本發(fā)明屬于環(huán)境污染生物修復(fù)領(lǐng)域，具體為一種鐵載體高產(chǎn)菌制劑及其在污染土壤重金屬修復(fù)方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
土壤的重金屬污染現(xiàn)已成為全球性環(huán)境問題，備受社會和民眾關(guān)注，亟待解決。我國許多地區(qū)(尤其是華東地區(qū))土壤呈不同程度的重金屬污染，許多地區(qū)糧食、蔬菜、水果中鎘、砷、銅、鉛、鋅等重金屬含量超標(biāo)或接近臨界值，嚴(yán)重危害人民群眾健康。
土壤重金屬污染治理迫在眉睫卻又困難重重，主要原因在于重金屬并不像有機污染物那樣能夠被生物降解，且重金屬在土壤中遷移性差。傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法如客土、淋洗、離子交換等往往只適合小規(guī)模重度污染的土壤治理，且因其成本高、破壞土壤結(jié)構(gòu)，以及易引發(fā)二次污染等缺點而飽受詬病。與之相比，生物修復(fù)因具有成本低、效果好、簡單易行和無二次污染等優(yōu)點而備受青睞。其中，微生物—植物聯(lián)合修復(fù)作為生物修復(fù)的一種，因其可以有效降低土壤中重金屬的毒性，吸附重金屬并改變根際微環(huán)境，進而提高植物對重金屬的吸收或固定效率，且實施成本相對低廉、環(huán)境友好，以及可大規(guī)模原位修復(fù)等優(yōu)點而備受歡迎，是近年來大力發(fā)展、推行的用于治理大面積土壤重金屬污染的新技術(shù)。然而，上述聯(lián)合修復(fù)技術(shù)的效率取決于修復(fù)植物的生物量，以及土壤中重金屬的生物可利用性。換言之，植物生物量越大且能夠盡量多地從土壤中吸收重金屬，那么修復(fù)效率就越高，效果也就越好。如何提高植物修復(fù)效率成為了研究與關(guān)注的熱點。超積累植物(如蕓苔屬、庭芥屬和遏藍菜屬)通常生物量較低且難以大規(guī)模種植，因而其在實際修復(fù)中的應(yīng)用十分有限。而一些生長快速、生物量大且具有重金屬富集能力的植物正越來越多地應(yīng)用于重金屬污染場地修復(fù)。作為一種可用于生產(chǎn)生物乙醇的能源作物，甜高粱具有耐壓能力強、生長迅速、生物量大等優(yōu)點，成為了目前最具競爭力的重金屬修復(fù)植物。
鐵載體(Siderophore)是微生物產(chǎn)生的一種對鐵具有超強絡(luò)合力的有機化合物，其功能是向微生物細(xì)胞提供鐵素養(yǎng)分，尤其是在低鐵環(huán)境下。鐵載體與重金屬的結(jié)合主要體現(xiàn)在鐵載體的生物學(xué)功能上，即在濃縮環(huán)境中的鐵并促進其轉(zhuǎn)運進入細(xì)胞的同時，鐵載體還能通過絡(luò)合作用影響其它金屬的生物可利用性，從而降低其毒性。此外，微生物鐵載體還能夠通過抑制病原微生物的生長而提升植物根系的抗病能力。鐵載體產(chǎn)生菌因其具有上述優(yōu)點、特質(zhì)，故而成為了微生物—植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染體系中微生物部分的熱門候選。
目前，通過人工富集、篩選等技術(shù)，已有不少鐵載體產(chǎn)生菌從環(huán)境中分離出，并實現(xiàn)了純培養(yǎng)。然而，已報道的這些菌株中，鐵載體高產(chǎn)菌株有限；兼具多種優(yōu)點、特質(zhì)(如多重重金屬抗性和病原真菌結(jié)抗性)的菌株匱乏；具備切實強化植物吸收土壤中重金屬能力的菌株寥寥無幾。因而，尋找并獲取性狀優(yōu)異的鐵載體高產(chǎn)菌株成為了該研究領(lǐng)域的熱點和焦點。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鐵載體高產(chǎn)菌制劑。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述鐵載體高產(chǎn)菌制劑在農(nóng)田污染土壤重金屬修復(fù)方面的應(yīng)用，該應(yīng)用主要是強化甜高粱修復(fù)典型重金屬污染土壤。
本發(fā)明的上述技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案得以實施的：
一種鐵載體高產(chǎn)菌制劑，所述的鐵載體高產(chǎn)菌制劑中含有芽孢桿菌屬細(xì)菌(Bacillus sp.)S86、假單胞菌屬細(xì)菌(Pseudomonas sp.)S17和嗜根寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)LD-6的組合。
本發(fā)明所涉及的高產(chǎn)鐵載體菌Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86源自浙江省杭州市浙江科技學(xué)院內(nèi)試驗田土壤，經(jīng)人工富集培養(yǎng)、壓力篩選和分離純化得到。本發(fā)明涉及到的另一株細(xì)菌——硫丹降解菌，為本實驗自有菌株，該菌是嗜根寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)LD-6，于2012年3月2日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC No.5839，該菌具有降解硫丹的能力。保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所(下同)。
S17菌株為假單胞菌屬細(xì)菌，革蘭氏染色陰性，接觸酶陽性，氧化酶陰性，V.P.試驗陰性，吲哚試驗陽性，菌體形態(tài)為短桿狀，菌落呈淡黃色、圓形、邊緣略顯毛刺、光滑濕潤，其它生理生化特征如表1所示，該菌株于2016年10月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCCNo.13104。
芽孢桿菌屬細(xì)菌(Bacillus sp.)的菌株S86，該菌株于2016年10月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC No.13105。S86菌株為芽孢桿菌屬細(xì)菌，革蘭氏染色陽性，接觸酶陽性，氧化酶陰性，V.P.試驗陽性，吲哚試驗陰性，菌體形態(tài)為桿狀，菌落呈白色、圓形、蠟質(zhì)，其它生理生化特征如表2所示。
表1、菌株S17的生理生化特征
注：“+”表示生長或陽性反應(yīng)；“-”表示不生長或陰性反應(yīng)(下同)。
表2、菌株S86的生理生化特征
S17菌株的最適生長溫度為29℃。以五分之一LB(Luria-Bertani)或工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH4)2SO4 6g/L，玉米漿6g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MnSO4 0.05g/L，pH 7.0)培養(yǎng)24小時后，菌液菌體濃度可達6.5-9.2×109CFU/mL(CFU，菌落形成單位)。該菌對氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素、卡那霉素和四環(huán)素敏感(皆為尋?？股??？梢哉J(rèn)為：當(dāng)菌體被釋放到自然環(huán)境中時，不會因抗(耐)藥性問題而產(chǎn)生超級細(xì)菌。在病原菌拮抗測試中，發(fā)現(xiàn)該菌株可抑制青霉、黑曲霉和油菜菌核病三種病原真菌生長。該菌對12種測試金屬離子(Li+、Ag+、Cd2+、Cu2+、Hg2+、Ba2+、Pb2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Fe3+和Co4+)呈現(xiàn)不同程度的耐受性(或抗性)。鑒于我國重金屬污染土壤現(xiàn)狀——多種重金屬污染并存，可以認(rèn)為——該菌株較其它不具多種重金屬耐受性或抗性的菌株而言，在實施強化修復(fù)過程中修復(fù)效果受重金屬抑制影響小。該菌株鐵載體活性單位(Siderophore unit，SU)為99.2％，達產(chǎn)鐵載體菌最高級，是國內(nèi)已報道產(chǎn)鐵載體菌中，產(chǎn)鐵載體能力最強的菌株。此外，S17還具備一定的溶磷和產(chǎn)3-吲哚乙酸的能力。以1.5％葡萄糖為碳源，0.2％氯化銨為氮源，30℃，pH7.2，培養(yǎng)時間66h(初始接種量為2％)，該菌溶磷量為120.35mg/L。向含有L-色氨酸(200mg/L)的通用LB液體培養(yǎng)基中接入該菌(接種量為1％)，28℃、160r/min培養(yǎng)3天，隨后測定發(fā)酵液中的3-吲哚乙酸含量，測定值為72.36mg/L。
S86菌株的最適生長溫度為28℃。以五分之一LB或工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后，菌液菌體濃度可達6.1-8.6×109CFU/mL。該菌對氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素、卡那霉素和四環(huán)素敏感或高度敏感?？梢哉J(rèn)為：當(dāng)菌體被釋放到自然環(huán)境中時，不會因抗(耐)藥性問題而產(chǎn)生超級細(xì)菌。在病原菌拮抗測試中，發(fā)現(xiàn)該菌株可抑制番茄灰霉病、番茄早疫病、茄子枯萎病、棉花枯萎病、油菜菌核病和甜瓜蔓枯病病原真菌生長。該菌對12種測試金屬離子(Li+、Ag+、Cd2+、Cu2+、Hg2+、Ba2+、Pb2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Fe3+和Co4+)呈現(xiàn)不同程度的耐受性(或抗性)?？梢哉J(rèn)為——該菌株較其它不具多種重金屬耐受性或抗性的菌株而言，在實施強化修復(fù)過程中修復(fù)效果受重金屬抑制影響小。該菌株SU值為76.4％，屬于強鐵載體產(chǎn)生菌。
嗜根寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)LD-6，菌可在好養(yǎng)條件下，10日內(nèi)實現(xiàn)對100mg/L硫丹的完全降解，且降解產(chǎn)物低毒或無毒、環(huán)境降解快速；菌株LD-6對常用抗生素四環(huán)素和卡那霉素敏感，對13種供試重金屬呈現(xiàn)耐受性；該菌對白色念珠菌(Candida albicans)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、黃萎病菌(Verticillium dahliae)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)和辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporum)呈現(xiàn)明顯抑制作用；此外，該菌株具備在實際土壤環(huán)境下高效降解硫丹的能力，能夠顯著縮短硫丹降解時長，具備實際應(yīng)用意義和價值。該菌的最適生長條件為：pH 7.2，溫度為30℃。以五分之一LB(Luria-Bertani)或工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH4)2SO4 6g/L，玉米漿6g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，K2HPO4·3H2O2g/L，MnSO4 0.05g/L，pH 7.2)培養(yǎng)24-36小時后，菌液濃度可達5-8×109CFU/mL。嗜根寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)LD-6在土壤修復(fù)方面的應(yīng)用見ZL201210106224.1。
當(dāng)S86菌株、S17菌株和LD-6菌株在五分之一LB或工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基中29℃，pH7.3，150r/min共同培養(yǎng)24時后(S86、S17、LD-6初始接種量為各自單獨接種培養(yǎng)時的三分之一)，發(fā)現(xiàn)菌懸液菌體密度(5.6-10.2×109CFU/mL)要明顯高于各自單獨培養(yǎng)時的菌懸液菌體密度。
作為優(yōu)選，所述的制劑是由五分之一LB(Luria-Bertani)或工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基接種菌種培養(yǎng)22-24小時后得到，工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH4)2SO4 6g/L，玉米漿6g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MnSO4 0.05g/L。進一步的，所述的制劑發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為29±1℃，pH7.2-7.4。
一種所述的鐵載體高產(chǎn)菌制劑在農(nóng)田污染土壤重金屬修復(fù)方面的應(yīng)用。
作為優(yōu)選，該應(yīng)用是強化甜高粱修復(fù)重金屬污染土壤，方法為在生長期的甜高粱的根部噴灑含有所述的鐵載體高產(chǎn)菌制劑，鐵載體高產(chǎn)菌制劑中菌體的總濃度為1-5×108CFU/mL。
綜上所述，本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點：
本發(fā)明的Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86菌株均為強鐵載體產(chǎn)生菌。其中，Pseudomonas sp.S17菌株已達產(chǎn)鐵載體能力最高級，產(chǎn)鐵載體能力為國內(nèi)已報到菌株中最強。S17和S86菌株對常用抗生素敏感，對12種重金屬呈現(xiàn)不同程度耐受性或抗性，并兼具病原真菌結(jié)抗性。而嗜根寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)LD-6具有高效降解硫丹的能力，且降解產(chǎn)物低毒或無毒、環(huán)境降解快速；對常用抗生素四環(huán)素和卡那霉素敏感，對13種供試重金屬呈現(xiàn)耐受性；對白色念珠菌(Candida albicans)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、黃萎病菌(Verticillium dahliae)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)和辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporum)呈現(xiàn)明顯抑制作用；此外，該菌株具備在實際土壤環(huán)境下高效降解硫丹的能力，能夠顯著縮短硫丹降解時長，具備實際應(yīng)用意義和價值。而將三者共同培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)其菌體密度要顯著高于相同條件下各自單培養(yǎng)的菌體密度，存在互補增生效應(yīng)。此外，S17菌株還具備溶磷能力和產(chǎn)3-吲哚乙酸能力。上述的這些優(yōu)點和特點對微生物—植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土地而言，意義重大！使得這一修復(fù)體系能夠更為實際、更為高效地應(yīng)用于污染場地修復(fù)。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施例來對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。
在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
實施例1：Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86的分離與鐵載體產(chǎn)生能力測試
以通用五點采樣法現(xiàn)場采集浙江省杭州市浙江科技學(xué)院內(nèi)試驗田土壤100g，用無菌信封盛裝，并迅速帶回實驗室。
通用CAS檢測液和MSA液體培養(yǎng)基根據(jù)陳紹興等報道(陳紹興，趙翔，沈萍，等.高靈敏假單胞菌鐵載體的平板檢測方法.微生物學(xué)通報，2006，33：122-127)配制。固體檢測平板則是在MSA液體培養(yǎng)基中加入5％的CAS檢測液和2％的瓊脂粉凝固而成。
將土壤樣品用10倍遞減法稀釋，涂布于五分之一LB固體平板(即所有營養(yǎng)成分為通用LB培養(yǎng)基的1/5)上。25℃培養(yǎng)，出現(xiàn)菌落后，將不同形態(tài)的菌落逐一以無菌牙簽挑出、轉(zhuǎn)接到新的五分之一LB固體平板上，直至純化成單菌落。所有純菌株依次編號，并進行常規(guī)菌種保藏，以斜面的形式存放于4℃冰箱之中。
將上述純化菌株，逐一轉(zhuǎn)接至固體檢測平板上，28℃倒置培養(yǎng)2天。觀察菌落周圍是否產(chǎn)生變色圈，并做詳細(xì)記錄，以變色圈的直徑大小作為產(chǎn)鐵載體菌產(chǎn)鐵載體能力強弱的初步判定。此外，須同時設(shè)置Escherichia coli DH5α菌株為陰性對照。
鐵載體定量測定依照陳紹興等報道(陳紹興，趙翔，沈萍，等.高靈敏假單胞菌鐵載體的平板檢測方法.微生物學(xué)通報，2006，33：122-127)進行，將各自供試菌株培養(yǎng)液以1％的量接入到30mL MSA液體培養(yǎng)基，28℃，200r/min培養(yǎng)24h，10000r/min離心15min，上清液用0.22微米的微孔濾膜過濾，并與等體積CAS檢測液混合均勻。室溫條件下，放置充分后測定各樣品的OD680(As)值，以雙蒸水作對照調(diào)零。相同方法測定以未接菌的各液體培養(yǎng)基作為上清液的吸光值，以此為參比值(Ar)。鐵載體的濃度用鐵載體活性單位表示，每處理重復(fù)4次。隨后，依據(jù)Persmark等人的報道(Persmark M,Expert D,Neilands JB.Isolation,characterization,and synthesis of chrysobactin,a compound withsiderophore activity from Erwinia chrysanthemi.The Journal of Biological Chemistry,1989,264:3187-3193)對各菌株產(chǎn)鐵載體能力進行分級。
結(jié)果，在五分之一LB固體平板上共計獲得可培養(yǎng)菌株126株，其中9株具備鐵載體產(chǎn)生能力(參見表3)。在具備鐵載體產(chǎn)生能力的菌株中，又以S17菌株的能力最強，S86菌株次之。
表3、鐵載體產(chǎn)生菌產(chǎn)鐵載體能力記錄表
實施例2：Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86的抗生素敏感性試驗與病原真菌拮抗能力測試
抗生素敏感試驗采用濾紙片法，選擇氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素和鏈霉素五種常用抗生素，以各個抗生素濾紙片在培養(yǎng)鐵載體產(chǎn)生菌S17和S86平板上的抑菌圈直徑大小，作為敏感或者耐(抗)藥的判定標(biāo)準(zhǔn)。表4和表5給出的試驗結(jié)果表明，菌株S17和S86對上述供試抗生素均呈不同程度敏感反應(yīng)。
表4、菌株S17的抗生素敏感性試驗結(jié)果
注：抑菌圈直徑大于中度敏感范圍上限值的為高度敏感，小于敏感范圍下限值的為抗性(下同)。
表5、菌株S86的抗生素敏感性試驗結(jié)果
本實施例說明當(dāng)Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86菌體被釋放到自然環(huán)境中時，不會因抗(耐)藥性問題而成為超級細(xì)菌，這就為其后續(xù)實際應(yīng)用提供了安全保證。
以10種病原菌——番茄灰霉病病菌、番茄早疫病病菌、茄子枯萎病病菌、甜瓜蔓枯病病菌、油菜菌核病病菌、青霉、棉花枯萎病病菌、黑曲霉、小麥紋枯病病菌和小麥葉枯病病菌為指示菌，利用平板對峙法測定S17和S86的病菌真菌拮抗能力。在通用PDA平板中央接種指示菌，四周分別接種S17和S86，每組試驗重復(fù)5次，通過菌落半徑和抑菌帶寬度明確菌株S17和S86的拮抗能力。
結(jié)果如表6所示，Pseudomonas sp.S17對供試的青霉、黑曲霉和油菜菌核病病菌呈明顯拮抗性，Bacillus sp.S86則對番茄灰霉病、番茄早疫病、茄子枯萎病、棉花枯萎病、油菜菌核病和甜瓜蔓枯病病菌呈不同程度結(jié)抗性。
表6、Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86的拮抗能力測試
注：陰性記為“-”；抑菌圈直徑0-5mm記為“+”；抑菌圈直徑5-10mm記為“++”；抑菌圈直徑10-15mm記為“+++”；抑菌圈直徑大于15mm的記為“++++”。
實施例3：Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86的重金屬最小抑制濃度(MIC)測試
MIC試驗設(shè)計參照Filali等人的研究進行(Filali BK，Taoufik J，Zeroual Y，Dzairi FZ，Talbi M，Blaghen M.Waste water bacterial isolates resistant to heavymetals and antibiotics.Current Microbiology，2000，41：151-156)，分別挑取等大、經(jīng)活化處理的S17和S86單菌落于培養(yǎng)試管中，30℃，160r/min振蕩培養(yǎng)32小時。依菌體長勢判定MIC值，每組設(shè)3個重復(fù)，分別測試菌株對12種金屬離子的耐受情況。結(jié)果如表7所示，供試菌株具多重重金屬耐受(抗)性，性狀優(yōu)異。
表7、MIC測試結(jié)果
注：表中數(shù)據(jù)為3個測定值的平均值。
實施例4：Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86的溶磷與產(chǎn)3-吲哚乙酸能力測試
用接種環(huán)分別從試管斜面上取一環(huán)Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86，分別接種于盛有50mL液體LB培養(yǎng)基的三角瓶中，160r/min振蕩培養(yǎng)24h，然后各自取1mL(約1×108CFU)培養(yǎng)物，分別接種到以Ca3(PO4)2為唯一磷源的100mL無機磷發(fā)酵培養(yǎng)基【葡萄糖10g，(NH4)2SO4 1g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002g，MnSO4·H2O 0.002g，Ca3(PO4)2 5g，蒸餾水定容至1000mL，pH 7.5】中，30℃振蕩培養(yǎng)(160r/min)48h，設(shè)置3個重復(fù)。運用通用鉬銻抗比色法測定磷含量——各自取1mL培養(yǎng)液于相應(yīng)編號的離心管中，5000r/min離心10min。準(zhǔn)確取1mL上清于相應(yīng)編號的25mL容量瓶中，再加入2.5mL鉬銻抗顯示劑，然后用蒸餾水定容。在室溫下反應(yīng)30min后，使用分光光度計測定700nm波長處吸光值，用mg P2O5/L來表示。以不接菌的處理為空白對照，實驗設(shè)3個重復(fù)。結(jié)果，測得Pseudomonas sp.S17溶磷量為88.6±2.26mg/L，Bacillus sp.S86不具溶磷能力。
向含有L-色氨酸(200mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中分別接入Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86，28℃、160r/min培養(yǎng)3天。隨后以分光光度法測定各自菌懸液的OD600值，然后將菌懸液10000r/min離心10min，取上清液加入等體積Salkowski比色液(Libbert E and Risch H.Interactions between plants andepiphytic bacteria regarding their auxin metabolism[J].Physiologia Plantarum，1969，22：51–58)，避光靜置30min使其顯色，測定OD530值。計算單位體積菌液中3-吲哚乙酸的含量，設(shè)置3個重復(fù)，并以不產(chǎn)3-吲哚乙酸的E.coli DH5α為陰性對照。結(jié)果，測得S17菌株3-吲哚乙酸得率為62.8±0.86mg/L，S86菌株和陰性對照均未檢測到3-吲哚乙酸。
人們在以往重金屬污染場地修復(fù)過程中發(fā)現(xiàn)——不少修復(fù)植株會因營養(yǎng)匱乏(特別是缺少磷元素)、吸收受限，以及生長受抑制等原因無法最大程度地發(fā)揮修復(fù)吸收作用。本實施例表明，Pseudomonas sp.S17具備溶磷和產(chǎn)3-吲哚乙酸的能力，而這對強化植株存活、生長及其修復(fù)效用而言是非常實際且重要的。
實施例5：Pseudomonas sp.S17、Bacillus sp.S86和Stenotrophomonas rhizophilaLD-6共同強化甜高粱吸收重金屬的應(yīng)用
一種鐵載體高產(chǎn)菌制劑，該制劑由A、B、C三種菌液復(fù)配獲得。
A菌液：以Pseudomonas sp.S17為初始接種物，29℃，工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH4)2SO4 6g/L，玉米漿6g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MnSO40.05g/L，pH 7.2)發(fā)酵培養(yǎng)24小時制得。
B菌液：以Bacillus sp.S86為初始接種物，28℃，工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH4)2SO4 6g/L，玉米漿6g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MnSO40.05g/L，pH 7.5)發(fā)酵培養(yǎng)24小時制得。
C菌液：以Stenotrophomonas rhizophila LD-6為初始接種物，30℃，工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH4)2SO4 6g/L，玉米漿6g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MnSO4 0.05g/L，pH 7.2)發(fā)酵培養(yǎng)24小時制得。
復(fù)配前，A、B、C三種菌液分別以無菌水或自來水各自調(diào)節(jié)菌體濃度至1.0×108CFU/mL。然后，按照VA:VB:VC＝2:2:1(體積比)比例進行復(fù)配，即得鐵載體高產(chǎn)菌制劑。
試驗所用土壤采自未受重金屬污染的菜園，其主要理化性質(zhì)如下：有機質(zhì)4.84％，總氮832.6mg/kg，總磷292.1mg/kg，總鉀220.3mg/kg，速效氮68.2mg/kg，速效磷18.1mg/kg，速效鉀58.3mg/kg，pH6.2。重金屬含量為鎘0.21mg/kg，銅58mg/kg，鋅101mg/kg。風(fēng)干過篩后，分別加入不同含量的溶液態(tài)氯化鎘、氯化鋅和硫酸銅，使土壤中Cd2+的濃度為25mg/kg，Zn2+的濃度為800mg/kg，Cu2+的濃度為800mg/kg。充分混勻污染土壤，60％濕度條件下穩(wěn)定2個月后測試。
修復(fù)植物甜高粱的種子購于臨安市江橋路門市。種子先萌芽，待幼苗長至10cm左右時，挑選長勢一致的幼苗移栽入1.5kg先前穩(wěn)定好的重金屬污染土壤塑料盆(高13cm，直徑17cm)中，每盆1顆。移栽7天后，待植株生長正常，在各自植株的根部接入1mL新鮮配置，且搖勻的鐵載體高產(chǎn)菌制劑。
為避免培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分影響測試結(jié)果，上述接入菌液為經(jīng)無菌水洗滌3遍后，以無菌水重新懸浮的菌液。試驗設(shè)4個處理：未種植物且未加菌的空白對照(C)、只種植物不接菌(P)、不種植物但加菌(M)，以及既種植物也加菌(PM)，每個處理設(shè)5個平行樣。定期澆水，保持每天8h的光照，甜高粱在溫室下生長82天后收獲，根系洗凈后用10mmol的EDTA溶液浸泡30min，再用去離子水沖洗2遍。植株在105℃殺青后80℃烘至恒重，稱取根、地上部的干重。植物組織消解(HClO4∶HNO3＝1∶4)后，測定其重金屬含量，全程序做空白對照以消除干擾。
結(jié)果如表8所示，接入Pseudomonas sp.S17、Bacillus sp.S86和Stenotrophomonas rhizophila LD-6能夠顯著提高甜高粱的生物量和重金屬吸收量。其中，地上部和根部的干重比未接菌的對照分別增加了31.2％和36.0％(PM處理與P處理相比)，而甜高粱地上部Cd2+、Zn2+和Cu2+的總含量分別提高了75.5％、74.5％和72.9％。證實S17、S86和LD-6復(fù)配菌劑具備促進甜高粱生長、強化甜高粱吸收供試重金屬的能力。
表8、甜高粱地上部與根部的重金屬吸收量
注：重金屬含量＝生物量×重金屬濃度；提取效率為植株提取的重金屬總量(根部與地上部之和)與初始土壤中重金屬總含量之比；*表示該值與相應(yīng)的對照值存在顯著差異(P<0.05)。
同最接近的現(xiàn)有技術(shù)相比(張璐.產(chǎn)鐵載體細(xì)菌強化甜高粱修復(fù)土壤重金屬污染.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2014，37：74-79)，本發(fā)明“植物+微生物”處理的地上部干重，地上部Cd2+、Zn2+和Cu2+的總含量，及各自提取效率較其分別提升了8.8％，17.7％、13.8％和21.0％，及18.1％、14.8％和21.4％，效果更佳，優(yōu)勢顯著。而在提取率提升方面(PM處理提取率/P處理提取率)，本發(fā)明三種重金屬提取率提升效果較其分別提升了39.5％、95.6％和26.0％，優(yōu)勢顯著。此外，需要指明的是，Pseudomonas sp.S17同上述張璐研究中的Pseudomonas sp.T07不是同一種菌。因為，其在生理生化特征方面有著明顯區(qū)別(參見表1)，具體表現(xiàn)在接觸酶、氧化酶、葡萄糖利用能力和甲基紅試驗四個測試項目上。