本發(fā)明涉及一種利用生物柴油副產(chǎn)物甘油合成D-乳酸的重組菌及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)的發(fā)展，化石能源日益匱乏，由可再生原料合成生物燃料成為世界性研究熱點(diǎn)。生物柴油是一種重要生物燃料，生產(chǎn)呈逐年增加趨勢。生物柴油的生產(chǎn)，會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物甘油。據(jù)估算，每生產(chǎn)10噸生物柴油大約生成1噸粗甘油。甘油的大規(guī)模剩余，致使其價(jià)格處于持續(xù)偏低水平，已經(jīng)成為一種資源豐富、價(jià)格低廉、亟待開發(fā)的碳源物質(zhì)。
D-乳酸是一種重要的平臺(tái)化合物，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥和化妝品等行業(yè)。高光學(xué)純度D-乳酸可以作為聚乳酸的優(yōu)良單體。將D-乳酸聚合單體以一定比例加入聚L-乳酸后，聚乳酸的機(jī)械性能、熱力學(xué)性能等都會(huì)得到改善，熔點(diǎn)能夠提高50℃左右。全球D-乳酸的需求量約2.6萬噸，每年都以6％～8％的速度增長。全球聚乳酸市場每年約以20％～30％的速率增長；隨著聚乳酸市場的逐漸推廣，D-乳酸的需求量將進(jìn)一步增加。
D-乳酸的合成方法主要有化學(xué)合成法、微生物酶法和微生物發(fā)酵法，綜合考慮光學(xué)純度、生產(chǎn)成本、產(chǎn)物濃度以及環(huán)境污染等因素，微生物發(fā)酵法存在一定優(yōu)勢。D-乳酸的發(fā)酵菌株以乳酸菌為主。乳酸菌是傳統(tǒng)的乳酸發(fā)酵菌種，對(duì)乳酸的耐受性高、生產(chǎn)強(qiáng)度大、自身能夠合成高濃度的乳酸。但是，大多數(shù)乳酸菌同時(shí)合成L-乳酸和D-乳酸，光學(xué)純度比較差；想要得到高光學(xué)純度的D-乳酸，需要將生產(chǎn)L-乳酸的關(guān)鍵酶L-乳酸脫氫酶敲除。還有一些乳酸菌，如Lactobacillus sakei、Lactobacillus curvatus和Lactobacillus plantarum等乳桿菌還存在乳酸消旋酶，該酶的存在使得菌株即使只有單一的乳酸脫氫酶，最終發(fā)酵產(chǎn)物只能是D,L-乳酸。另一方面，現(xiàn)有技術(shù)主要是以玉米等淀粉質(zhì)原料發(fā)酵合成D-乳酸，受國家政策的影響，原材料價(jià)格較高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明首先提供了一種利用生物柴油副產(chǎn)物甘油合成D-乳酸的重組菌。
所述重組菌是以肺炎克雷伯氏菌為出發(fā)菌株，將編碼D-乳酸脫氫酶的基因ldhA導(dǎo)入肺炎克雷伯氏菌，或者導(dǎo)入敲除了編碼1,3-丙二醇氧化還原酶的基因dhaT和/或編碼醛還原酶/醇脫氫酶的基因yqhD的肺炎克雷伯氏菌，得到重組菌。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述D-乳酸脫氫酶基因ldhA，來源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)基因登錄號(hào)為GI：6938538。
本發(fā)明還提供一種構(gòu)建所述重組菌的方法，包括以下步驟：
1)PCR擴(kuò)增肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇脫氫酶基因dhaT的上下游同源臂片段，拼接后得到基因敲除片段ΔdhaT。所獲得的基因敲除片段ΔdhaT和自殺質(zhì)粒pRE112進(jìn)行酶切、連接；
2)將步驟1)所得的重組載體轉(zhuǎn)化到E.colix7213；
3)將步驟2)所獲得的重組菌與肺炎克雷伯氏菌共同培養(yǎng)，通過重組載體與肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行同源重組，獲得敲除dhaT基因的基因缺失型菌株K.penumoniaeΔdhaT；
4)在K.penumoniaeΔdhaT基礎(chǔ)上，參照步驟1)～3)所述步驟繼續(xù)敲除醛還原酶/醇脫氫酶基因yqhD得到K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD；
5)克隆D-乳酸脫氫酶基因ldhA，將所得基因與質(zhì)粒pBAD18進(jìn)行酶切、連接，并轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克?。?/p>
6)培養(yǎng)步驟5)所得的陽性克隆，并提取質(zhì)粒，將所得的重組質(zhì)粒pBAD18-LdhA，轉(zhuǎn)化到宿主K.penumoniaeΔdhaT或者K.peneumoniaeΔyqhD或者K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD中，獲得肺炎克雷伯氏菌重組菌。
本發(fā)明還提供一種應(yīng)用所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法，步驟如下：
1)活化重組菌，獲得種子液；
2)將步驟1)所得的種子液，與含有卡那霉素的培養(yǎng)基，按照體積比種子液：發(fā)酵培養(yǎng)基＝1～2:100～130的比例接種后，35℃～37℃，180～220rpm條件下培養(yǎng)至OD600在0.6～0.8，獲得培養(yǎng)液；
3)所得的培養(yǎng)液加入誘導(dǎo)劑阿拉伯糖至終濃度為0.01％～0.1％，然后轉(zhuǎn)入30～33℃，180～220rpm條件下繼續(xù)培養(yǎng)24～48小時(shí)。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟2)所述培養(yǎng)條件為：37℃、180rpm。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為低成本的生物柴油副產(chǎn)物甘油，氮源為無機(jī)氮源，例如氯化銨、硫酸銨等，其他成分為簡單的無機(jī)鹽成分。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：0.42g/L一水合檸檬酸，1.6g/LNH4Cl，1g/L酵母粉，0.2g/LMgSO4·7H2O，100mmol/LpH＝7.0磷酸鉀緩沖液，40g/L生物柴油副產(chǎn)物甘油。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述生物柴油副產(chǎn)物甘油的組成是：75.1％甘油，22.8％水，1.7％脂肪酸，0.12％甲醇，0.28％脂肪酸甲酯。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將重組菌活化后，按1％的接種量接種到含100μg·mL-1的卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)，待OD600達(dá)到0.6時(shí)，溫度調(diào)節(jié)至33℃，并加入0.01％阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)；此后，每隔12h添加一次0.01％～0.1％的阿拉伯糖和50mg/mL的卡那霉素，阿拉伯糖誘導(dǎo)后48h終止發(fā)酵。
本發(fā)明所獲得的的有益效果如下：
針對(duì)以上問題，本發(fā)明以Klebsiella pneumoniae為宿主菌株，通過構(gòu)建工程菌，以廉價(jià)的生物柴油副產(chǎn)物甘油為碳源，實(shí)現(xiàn)了100％光學(xué)純度D-乳酸的合成，在產(chǎn)量和成本上具有一定優(yōu)勢。本發(fā)明所構(gòu)建的重組菌具有利用生物柴油副產(chǎn)物甘油為唯一碳源合成D-乳酸的特點(diǎn)，發(fā)酵48h，可以得到12.7g/L的D-乳酸，轉(zhuǎn)化率為50.4％，光學(xué)純度為100％。以生物柴油煉制的副產(chǎn)物甘油為碳底物，降低了生產(chǎn)成本；通過進(jìn)一步改良培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率得到了提高。
定義和縮寫
在本文中使用下列的縮寫或簡稱：
D-乳酸脫氫酶基因：ldhA
1,3-丙二醇脫氫酶基因：dhaT
醛還原酶/醇脫氫酶基因：yqhD
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)：K.penumoniae
“基因缺失”或“基因敲除”指將目標(biāo)基因從基因組中刪除或使目標(biāo)基因中的一部分刪除，從而使目標(biāo)基因失去表達(dá)其對(duì)應(yīng)功能的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致功能缺失。
“電擊轉(zhuǎn)化”或“電轉(zhuǎn)化”指分子生物學(xué)中轉(zhuǎn)染技術(shù)的一種，用來將外來基因整合到宿主基因中并穩(wěn)定表達(dá)，其利用高壓電脈沖的電擊穿孔作用將外來基因?qū)胨拗骰蚧驅(qū)⑼鈦碣|(zhì)粒導(dǎo)入宿主原生質(zhì)體，又稱電擊法或電融合法等。
“過量表達(dá)”或“過表達(dá)”指特定的基因在生物體中大量表達(dá)，表達(dá)量超過正常水平(即，野生型表達(dá)水平)，可以通過增強(qiáng)內(nèi)源表達(dá)或引入外源基因來實(shí)現(xiàn)。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明。但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法若無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
所用酶試劑購自MBI Fermentas公司，提取質(zhì)粒所用的試劑盒和回收DNA片段所用的試劑盒購自美國OMEGA公司，相應(yīng)的操作步驟按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行；所有培養(yǎng)基如無特別說明均用去離子水配制。
培養(yǎng)基配方：
1)種子液搖瓶培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余為水，121℃，20min滅菌。
2)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基
M9改良培養(yǎng)基：0.42g/L一水合檸檬酸，1.6g/L NH4Cl，1g/L酵母粉，0.2g/L MgSO4·7H2O，100mmol/L pH＝7.0磷酸鉀緩沖液，40g/L生物柴油副產(chǎn)物甘油。
生物柴油副產(chǎn)物甘油含量：75.1％甘油，22.8％水分，1.7％脂肪酸，0.12％甲醇，0.28％脂肪酸甲酯。
在實(shí)際培養(yǎng)過程中，可向上述培養(yǎng)基中添加一定濃度的抗生素以維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，如100mg/L的卡那霉素。
實(shí)施例1基因的敲除
本實(shí)施例中，以肺炎克雷伯氏菌(K.penumoniae)野生菌株的1,3-丙二醇脫氫酶基因(dhaT)(Gene ID：7946507)上下游約500個(gè)堿基片段為模板設(shè)計(jì)引物，分別PCR擴(kuò)增1,3-丙二醇脫氫酶基因(dhaT)上下游片段，再利用回收試劑盒回收目的基因片段。
上游擴(kuò)增引物序列為：Kp-dhaT-Up-5'：5'-CGGGGTACCATGAGCTATCGTAT GTTTG-3'和Kp-dhaT-Up-3'：5'-GATGAGGCGGATCGCCTGCGATCACAAACTT CACTTTG-3'；下游擴(kuò)增引物序列為Kp-dhaT-Down-5'：5'-CAAAGTGAAGTTTGTGATCGCAGGCGATCCGCCTCATC-3'和Kp-dhaT-Down-3'：5'-GTCCGAGCTCTCAGAATGCCTGGCGGAAAATCG-3'。
將上述擴(kuò)增片段回收后，以回收片段為模板進(jìn)行搭橋PCR獲得用于敲除1,3-丙二醇脫氫酶基因(dhaT)的片段ΔdhaT，再利用回收試劑盒回收目的片段ΔdhaT，以自殺質(zhì)粒pRE112為媒介(Robert A.Edwards,Linda H.Keller,Dieter M.Schifferli.Improved allelic exchange vectors and their use to analyze 987P fimbria gene expression.Gene 1998；207:149-157.)與K.penumoniae野生菌株進(jìn)行同源重組敲除dhaT基因，通過PCR驗(yàn)證獲得已經(jīng)敲除dhaT的K.penumoniae工程菌即K.penumoniaeΔdhaT。
驗(yàn)證引物序列：ID-Kp-dhaT-del-5'：5'-GCATTATAACCTGAAGCGAG-3'和ID-Kp-dhaT-del-inside-3'：5'-CGAGGTTGGCGTTATTGAAAG-3'和ID-Kp-dhaT-del-3'：5'-TACGCCTGGCGGTGAAAGCGAC-3'。
醛還原酶/醇脫氫酶基因(yqhD)(Gene ID：6934748)的敲除方法參考1,3-丙二醇脫氫酶基因(dhaT)的敲除。
上游擴(kuò)增引物序列為：Kp-yqhD-Up-5'：5'-ATGAGCTCTACAGCAGGCGGACGTCAGGC-3'和Kp-yqhD-Up-3'：5'-GGCTCGATGCCGCCAAATTC-3'；下游擴(kuò)增引物為Kp-yqhD-Down-5'：5'-GAATTTGGCGGCATCGAGCCGTATCGATGCC GCTATTGCC-3'和Kp-yqhD-Down-3'：5'-ATTCTAGATGGTACGCGGCGGCGGTG TC-3'。驗(yàn)證引物序列：ID-K.p-yqhD-3’：5'-GGTGATGAACAGCTCATCGC-3'和ID-K.p-yqhD-5’：5'-GTCATCTGGCAGCGGTATCGT-3'。
在K.penumoniae野生菌株基礎(chǔ)上，單獨(dú)敲除yqhD時(shí)得到K.penumoniaeΔyqhD；在K.penumoniaeΔdhaT基礎(chǔ)上，再敲除dhaT獲得菌株為K.penumoniaeΔdhaTΔyqhD。
實(shí)施例2外源基因的克隆
本實(shí)施例中，獲取來源于K.pneumoniae的D-乳酸脫氫酶基因(ldhA)(Gene ID:6938538)，是以K.pneumoniae為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得(引物：5'-CGAGCTCTATAATCACTGGAGAAAAGT-3'和5'-GCTCTAGAGAATCAGACGATGGCGTTCG-3')，再利用回收試劑盒回收目的片段。
實(shí)施例3表達(dá)載體的構(gòu)建
將實(shí)施例2中獲得的D-乳酸脫氫酶ldhA基因片段和質(zhì)粒pBAD18用SacI和XbaI酶切，回收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接，載體與ldhA基因片段按照摩爾比1:5的比例，16℃連接6h以上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL-1卡那霉素的LB固體平板上，PCR篩選陽性克隆。從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒pBAD18-ldhA后，再通過限制性酶酶切和測序鑒定，用于過表達(dá)D-乳酸脫氫酶。
實(shí)施例4宿主肺炎克雷伯氏菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
將實(shí)施例1中獲得的基因缺失菌株K.peneumoniaeΔdhaT或者K.peneumoniaeΔyqhD或者K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD接種于20mL的LB液體培養(yǎng)基中，加入50μg·mL-1的氨芐青霉素，培養(yǎng)至一定菌體濃度。用滅菌離心管在4℃下5500rpm離心5分鐘，去除上清，再用4℃保存的無菌水懸浮后再次離心，重復(fù)2次。再用無菌水重懸浮，分裝，-80℃保存，得到感受態(tài)細(xì)胞。
實(shí)施例5K.peneumoniae合成D-乳酸光學(xué)性質(zhì)的檢測
將野生的肺炎克雷伯氏菌K.peneumoniae在LB培養(yǎng)基中活化，將活化后的重組菌株按1:100的比例接種到含有100mL的M9改良液體培養(yǎng)基的250mL搖瓶中(內(nèi)含100μg·mL-1的卡那霉素)，37℃、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)。OD600達(dá)到0.6左右時(shí)，溫度調(diào)節(jié)至33℃，并加入0.01％阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)。此后，每隔12h添加一次0.01％～0.1％的阿拉伯糖和50mg/mL的卡那霉素，阿拉伯糖誘導(dǎo)48h后終止發(fā)酵。
取1mL發(fā)酵液，4℃，15000rpm離心10min，取上清，用液相色譜檢測乳酸光學(xué)純度，使用手性色譜柱和紫外檢測器。用高效液相色譜檢測產(chǎn)物濃度，使用紫外和示差檢測器。
經(jīng)檢測，D-乳酸的光學(xué)純度為100％。野生菌株合成D-乳酸的產(chǎn)量為0.12g，甘油到乳酸的轉(zhuǎn)化率為0.31％，1,3-PDO的產(chǎn)量為9.6g/L(表1)。
實(shí)施例6將質(zhì)粒pBAD18-ldhA導(dǎo)入K.peneumoniaeΔdhaT合成D-乳酸
將實(shí)施例3中獲得的表達(dá)載體pBAD18-ldhA通過電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入實(shí)施例4中獲得的K.peneumoniaeΔdhaT感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含有卡那霉素的LB固體平板；涂布后的平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)至長出單克隆。
將獲得的工程菌株單克隆在LB培養(yǎng)中進(jìn)行活化，活化后的菌株按1:100的比例接種到含有100mL的M9改良液體培養(yǎng)基的250mL搖瓶中(內(nèi)含100μg·mL-1的卡那霉素)，37℃、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)。OD600達(dá)到0.6左右時(shí)，溫度調(diào)節(jié)至33℃，并加入0.01％阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)。此后，每隔12h添加一次0.01％～0.1％的阿拉伯糖和50mg/mL的卡那霉素，阿拉伯糖誘導(dǎo)后48h終止發(fā)酵。
取1mL發(fā)酵液，4℃，15000rpm離心10min，取上清，用高效液相色譜檢測產(chǎn)物濃度(表1)，使用紫外和示差檢測器。
經(jīng)檢測，D-乳酸產(chǎn)量為9.3g/L，甘油到乳酸的轉(zhuǎn)化率為32.0％，相對(duì)于實(shí)施例5，產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提高了76.5倍和102.2倍；1,3-PDO的產(chǎn)量為2.7g/L，相對(duì)于實(shí)施例5，降低了71.9％(表1)。
實(shí)施例7將質(zhì)粒pBAD18-ldhA導(dǎo)入K.peneumoniaeΔyqhD合成D-乳酸
將實(shí)施例3中獲得的表達(dá)載體pBAD18-ldhA通過電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入實(shí)施例4中獲得的K.peneumoniaeΔyqhD感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含有卡那霉素的LB固體平板；涂布后的平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)至長出單克隆。
將獲得的工程菌株單克隆在LB培養(yǎng)中進(jìn)行活化，活化后的菌株按1:100的比例接種到含有100mL的M9改良液體培養(yǎng)基的250mL搖瓶中(內(nèi)含100μg·mL-1的卡那霉素)，37℃、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)。OD600達(dá)到0.6左右時(shí)，溫度調(diào)節(jié)至33℃，并加入0.01％阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)。此后，每隔12h添加一次0.01％～0.1％的阿拉伯糖和50mg/mL的卡那霉素，阿拉伯糖誘導(dǎo)后48h終止發(fā)酵。
取1mL發(fā)酵液，4℃，15000rpm離心10min，取上清，用高效液相色譜檢測產(chǎn)物濃度(表1)，使用紫外和示差檢測器。
經(jīng)檢測，D-乳酸產(chǎn)量為9.6g/L，甘油到乳酸的轉(zhuǎn)化率為33.8％，相對(duì)于實(shí)施例5，產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提高了79倍和108倍；1,3-PDO的產(chǎn)量為2.4g/L，相對(duì)于實(shí)施例5，降低了75％(表1)。
實(shí)施例8將質(zhì)粒pBAD18-ldhA導(dǎo)入K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD合成D-乳酸
將實(shí)施例3中獲得的表達(dá)載體pBAD18-ldhA通過電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入實(shí)施例4中獲得的K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含有卡那霉素的LB固體平板；涂布后的平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)至長出單克隆。
將獲得的工程菌株單克隆在LB培養(yǎng)中進(jìn)行活化，活化后的菌株按1:100的比例接種到含有100mL的M9改良液體培養(yǎng)基的250mL搖瓶中(內(nèi)含100μg·mL-1的卡那霉素)，37℃、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)。OD600達(dá)到0.6左右時(shí)，溫度調(diào)節(jié)至33℃，并加入0.01％阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)。此后，每隔12h添加一次阿拉伯糖和抗生素，阿拉伯糖誘導(dǎo)后48h終止發(fā)酵。
取1mL發(fā)酵液，4℃，15000rpm離心10min，取上清，用高效液相色譜檢測產(chǎn)物濃度，使用紫外和示差檢測器。
經(jīng)檢測，D-乳酸產(chǎn)量為12.7g/L，甘油到乳酸的轉(zhuǎn)化率為50.4％，相對(duì)于實(shí)施例5，產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提高了104.8倍和161.6倍；相對(duì)于實(shí)施例6，產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提高了36.6％和57.5％；相對(duì)于實(shí)施例7，產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提高了32.3％和49.1％。1,3-PDO的產(chǎn)量為2.1g/L，相對(duì)于實(shí)施例5，降低了78.1％；相對(duì)于實(shí)施例6，降低了22.2％；相對(duì)于實(shí)施例7，降低了12.5％(表1)。
表1不同菌株搖瓶發(fā)酵合成D-乳酸情況
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。