本發(fā)明涉及一種防治大豆疫病的生防放線菌菌株及其應(yīng)用，屬于農(nóng)作物病害防治技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

大豆疫病是由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）侵染引起的大豆生產(chǎn)上的毀滅性病害之一，該病害在大豆的整個(gè)生育期均可發(fā)生，但尤其以苗期發(fā)病最為常見，如果伴有陰雨則易引起病害大面積的流行而造成產(chǎn)量嚴(yán)重下降甚至絕收，防治難度較大，嚴(yán)重影響我國大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，大豆疫病的主要防治方法是栽培抗病品種和噴施化學(xué)農(nóng)藥。然而大豆疫霉菌群體會(huì)每年都發(fā)生巨大的變化，抗性品種抗性一般幾年后就會(huì)逐漸喪失。目前，科學(xué)家已經(jīng)成功克隆了13個(gè)顯性單抗病性基因。雖然單基因抗性較強(qiáng)，但是其對大豆疫霉菌選擇壓力較大，易使新的生理小種成為優(yōu)勢種群，使大豆品種抗性慢慢喪失?；瘜W(xué)殺菌劑一度成為控制大豆疫病的主要措施，其中甲霜靈的應(yīng)用最為廣泛。但是，甲霜靈的作用靶標(biāo)非常單一，大豆疫霉菌在進(jìn)化過程中極易產(chǎn)生抗性突變，在很多地區(qū)抗性菌株頻率超過了50%，抗藥性問題日益突出。不僅如此，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用還給生態(tài)環(huán)境、人類健康等造成嚴(yán)重威脅。因此，研發(fā)出可替代化學(xué)殺菌劑的生物源殺菌劑用于大豆疫病的防治已刻不容緩。

放線菌（Actinomycetes）是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和實(shí)用價(jià)值的微生物，種類豐富，廣泛分布于自然界中。目前從微生物中發(fā)現(xiàn)的約8000 種生物活性物質(zhì)當(dāng)中，近70% 是由放線菌產(chǎn)生，特別是鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，如中生菌素、阿維菌素等。土壤拮抗放線菌具有對環(huán)境友好、效果持久、針對性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。因此從煙田根圍土壤分離獲得對煙草青枯病菌具有拮抗作用的放線菌，對該病害的防治具有重要意義，符合農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：針對目前大豆疫病嚴(yán)重發(fā)生，且面積逐年擴(kuò)大，化學(xué)防治效果不理想，同時(shí)帶來環(huán)境污染的問題，提供一種高效防治大豆疫病的生防放線菌及其應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種防治大豆疫病的生防放線菌St3，經(jīng)形態(tài)觀察、培養(yǎng)特征觀察和分子生物學(xué)研究鑒定為鏈霉菌(Streptomyces sp.)，已于2014年3月24月保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO.8961。

所述的生防放線菌St3菌劑的制備過程如下：

將所述的菌株接種于高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min，培養(yǎng)2 d后，制成種子液。取6ml種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。經(jīng)優(yōu)化后得到的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：淀粉2%、葡萄糖1.5%、黃豆粉2%、NaCl 0.3%、CaCO₃ 0.2%，其余為水。通過對培養(yǎng)條件的摸索，得到最佳發(fā)酵條件為：接種量10% ( v /v)、裝瓶量60mL /250mL、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值8.0、28℃，200 r/min，培養(yǎng)5 d，制成濃度為10⁸CFU/ml的St3菌株發(fā)酵液。

所述的生防放線菌St3在防治大豆疫病中的應(yīng)用方法如下：

可在大豆苗期或成株期灌根使用，每株50ml。連續(xù)使用2-3次，每次間隔10天左右。該菌劑也可與有機(jī)肥混合配制成菌肥使用。

本發(fā)明有益效果：

本發(fā)明篩選出的生防放線菌St3能夠明顯抑制大豆疫霉菌的生長。由于是生物制劑，因此沒有化學(xué)農(nóng)藥的使用帶來的一系列問題，對減少農(nóng)業(yè)污染，且能有效防治大豆疫病。

本發(fā)明生防放線菌分離自大豆根圍土壤，與土壤生態(tài)和諧相容，有利于充分發(fā)揮菌株的優(yōu)勢。

本發(fā)明生防放線菌菌株培養(yǎng)條件簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為菌株St3氣生菌絲和孢子絲形態(tài)（光學(xué)顯微鏡下40×）。

圖2為菌株St3孢子形態(tài)（電子顯微鏡7000×）。

圖3為菌株St3發(fā)酵液對大豆疫霉菌的平板抑菌效果圖。

具體實(shí)施方式

為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但并不是對本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1 拮抗放線菌的分離

具體過程如下：

1、土壤樣品的采集

從福建省龍海市榜山鎮(zhèn)南苑村采集不同大豆地塊5-10cm深處的根圍土壤，分裝標(biāo)記后帶回實(shí)驗(yàn)室，待自然風(fēng)干后分離。

、放線菌的分離

采用平板稀釋法進(jìn)行分離。稱取土壤樣品10g，倒入裝有小玻璃珠和90ml無菌水的三角瓶中，震蕩30min后靜置5分鐘，依次稀釋10倍，分別配制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的懸浮液，吸取不同濃度的懸浮液各0.1ml加到高氏一號(hào)培養(yǎng)基（加入終濃度為50mg /L 的K₂GrO₇）平板上，均勻涂布后置于28℃培養(yǎng)觀察，5-7天后挑取不同的單菌落劃線純化。將純化后的菌株轉(zhuǎn)接到高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆?，共分離得到85株放線菌。

實(shí)施例2 菌株St3的鑒定

1、形態(tài)特征觀察

將菌株St3劃線接種在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，以45度角斜插入無菌蓋玻片，28℃培養(yǎng)7d 后，取出蓋玻片在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下觀察菌絲和孢子的形態(tài)特征。發(fā)現(xiàn)菌株St3 的孢子絲螺旋狀，常成簇生，孢子絲斷裂成分生孢子，孢子橢圓形，表面粗糙（圖1和圖2）。

、培養(yǎng)特征觀察

采用《鏈霉菌鑒定手冊》推薦的8種培養(yǎng)基，將菌株St3 于28℃培養(yǎng)7-10d后觀察菌體生長情況，記錄氣生菌絲、基內(nèi)菌絲的顏色以及是否產(chǎn)生可溶性色素。菌株St3在高氏一號(hào)培養(yǎng)基、察貝克培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基和燕麥培養(yǎng)基上生長良好，基內(nèi)菌絲和氣生菌絲發(fā)育良好；而在克氏一號(hào)培養(yǎng)基、淀粉銨培養(yǎng)基和葡萄糖天門冬素培養(yǎng)基上生長較差，在上述8種培養(yǎng)基上均無可溶性色素產(chǎn)生(表1)。根據(jù)以上形態(tài)特征分析，對照鏈霉菌鑒定手冊，將St3初步鑒定為鏈霉菌粉紅孢類群。

表1 菌株St3在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

3、16S rDNA 序列分析

基因組提取試劑盒提取菌株St3基因組DNA后，采用通用引物F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，進(jìn)行 16S rDNA 的PCR擴(kuò)增?；厥誔CR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、鑒定后，陽性克隆送生工生物工程（上海）有限公司測序，序列全長為1555 bp（請見序列SEQ ID NO.1）。將所得序列提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 分析比對，發(fā)現(xiàn)與St3同源性較高的菌株均屬于鏈霉菌屬，選取12個(gè)典型菌株的16S rDNA 序列用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，菌株St3與Streptomyces graminearus屬于同一分支，其中與菌株Streptomyces graminearus相似性達(dá)到99.8%，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)特征，將菌株St3 鑒定為禾粟鏈霉菌(Streptomyces graminearus)。

實(shí)施例3 St3菌株發(fā)酵工藝的優(yōu)化

將上述菌株接種于高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min，培養(yǎng)2 d后，制成種子液。取6ml種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。通過對碳源、氮源的篩選以及營養(yǎng)條件單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)后，得到該菌株的最佳發(fā)酵配方為：淀粉2wt.%、葡萄糖1.5 wt.%、黃豆粉2 wt.%、NaCl 0.3 wt.%、CaCO₃ 0.2 wt.%，其余為水。通過對培養(yǎng)條件的摸索，得到最佳發(fā)酵條件為：接種量10% ( v /v)、裝瓶量60mL /250mL、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值8.0、28℃，200 r/min，培養(yǎng)5 d，得到濃度為10⁸CFU/ml的St3菌株發(fā)酵液。

實(shí)施例4 菌株St3拮抗測定

采用平板對峙培養(yǎng)法，將菌株St3對大豆疫霉菌作拮抗測定，首先在胡蘿卜培養(yǎng)基平板中央接入大豆疫霉菌絲塊，待大豆疫霉菌菌落長至3cm時(shí)，在菌落4周點(diǎn)接上菌株St3，25℃下培養(yǎng)5天后測量菌株St3對大豆疫霉菌的抑菌帶寬度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選測定表明菌株St3對大豆疫霉菌具有較好的拮抗作用（圖3）。

實(shí)施例5 菌株St3發(fā)酵液防效試驗(yàn)

大豆品種為毛豆75-3，實(shí)驗(yàn)地為常年大豆疫病發(fā)生地。待播種出苗后7-10天，每株苗澆灌50 ml St3菌株發(fā)酵液（10⁸個(gè)孢子/ml），開花期再澆灌一次100 ml St3菌株發(fā)酵液。以50%安克可濕性粉劑800倍液灌根處理作為農(nóng)藥對照，以發(fā)酵培養(yǎng)基和清水處理的植株作為空白對照。每個(gè)處理10株苗，每處理3次重復(fù)。待發(fā)病后每天調(diào)查發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)，直至清水對照發(fā)病率達(dá)到80%以上時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：

0級(jí)：接種部位無變化或稍變褐；

1級(jí)：接種部位產(chǎn)生病斑，病斑面積占莖部面積的1/4以下；

3級(jí)：接種部位病斑面積占莖部總面積的1/4～1/2左右；

5級(jí)：接種部位病斑占莖部面積的1/2以上；

7級(jí)：接種部位病斑連片，已形成繞莖現(xiàn)象，但植株并沒萎蔫或枯死；

9級(jí)：植株萎蔫或枯死。

病情指數(shù)（%）=[∑病級(jí)數(shù)×該病級(jí)植株數(shù))／(最高病級(jí)數(shù)×總植株數(shù))]×100%

防治效果（%）=[(對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù))／對照病情指數(shù)]×100%（對照指清水對照處理）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表2），供試放線菌St3發(fā)酵液能夠顯著降低大豆疫病的病情指數(shù)，防治效果高達(dá)85.02%，高于化學(xué)農(nóng)藥50%安克可濕性粉劑800倍液的防治效果80.81%。另外從表中還可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)基處理的病情指數(shù)略低于清水對照處理的病情指數(shù)，但兩者差異不顯著。溫室盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，St3菌株能夠有效防治大豆疫病，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。

表2 放線菌St3發(fā)酵液對大豆疫病的防治效果

注：同列不同小寫字母表示數(shù)值間差異顯著（P <0.05）。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120> 一種防治大豆疫病的生防放線菌菌株及其應(yīng)用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1537

<212> DNA

<213> 生防放線菌St3的16SrDNA序列

<400> 1

ctcggtaccc ggggatcctc tagagattag agtttgatcc tggctcagga cgaacgctgg 60

cggcgtgctt aacacatgca agtcgaacga tgaaccacct tcgggtgggg attagtggcg 120

aacgggtgag taacacgtgg gcaatctgcc ctgcactctg ggacaagccc tggaaacggg 180

gtctaatacc ggatactgac ctgccaaggc atcttggcgg gtcgaaagct ccggcggtgc 240

aggatgagcc cgcggcctat cagcttgttg gtgaggtaat ggctcaccaa ggcgacgacg 300

ggtagccggc ctgagagggc gaccggccac actgggactg agacacggcc cagactccta 360

cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgaaag cctgatgcag cgacgccgcg 420

tgagggatga cggccttcgg gttgtaaacc tctttcagca gggaagaagc gaaagtgacg 480

gtacctgcag aagaagcgcc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggcg 540

caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gagctcgtag gcggcttgtc gcgtcggttg 600

tgaaagcccg gggcttaacc ccgggtctgc agtcgatacg ggcaggctag agttcggtag 660

gggagatcgg aattcctggt gtagcggtga aatgcgcaga tatcaggagg aacaccggtg 720

gcgaaggcgg atctctgggc cgatactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca 780

ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacggtgggc actaggtgtg ggcaacattc 840

cacgttgtcc gtgccgcagc taacgcatta agtgccccgc ctggggagta cggccgcaag 900

gctaaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg cggagcatgt ggcttaattc 960

gacgcaacgc gaagaacctt accaaggctt gacatacacc ggaaagcatc agagatggtg 1020

ccccccttgt ggtcggtgta caggtggtgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1080

ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcccgtg ttgccagcaa ctcttcggag 1140

gttggggact cacgggagac cgccggggtc aactcggagg aaggtgggga cgacgtcaag 1200

tcatcatgcc ccttatgtct tgggctgcac acgtgctaca atggccggta caatgagctg 1260

cgataccgca aggtggagcg aatctcaaaa agccggtctc agttcggatt ggggtctgca 1320

actcgacccc atgaagtcgg agtcgctagt aatcgcagat cagcattgct gcggtgaata 1380

cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acgtcacgaa agtcggtaac acccgaagcc 1440

ggtggcccaa ccccttgtgg gagggagctg tcgaaggtgg gactggcgat tgggacgaag 1500

tcgtaacaag gtaccaatcg tcgacctgca ggcatgc 1537

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19