǎng)，將菌液稀釋1000倍涂布在BHIS-Sucrose固體平板上。將平板上長出的菌落對點無抗的BHIS固體平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固體平板。將在無抗平板上生長而卡那霉素平板不生長的菌落接種到5mL BHIS液體培養(yǎng)基中，提取基因組，使用引物pck-1/pck-4進行PCR驗證，在CG5的基礎(chǔ)上得到pck基因的敲除菌株CG6。

將pXA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到CG6中，用氯霉素進行篩選，得到帶有pXA質(zhì)粒的5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株L。

實施例4：過表達質(zhì)粒pEP-tuf的構(gòu)建和過表達運輸?shù)鞍踪|(zhì)粒的構(gòu)建

pEP-tuf的構(gòu)建

以C.glutamicum ATCC 13032基因組為模板，用如下引物進行PCR擴增。tuf-1/tuf-2用于擴增tuf啟動子編碼的基因。將擴增片段經(jīng)過EcoRI/SalI雙酶切后與經(jīng)過相同酶切后的pEP2質(zhì)粒連接。得到過表達質(zhì)粒pEP-tuf。

將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到菌株L中，用卡那霉素和氯霉素篩選重組成功的陽性克隆，30℃，將能夠在雙抗平板上生長的菌落接種到5mL BHIS液體培養(yǎng)基中，使用引物tuf-1/tuf-2進行菌液PCR驗證，得到菌株L1。

pEP-Ncgl0580的構(gòu)建

以C.glutamicum ATCC 13032基因組為模板，用下列引物進行PCR擴增。Ncgl0580-1/Ncgl0580-2用于擴增基因Ncgl0580。將擴增片段經(jīng)過XbaI/SaclI雙酶切后與經(jīng)過相同酶切后的pEP-tuf質(zhì)粒連接。得到Ncgl0580基因過表達質(zhì)粒pEP-Ncgl0580。

將pEP-Ncgl0580質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到菌株L中，用卡那霉素和氯霉素篩選重組成功的陽性克隆，30℃，將能夠在雙抗平板上生長的菌落接種到5mL BHIS液體培養(yǎng)基中，使用引物Ncgl0580-1/Ncgl0580-2進行菌液PCR驗證，得到菌株L2，見圖2。

表1菌株構(gòu)建所用引物序列(人工合成)

實施例6：利用構(gòu)建的菌株進行5-氨基乙酰丙酸的搖瓶發(fā)酵

將菌株L、L1(對照)、L2在M2培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。

菌株L接種方式為：首先在BHIS固體平板上活化菌株，在30℃培養(yǎng)至菌落可視時，挑單菌落接種至裝有終濃度為10μg/mL氯霉素的BHIS液體培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)15小時左右，轉(zhuǎn)接到含有相應(yīng)抗生素的M1培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)至OD₆₀₀＝10左右時，將種子接種到M2培養(yǎng)基進行發(fā)酵，培養(yǎng)基中添加終濃度為10μg/mL的氯霉素和0.5mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在30℃，pH為7.0，220rpm，發(fā)酵30h。

菌株L1、L2接種方式為：首先分別在BHIS固體平板上活化菌株，在30℃培養(yǎng)至菌落可視時，挑單菌落接種至裝有終濃度為8μg/mL氯霉素和終濃度為20μg/mL卡那霉素的BHIS液體培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)15小時左右，分別轉(zhuǎn)接到含有相應(yīng)抗生素M1培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)至OD₆₀₀＝10左右時，將種子接種到M2培養(yǎng)基進行發(fā)酵，并在培養(yǎng)基中添加終濃度為8μg/mL氯霉素和終濃度為20μg/mL卡那霉素和0.5mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在30℃，pH為7.0，220rpm，發(fā)酵30h。

發(fā)酵結(jié)果見圖3。

M1培養(yǎng)基成分為(g/L)：葡萄糖10，酵母抽提物10，胰蛋白胨10，NaCl 2.5，余量為水。

M2培養(yǎng)基成分為(g/L)：葡萄糖10，酵母提取物7.5，硫酸氨10，磷酸二氫鉀1，磷酸氫二鉀1，七水硫酸鎂0.1，氯化鈣0.02，3-(N-嗎啉)丙磺酸21，甘氨酸7.5，余量為水。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津大學(xué)

<120> 生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒桿菌工程菌株

<130>

<160> 39

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cgtgccaatt ggataaagca ggcaagacct a 31

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cgtgcgatat cccatcggca ttttcttttg cgt 33

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

agctctgacg tcttatcatc gactgcacgg tgca 34

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

agctctgacg tccccatcgg cattttcttt tgcgt 35

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

agctctgacg tcaaccccag agtcccgctc agaagaa 37

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

agctctgacg tcatgatcct ccagcgcggg gatctcat 38

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

aatacgctgc agaaggagat atagatatgg actacaacct cgccctcg 48

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

aatctctaga ttatgcgacg acctcggcg 29

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atcggaattc ccaaggtgcc gacactaat 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cggtgatttc gcaactccaa catctcctg 29

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ttggagttgc gaaatcaccg accacgaga 29

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ccggaagctt gcttccagac ggtttcatc 29

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

aggctctaga ccacgaacct tccagatcag 30

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

ggaggcatcg gtggaaatca gaatccatcg aagctgcggt 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

accgcagctt cgatggattc tgatttccac cgatgcctcc 40

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

atgcgtcgac tgagtgaatc ccgcatccga 30

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

agagtctaga gttttcgagg cgaccagaca g 31

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

catccgatca aggaaggaac gcaccgcaga acaaagtgac ag 42

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ctgtcacttt gttctgcggt gcgttccttc cttgatcgga tg 42

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

agagaagctt gttaagcgct cgcggtcaat g 31

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

aggctctaga aaggaatcgc agaaccgcca 30

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

agccgttctt agccaggttg ccggagaaac caaccttgtc 40

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

gacaaggttg gtttctccgg caacctggct aagaacggct 40

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

atgcgtcgac gctgcggctg attttgctga 30

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

agataagctt aaatccgtga agctggcacc 30

<210> 26

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

cccggaataa ttggcagcta taactacttt aaacactctt tcac 44

<210> 27

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

gtgaaagagt gtttaaagta gttatagctg ccaattattc cggg 44

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<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

gtcatcgcgt aaaaaatcag tcatgggtaa aaaatccttt cgta 44

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<212> DNA

<213> 人工合成

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tacgaaagga ttttttaccc atgactgatt ttttacgcga tgac 44

<210> 30

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<212> DNA

<213> 人工合成

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agattctaga atgcgacggc ggatgttctt 30

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<212> DNA

<213> 人工合成

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atgagaattc tgtttgttaa taaatgggtt c 31

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<213> 人工合成

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agcgtctaga tacttctcca gattttgtgt c 31

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<212> DNA

<213> 人工合成

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gtcgacctgc aggcagttca cgcttaagaa ctg 33

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<212> DNA

<213> 人工合成

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gacgaagctt cgaacaaacc cgacctgac 29

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<212> DNA

<213> 人工合成

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aatcgaattc tggccgttac cctgcgaatg 30

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<212> DNA

<213> 人工合成

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atcagtcgac gagctccgat aggatccagg tatctagatg tatgtcctcc tggactt 57

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<212> DNA

<213> 人工合成

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agcctctaga aaggagatat agatatgaat aaacagtccg ctgc 44

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<212> DNA

<213> 人工合成

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tagcgagctc ttaactaggt gtgtgtactc 30

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 39

atggactaca acctcgccct cgataccgcc ctcaaccgtc tgcacactga aggccgctac 60

cgcaccttca tcgacatcga acgccgcaaa ggcgccttcc ctaaagccat gtggcgcaaa 120

cctgatggct ccgagaaaga gatcaccgtc tggtgcggca acgactacct gggtatgggt 180

cagcacccag tcgtgctcgg tgcaatgcac gaagccctgg attctactgg tgccggttcc 240

ggcggtaccc gcaacatctc tggtaccacc ctgtatcaca agcgcctgga agcagagctc 300

gccgatctcc acggtaagga agccgccctg gtgttctctt ccgcctatat cgccaacgac 360

gccactctgt ccactctgcc tcaactcatc ccaggcctcg tgatcgtctc cgacaagctc 420

aatcacgcct ccatgatcga gggcattcgc cgttctggca ccgagaagca catcttcaaa 480

cataatgacc tggacgacct ccgccgtatc ctgacttcta tcggcaagga tcgcccaatc 540

ctcgtggcct tcgagtccgt ctactccatg gacggcgact ttggtcgcat cgaggagatc 600

tgcgatatcg ccgacgagtt cggcgccctc aagtacatcg atgaggtgca cgccgtgggt 660

atgtacggtc ctcgcggtgg tggtgtcgcc gaacgtgatg gcctgatgga ccgcatcgac 720

atcattaacg gcaccctcgg caaggcctac ggcgtgttcg gtggctacat cgccgcctct 780

tctaagatgt gtgacgccgt ccgttcctat gcacctggct tcatcttctc cacttccctc 840

ccacctgtgg tggcagcagg tgcagcagca tctgtccgcc atctgaaggg tgacgtcgag 900

ctgcgcgaga aacatcagac ccaggcacgt atcctcaaga tgcgcctgaa aggcctgggc 960

ctgccaatca ttgaccacgg ctcccacatc gtgccagtgc atgtcggcga tcctgtgcac 1020

tgcaaaatga tctccgacat gctcctggag cacttcggca tctacgtcca gcctatcaac 1080

ttcccaaccg tccctcgtgg taccgaacgc ctgcgtttca ctccatcccc tgtgcatgac 1140

tccggcatga tcgaccatct ggtcaaggcc atggacgtgc tctggcagca ttgcgccctc 1200

aatcgcgccg aggtcgtcgc ataa 1224