本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵，特別是指一種菩薩根瘤菌及其制取β-1，3葡聚糖發(fā)酵液的方法。
背景技術(shù)：
：β-1，3葡聚糖是一類具有以β-1，3葡聚糖連接的具有多種生物活性的葡萄糖聚合物。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中的功效表現(xiàn)為：保濕、抗炎、抗衰老、去皺、去頭屑、退黃、加快修復(fù)、增加皮膚彈性、輔助抗菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、輔助降血糖、降血脂、改善胃腸功能等。廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、化妝品、動物飼料添加劑等多個(gè)領(lǐng)域。葡聚糖以β-1，3葡聚糖最具生理活性，β-1，3葡聚糖廣泛存在于各種真菌與植物(如香菇、靈芝和燕麥)中，是它們發(fā)揮保健作用的主要功效物質(zhì)。在二十世紀(jì)四十年代，Pillemer博士首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道酵母細(xì)胞壁有一種物質(zhì)具有提高免疫力的作用。之后經(jīng)過圖倫大學(xué)Diluzio博士進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞壁中提高免疫力物質(zhì)是一種多糖——β-1，3葡聚糖，并從面包酵母中分離出這種物質(zhì)。β-葡聚糖活性結(jié)構(gòu)是由葡萄糖單位組成的多聚糖，它們大多數(shù)是通過β-1，3結(jié)合，這是葡萄糖鏈連接方式。它能夠活化巨噬細(xì)胞與嗜中性白血球等，因此能提高白細(xì)胞素、細(xì)胞分裂素和特殊抗體含量，全面刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)。那么機(jī)體就有更多準(zhǔn)備去抵抗微生物引起的疾病。β-1，3葡聚糖能使受傷機(jī)體淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(IL-1)的能力迅速恢復(fù)正常，有效調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能。大量實(shí)驗(yàn)表明，β-1，3葡聚糖可促進(jìn)體內(nèi)IgM抗體產(chǎn)生，以提高體液免疫能力。這種葡聚糖活化細(xì)胞會激發(fā)宿主非專一性防御機(jī)制，故應(yīng)用在腫瘤、感染病與治療創(chuàng)傷方面深受矚目。經(jīng)特殊步驟萃取且不含內(nèi)毒素β-1，3葡聚糖在美國FDA已認(rèn)定是安全的物質(zhì)，可添加于一般食品，許多報(bào)導(dǎo)顯示老鼠口服酵母β-1，3葡聚糖，可增加強(qiáng)腹膜細(xì)胞抗菌吞噬作用。此外，葡聚糖尚有清除游離基、抗輻射、溶解膽固醇，預(yù)防高脂血癥作用及抵抗濾過性病毒、真菌、細(xì)菌等引起的感染，故可廣泛用于醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)，目前酵母葡聚糖已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，具有廣闊的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)的β-1，3葡聚糖制取方法為從酵母細(xì)胞壁分離制得，產(chǎn)品不易溶解于水，傳統(tǒng)工藝中存在工藝復(fù)雜，控制繁瑣的缺點(diǎn)，工藝控制不穩(wěn)定。申請人檢索到的專利文獻(xiàn)包括:專利號為201010146371.2的文獻(xiàn)中公開了一種土壤桿菌ZX09，用土壤桿菌ZX09生產(chǎn)的水溶性β-葡聚糖及其制備方法及在降低血糖上的應(yīng)用。土壤桿菌ZX09在山東東營的鹽土中分離得到。以蔗糖或乳糖為碳源能很好地生長，可以利用的碳源為D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖或D-木糖，不能利用碳源為麥芽糖。發(fā)酵周期為48-72小時(shí)，發(fā)酵48小時(shí)后的發(fā)酵液最高粘度可達(dá)到20000mPa·s(NDJ-1RotationalViscometer，Rotor為3，RPM為6，上海天平儀器廠)。該現(xiàn)有技術(shù)存在的問題一是菌種不能利用麥芽糖；二是發(fā)酵周期長(48-72小時(shí))；三是發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液的粘度較低(最高粘度可達(dá)到20000mPa·s)；四是未對發(fā)酵收率進(jìn)行說明。專利號為201210281755.4的文獻(xiàn)中公開了一種放射形土壤桿菌突變株，該菌種經(jīng)500L發(fā)酵罐中培養(yǎng)90-100小時(shí)，即得β-1,3葡聚糖含量4％以上的發(fā)酵液。上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題一是發(fā)酵周期長(90-100小時(shí))；二是未對發(fā)酵液的水溶性及粘度進(jìn)行量化說明；三是僅公開了以蔗糖或葡萄糖作為碳源。專利號為201510123040.X中公開了一種利用熱凝膠發(fā)酵液直接生產(chǎn)β-1,3葡寡糖的方法，其中公開了如下技術(shù)方案：先利用土壤桿菌ATCC31749通風(fēng)發(fā)酵獲得熱凝膠發(fā)酵液，對熱凝膠發(fā)酵液進(jìn)行熱堿滅活處理后，作為培養(yǎng)哈茨木霉的培養(yǎng)基組分之一，添加氮源和微量元素輔料后，哈茨木霉經(jīng)通風(fēng)培養(yǎng)獲得富含β-1,3葡聚糖內(nèi)切酶的哈茨木霉發(fā)酵液；該哈茨木霉發(fā)酵液再與未經(jīng)熱堿滅活處理的新鮮熱凝膠發(fā)酵液混合并進(jìn)行催化水解反應(yīng)，不對酶液和反應(yīng)底物進(jìn)行分離提取，直接得到β-1,3葡寡糖粗制品。該現(xiàn)有技術(shù)存在的問題一是生產(chǎn)工藝繁瑣，不易控制；二是工藝過程時(shí)間長；三是未對β-1,3葡寡糖的技術(shù)參數(shù)及發(fā)酵收率進(jìn)行說明。專利號為01806862.6的文獻(xiàn)中公開了來自絲狀真菌的β葡聚糖，上述方法中包括發(fā)酵非病原腐生絲狀真菌測懸浮液和從懸浮液中提取β葡聚糖。該現(xiàn)有技術(shù)存在的主要問題一是生產(chǎn)工藝繁瑣，不易控制；二是發(fā)酵周期長，至少約50小時(shí)，優(yōu)選為96小時(shí)；三是未對β葡聚糖的粘度指標(biāo)進(jìn)行說明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供一種具有較好β-1,3葡聚糖生產(chǎn)能力的菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954。本發(fā)明的目的之二是提供一種利用菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954制取β-1,3葡聚糖發(fā)酵液的方法。發(fā)酵培養(yǎng)液中使用玉米淀粉水解液、麥芽糖為碳源；發(fā)酵過程采用溫度分段控制的發(fā)酵工藝，更有利于菌種的生長代謝，該方法收率明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)，且所得到的β-1,3葡聚糖水溶性好。本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是：一種菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954。本發(fā)明中的菌種菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954申請人已于2016年9月12日提交位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，該保藏單位簡稱CGMCC。由于本發(fā)明中的菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954按照保藏單位的鑒定結(jié)果目前僅有拉丁文名稱，尚無中文名稱，菌種的中文名稱一般是由首位使用該菌種的人員翻譯，該菌種的中文命名原則如下：Rhizobiumpusense(pu.sen9se.N.L.neut.adj.pusensebelongingtoPusa，India，thegeographicaloriginofthetypestrain)。該菌種的中文名稱是按照菌株分離的地理位置命名的，意思是來自pusa的菌，因此申請人將其中文名稱翻譯成菩薩根瘤菌。該菌種的形態(tài)特征及生理生化特征如下：本發(fā)明中的菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954系申請人于河北省衡水市衡水湖土壤中分離得到，顯微鏡觀察細(xì)胞呈桿狀，革蘭氏染色為陰性。菌株菌落為圓形、隆起，邊緣光滑整齊，菌體主要集中于菌落中央，呈白色；在菌體四周有白色偏透明的粘性胞外產(chǎn)物出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長，胞外產(chǎn)物的量不斷增多，并以菌落中央為圓心向四周擴(kuò)散，可利用包括玉米淀粉水解液、麥芽糖等碳源。發(fā)酵48小時(shí)后的發(fā)酵液粘度可達(dá)到30000mPa·s。利用菩薩根瘤菌制取β-1，3葡聚糖發(fā)酵液的方法，該方法包括如下工藝步驟：A、將菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954接種到滅菌后且含有碳源、氮源及必要營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)液中；B、進(jìn)行通氣攪拌發(fā)酵；C、當(dāng)培養(yǎng)液粘度不再增長或發(fā)酵周期≤48小時(shí)發(fā)酵結(jié)束。本發(fā)明的具體技術(shù)構(gòu)思還有：為更有利于菌種的生長，本發(fā)明中培養(yǎng)菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954的培養(yǎng)基中優(yōu)選的碳源及氮源是，所述的步驟A的培養(yǎng)液中的碳源選自葡萄糖、麥芽糖、玉米淀粉水解液、玉米漿粉中的一種或其結(jié)合；氮源選自豆粉、豆油、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨中的一種或其結(jié)合。為便于控制發(fā)酵周期，為菌體提供有利的生長環(huán)境，優(yōu)選的技術(shù)實(shí)現(xiàn)方式是，所述的步驟A中按種子液：培養(yǎng)液的體積百分比為12％-18％的接種量將菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954接入發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液中。為提供良好的生長環(huán)境保證菌體正常生長，優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的步驟A中接種是當(dāng)滅菌后培養(yǎng)液溫度降至30-32℃時(shí)進(jìn)行。所述的玉米淀粉水解液優(yōu)選采用如下方法制作：將玉米淀粉用自來水配成質(zhì)量百分比濃度為30％的混合液，升溫至90-95℃，維持40分鐘。為便于發(fā)酵過程中的菌體生長以及終產(chǎn)物的獲得，本發(fā)明的步驟A中的發(fā)酵所用的培養(yǎng)液優(yōu)選采用如下方式，所述的步驟A中培養(yǎng)液由如下質(zhì)量百分含量的組份組成：玉米淀粉水解液4.0％-4.5％；麥芽糖2.0％-2.5％；豆粉0.3％-0.5％；硫酸鎂0.1％-0.15％；豆油0.05％-0.15％；余量為無菌水；pH＝8.0-8.5。步驟A中的培養(yǎng)液優(yōu)選采用如下方式配置，所述的步驟A中培養(yǎng)液配制過程如下：將培養(yǎng)液中各組分按比例投入發(fā)酵罐中，加自來水至規(guī)定計(jì)料體積，攪拌30-40分鐘使之溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)培養(yǎng)液pH＝8.0-8.5，攪拌30-40分鐘混合均勻。為提高收率、滿足菌體的生長并有利于終產(chǎn)物的生成，本發(fā)明的通氣發(fā)酵過程中優(yōu)選的發(fā)酵條件是，步驟B包括如下工藝步驟:10-30小時(shí)：溫度30℃-32℃，壓力0.03-0.05MPa，pH＝7.0-7.3，通風(fēng)量0.4-0.5vvm；31小時(shí)-放罐：溫度26℃-29℃，壓力0.03-0.05MPa，pH＝7.0-7.3，通風(fēng)量0.4-0.5vvm。為使培養(yǎng)液中的營養(yǎng)豐富，更有利于菌種的生長代謝。優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的步驟B中進(jìn)行通氣攪拌發(fā)酵過程中補(bǔ)入雙氧水及微量元素；具體條件如下：12-15小時(shí)：補(bǔ)入微量元素；23-26小時(shí)：補(bǔ)入雙氧水；微量元素優(yōu)選采用如下實(shí)施方式，所述的微量元素采用如下方式配制成微量元素溶液：檸檬酸100g，氫氧化鈣5g，氫氧化鎂7g，硫酸錳0.083g，硫酸鋅0.066g，五水硫酸銅0.025g，七水硫酸鈷0.028g，硫酸鎂8.6g，硫酸亞鐵1.8g，硼酸0.006g，加蒸餾水定容至1000ml后滅菌；微量元素溶液的加入量為每1000L培養(yǎng)液加入微量元素溶液1L。雙氧水優(yōu)選采用如下實(shí)施方式，所述的雙氧水的質(zhì)量百分比濃度為2-3％，加入量為培養(yǎng)液體積的0.05％。為便于工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)滿足生產(chǎn)中工業(yè)化生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性，優(yōu)選的實(shí)施方式是，步驟A是將菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后，按照種子液：發(fā)酵規(guī)定計(jì)料體積培養(yǎng)液的體積百分比為12％-18％的接種量接種于培養(yǎng)液中。所述的擴(kuò)大培養(yǎng)過程包括：(1)將菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954接種于搖瓶種子培養(yǎng)基表面制成搖瓶種子；(2)將搖瓶種子經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后制成種子液；(3)將制成的種子液按種子液：發(fā)酵規(guī)定計(jì)料體積培養(yǎng)液的體積百分比為12％-18％的接種量接入發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液，進(jìn)行發(fā)酵。所述的擴(kuò)大培養(yǎng)過程步驟(1)中制備搖瓶種子的工藝條件是：挑取2環(huán)斜面菌種接入滅菌后的搖瓶種子培養(yǎng)基中，經(jīng)振蕩培養(yǎng)制成搖瓶種子，培養(yǎng)溫度為30-32℃，搖床轉(zhuǎn)速為200-220轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)周期為10-14小時(shí)；搖瓶種子培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成：葡萄糖2.5％-2.8％；麥芽糖1.5％-2.0％；蛋白胨1.0％-1.5％；玉米漿粉1.0％-1.5％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3。所述的擴(kuò)大培養(yǎng)過程步驟(2)中的擴(kuò)大培養(yǎng)依次包括一級種子的制備、二級種子的制備，其中一級種子培養(yǎng)液由下列質(zhì)量百分含量的組分組成：葡萄糖2.5％-2.8％；麥芽糖1.5％-2.0％；酵母膏0.4％-0.6％；硫酸銨0.2％-0.3％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3；接種量為搖瓶種子：一級種子培養(yǎng)液的體積比＝0.8％-1.0％，將搖床種子接入滅菌后的一級種子培養(yǎng)液經(jīng)過培養(yǎng)制成一級種子，一級種子的制備過程中的工藝條件是培養(yǎng)溫度30℃-32℃，通風(fēng)量0.9vvm-1.0vvm，培養(yǎng)周期10-14小時(shí)。所述的二級種子培養(yǎng)液由如下質(zhì)量百分含量的組份組成：葡萄糖2.5％-2.8％；麥芽糖1.5％-2.0％；豆粉0.8％-1.0％；硫酸銨0.2％-0.3％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3；接種量為一級種子：二級種子培養(yǎng)液的體積比＝12％-18％，將一級種子接入滅菌后的二級種子培養(yǎng)液經(jīng)過培養(yǎng)制成二級種子，二級種子的制備過程中的工藝條件是培養(yǎng)溫度30℃-32℃，通風(fēng)量0.9vvm-1.0vvm，培養(yǎng)周期8h-10h。所述的步驟C中培養(yǎng)液的粘度測定方法如下：選用上海天平儀器廠的NDJ-1RotationalViscometer，步驟為取培養(yǎng)液500ml置于燒杯內(nèi)，用Rotor為3，RPM為6測定，讀出表盤示數(shù)乘以系數(shù)即得粘度值。為驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)效果，申請人進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)：一、根據(jù)β-1,3葡聚糖具有水溶性，溶液只要很低的濃度就可產(chǎn)生很高粘度的性能，在目前未見國標(biāo)的情況下，參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑黃原膠》(GB1886.41-2015)中附錄A中A.3條款粘度的檢測方法，評價(jià)β-1,3葡聚糖產(chǎn)品粘度值，具體方法如下：1、粉末產(chǎn)品的制備：發(fā)酵結(jié)束將最終的發(fā)酵液加入2倍體積的95％乙醇后，6000g重力離心15min獲得固體沉淀，60℃干燥至恒重，研磨成粉末備用。2、評價(jià)結(jié)果粘度值大于1500cp。二、收率的檢測收率的檢測目前尚無國標(biāo)，行業(yè)中測定一般采用如下方法：1、所用儀器恒溫箱、分析天平(0.001g)。2、檢測方法將發(fā)酵液倒入一定體積的小燒杯中，用玻璃棒攪拌使其無氣泡，用玻璃棒把表面抹平，把杯子外的發(fā)酵液清洗干凈。發(fā)酵液用90％-95％的乙醇提取、沉降、過濾布擠干，將其撕碎后全部徹底移入到培養(yǎng)皿中，然后放入105℃烘箱中烘至恒重(約4小時(shí))，拿出稱重。固含量＝稱樣克數(shù)/體積×100％。3、檢測結(jié)果采用本發(fā)明的方法的發(fā)酵收率為5.0g-5.5g/L。本發(fā)明所具備的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的技術(shù)進(jìn)步在于：1、本發(fā)明公開了一種菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954，該菌種具有較好的β-1,3葡聚糖生產(chǎn)能力，且可以利用包括葡萄糖、麥芽糖、玉米淀粉水解液、玉米漿粉在內(nèi)的碳源，便于工業(yè)化生產(chǎn)且成本低廉。2、采用本發(fā)明的方法制備β-1,3葡聚糖，發(fā)酵收率及粘度高，發(fā)酵收率達(dá)到5.0g-5.5g/L，粘度可達(dá)1550-1630cp。3、發(fā)酵過程中采用階段控溫與過程中補(bǔ)入微量元素、雙氧水的發(fā)酵工藝條件，使發(fā)酵控制穩(wěn)定，促進(jìn)菌種的生長和代謝。4、本發(fā)明能夠通過發(fā)酵制得β-1,3葡聚糖，生產(chǎn)成本低、周期短，不受季節(jié)和地域的限制，易于操縱，供給穩(wěn)定等，具有較強(qiáng)的市場競爭力和廣闊的應(yīng)用前景。5、采用本發(fā)明的方法制取的β-1,3葡聚糖，具有水溶性，少量β-1,3葡聚糖即能配成高粘度溶液，可作為增稠劑、懸浮劑等應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品等行業(yè)中。本發(fā)明中的菌種菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954申請人已于2016年9月12日提交位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，該保藏單位簡稱CGMCC。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但不作為對本發(fā)明的限定，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求記載的內(nèi)容為準(zhǔn)，任何依據(jù)說明書做出的等效技術(shù)手段替換，均不脫離本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1一種菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954。利用土壤桿菌制取β-1，3葡聚糖發(fā)酵液的方法，該方法包括如下工藝步驟：A、將菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954接種到滅菌后且含有碳源、氮源及必要營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)液中；B、進(jìn)行通氣攪拌發(fā)酵；C、當(dāng)培養(yǎng)液粘度不再增長或發(fā)酵周期≤48小時(shí)發(fā)酵結(jié)束。所述的步驟A中按種子液：培養(yǎng)液的體積百分比為12％-18％的接種量將菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954接入發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液中。所述的步驟A中接種是當(dāng)滅菌后培養(yǎng)液溫度降至30-32℃時(shí)進(jìn)行。所述的玉米淀粉水解液采用如下方法制作：將玉米淀粉用自來水配成質(zhì)量百分比濃度為30％的混合液，升溫至90-95℃，維持40分鐘。所述的步驟A中培養(yǎng)液由如下質(zhì)量百分含量的組份組成：玉米淀粉水解液4.0％；麥芽糖2.0％；豆粉0.3％；硫酸鎂0.1％；豆油0.05％；余量為無菌水；pH＝8.0-8.5。所述的步驟A中培養(yǎng)液配制過程如下：將培養(yǎng)液中各組分按比例投入發(fā)酵罐中，加自來水至規(guī)定計(jì)料體積，攪拌30-40分鐘使之溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)培養(yǎng)液pH＝8.0-8.5，攪拌30-40分鐘混合均勻。步驟B包括如下工藝步驟:10-30小時(shí)：溫度30℃，壓力0.03MPa，pH＝7.0-7.3，通風(fēng)量0.4vvm；31小時(shí)-放罐：溫度26℃，壓力0.03MPa，pH＝7.0-7.3，通風(fēng)量0.4vvm。所述的步驟B中進(jìn)行通氣攪拌發(fā)酵過程中補(bǔ)入雙氧水及微量元素；具體條件如下：15小時(shí)：補(bǔ)入微量元素；26小時(shí)：補(bǔ)入雙氧水；所述的微量元素采用如下方式配制成微量元素溶液：檸檬酸100g，氫氧化鈣5g，氫氧化鎂7g，硫酸錳0.083g，硫酸鋅0.066g，五水硫酸銅0.025g，七水硫酸鈷0.028g，硫酸鎂8.6g，硫酸亞鐵1.8g，硼酸0.006g，加蒸餾水定容至1000ml后滅菌；微量元素溶液的加入量為每1000L培養(yǎng)液加入微量元素溶液1L。所述的雙氧水的質(zhì)量百分比濃度為2％，加入量為培養(yǎng)液體積的0.05％。步驟A是將菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后，按照種子液：發(fā)酵規(guī)定計(jì)料體積培養(yǎng)液的體積百分比為12％-18％的接種量接種于培養(yǎng)液中。所述的擴(kuò)大培養(yǎng)過程包括：(1)將菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954接種于搖瓶種子培養(yǎng)基表面制成搖瓶種子；(2)將搖瓶種子經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后制成種子液；(3)將制成的種子液按種子液：發(fā)酵規(guī)定計(jì)料體積培養(yǎng)液的體積百分比為12％的接種量接入發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液，進(jìn)行發(fā)酵。所述的擴(kuò)大培養(yǎng)過程步驟(1)中制備搖瓶種子的工藝條件是：挑取2環(huán)斜面菌種接入滅菌后的搖瓶種子培養(yǎng)基中，經(jīng)振蕩培養(yǎng)制成搖瓶種子，培養(yǎng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)周期為14小時(shí)；搖瓶種子培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成：葡萄糖2.5％；麥芽糖1.5％；蛋白胨1.0％；玉米漿粉1.0％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3。所述的擴(kuò)大培養(yǎng)過程步驟(2)中的擴(kuò)大培養(yǎng)依次包括一級種子的制備、二級種子的制備，其中一級種子培養(yǎng)液由下列質(zhì)量百分含量的組分組成：葡萄糖2.5％；麥芽糖1.5％；酵母膏0.4％；硫酸銨0.2％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3；接種量為搖瓶種子：一級種子培養(yǎng)液的體積比＝0.8％，將搖床種子接入滅菌后的一級種子培養(yǎng)液經(jīng)過培養(yǎng)制成一級種子，一級種子的制備過程中的工藝條件是培養(yǎng)溫度30℃，通風(fēng)量0.9vvm，培養(yǎng)周期14小時(shí)。所述的二級種子培養(yǎng)液由如下質(zhì)量百分含量的組份組成：葡萄糖2.5％；麥芽糖1.5％；豆粉0.8％；硫酸銨0.2％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3；接種量為一級種子：二級種子培養(yǎng)液的體積比＝12％，將一級種子接入滅菌后的二級種子培養(yǎng)液經(jīng)過培養(yǎng)制成二級種子，二級種子的制備過程中的工藝條件是培養(yǎng)溫度30℃，通風(fēng)量0.9vvm，培養(yǎng)周期10小時(shí)。所述的步驟C中培養(yǎng)液的粘度測定方法如下：選用上海天平儀器廠的NDJ-1RotationalViscometer，步驟為取培養(yǎng)液500ml置于燒杯內(nèi)，用Rotor為3，RPM為6測定，讀出表盤示數(shù)乘以系數(shù)即得粘度值。實(shí)施例2本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于：所述的步驟A中按種子液：培養(yǎng)液的體積百分比為18％的接種量將菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954接入發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液中。所述的步驟A中培養(yǎng)液由如下質(zhì)量百分含量的組份組成：玉米淀粉水解液4.5％；麥芽糖2.5％；豆粉0.5％；硫酸鎂0.15％；豆油0.15％；余量為無菌水；pH＝8.0-8.5。所述的步驟A中培養(yǎng)液配制過程如下：將培養(yǎng)液中各組分按比例投入發(fā)酵罐中，加自來水至規(guī)定計(jì)料體積，攪拌40分鐘使之溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)培養(yǎng)液pH＝8.0-8.5，攪拌40分鐘混合均勻。步驟B包括如下工藝步驟:10-30小時(shí)：溫度32℃，壓力0.05MPa，pH＝7.0-7.3，通風(fēng)量0.5vvm；31小時(shí)-放罐：溫度29℃，壓力0.05MPa，pH＝7.0-7.3，通風(fēng)量0.5vvm。所述的步驟B中進(jìn)行通氣攪拌發(fā)酵過程中補(bǔ)入雙氧水及微量元素；具體條件如下：12小時(shí)：補(bǔ)入微量元素；23小時(shí)：補(bǔ)入雙氧水；將步驟A是將菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后，按照種子液：發(fā)酵規(guī)定計(jì)料體積培養(yǎng)液的體積百分比為18％的接種量接種于培養(yǎng)液中。所述的擴(kuò)大培養(yǎng)過程步驟(1)中制備搖瓶種子的工藝條件是：挑取2環(huán)斜面菌種接入滅菌后的搖瓶種子培養(yǎng)基中，經(jīng)振蕩培養(yǎng)制成搖瓶種子，培養(yǎng)溫度為32℃，搖床轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)周期為10小時(shí)；搖瓶種子培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成：葡萄糖2.8％；麥芽糖2.0％；蛋白胨1.5％；玉米漿粉1.5％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3。所述的擴(kuò)大培養(yǎng)過程步驟(2)中的擴(kuò)大培養(yǎng)依次包括一級種子的制備、二級種子的制備，其中一級種子培養(yǎng)液由下列質(zhì)量百分含量的組分組成：葡萄糖2.8％；麥芽糖2.0％；酵母膏0.6％；硫酸銨0.3％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3；接種量為搖瓶種子：一級種子培養(yǎng)液的體積比＝1.0％，將搖床種子接入滅菌后的一級種子培養(yǎng)液經(jīng)過培養(yǎng)制成一級種子，一級種子的制備過程中的工藝條件是培養(yǎng)溫度32℃，通風(fēng)量1.0vvm，培養(yǎng)周期10小時(shí)。所述的二級種子培養(yǎng)液由如下質(zhì)量百分含量的組份組成：葡萄糖2.8％；麥芽糖2.0％；豆粉1.0％；硫酸銨0.3％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3；接種量為一級種子：二級種子培養(yǎng)液的體積比＝18％，將一級種子接入滅菌后的二級種子培養(yǎng)液經(jīng)過培養(yǎng)制成二級種子，二級種子的制備過程中的工藝條件是培養(yǎng)溫度32℃，通風(fēng)量1.0vvm，培養(yǎng)周期8小時(shí)。其余內(nèi)容與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于：所述的步驟A中按種子液：培養(yǎng)液的體積百分比為15％的接種量將菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954接入發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液中。所述的步驟A中培養(yǎng)液由如下質(zhì)量百分含量的組份組成：玉米淀粉水解液4.2％；麥芽糖2.3％；豆粉0.4％；硫酸鎂0.13％；豆油0.1％；余量為無菌水；pH＝8.0-8.5。所述的步驟A中培養(yǎng)液配制過程如下：將培養(yǎng)液中各組分按比例投入發(fā)酵罐中，加自來水至規(guī)定計(jì)料體積，攪拌35分鐘使之溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)培養(yǎng)液pH＝8.0-8.5，攪拌35分鐘混合均勻。步驟B包括如下工藝步驟:10-30小時(shí)：溫度31℃，壓力0.04MPa，pH＝7.0-7.3，通風(fēng)量0.45vvm；31小時(shí)-放罐：溫度28℃，壓力0.04MPa，pH＝7.0-7.3，通風(fēng)量0.45vvm。所述的步驟B中進(jìn)行通氣攪拌發(fā)酵過程中補(bǔ)入雙氧水及微量元素；具體條件如下：14小時(shí)：補(bǔ)入微量元素；24小時(shí)：補(bǔ)入雙氧水；步驟A是將菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后，按照種子液：發(fā)酵規(guī)定計(jì)料體積培養(yǎng)液的體積百分比為15％的接種量接種于培養(yǎng)液中。所述的擴(kuò)大培養(yǎng)過程步驟(1)中制備搖瓶種子的工藝條件是：挑取2環(huán)斜面菌種接入滅菌后的搖瓶種子培養(yǎng)基中，經(jīng)振蕩培養(yǎng)制成搖瓶種子，培養(yǎng)溫度為31℃，搖床轉(zhuǎn)速為210轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)周期為12小時(shí)；搖瓶種子培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成：葡萄糖2.6％；麥芽糖1.7％；蛋白胨1.3％；玉米漿粉1.3％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3。所述的擴(kuò)大培養(yǎng)過程步驟(2)中的擴(kuò)大培養(yǎng)依次包括一級種子的制備、二級種子的制備，其中一級種子培養(yǎng)液由下列質(zhì)量百分含量的組分組成：葡萄糖2.6％；麥芽糖1.7％；酵母膏0.5％；硫酸銨0.25％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3；接種量為搖瓶種子：一級種子培養(yǎng)液的體積比＝0.8％-1.0％，將搖床種子接入滅菌后的一級種子培養(yǎng)液經(jīng)過培養(yǎng)制成一級種子，一級種子的制備過程中的工藝條件是培養(yǎng)溫度31℃，通風(fēng)量0.95vvm，培養(yǎng)周期12h。所述的二級種子培養(yǎng)液由如下質(zhì)量百分含量的組份組成：葡萄糖2.7％；麥芽糖1.7％；豆粉0.9％；硫酸銨0.25％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3；接種量為一級種子：二級種子培養(yǎng)液的體積比＝15％，將一級種子接入滅菌后的二級種子培養(yǎng)液經(jīng)過培養(yǎng)制成二級種子，二級種子的制備過程中的工藝條件是培養(yǎng)溫度31℃，通風(fēng)量0.95vvm，培養(yǎng)周期9h。其余內(nèi)容與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于：所述的步驟A中按種子液：培養(yǎng)液的體積百分比為13％的接種量將菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954接入發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液中。所述的步驟A中培養(yǎng)液由如下質(zhì)量百分含量的組份組成：玉米淀粉水解液4.1％；麥芽糖2.1％；豆粉0.35％；硫酸鎂0.11％；豆油0.08％；余量為無菌水；pH＝8.0-8.5。所述的步驟A中培養(yǎng)液配制過程如下：將培養(yǎng)液中各組分按比例投入發(fā)酵罐中，加自來水至規(guī)定計(jì)料體積，攪拌32分鐘使之溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)培養(yǎng)液pH＝8.0-8.5，攪拌32分鐘混合均勻。步驟B包括如下工藝步驟:10-30小時(shí)：溫度31℃，壓力0.035MPa，pH＝7.0-7.3，通風(fēng)量0.42vvm；31小時(shí)-放罐：溫度27℃，壓力0.035MPa，pH＝7.0-7.3，通風(fēng)量0.42vvm。所述的步驟B中進(jìn)行通氣攪拌發(fā)酵過程中補(bǔ)入雙氧水及微量元素；具體條件如下：13小時(shí)：補(bǔ)入微量元素；24小時(shí)：補(bǔ)入雙氧水；步驟A是將菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后，按照種子液：發(fā)酵規(guī)定計(jì)料體積培養(yǎng)液的體積百分比為13％的接種量接種于培養(yǎng)液中。所述的擴(kuò)大培養(yǎng)過程步驟(1)中制備搖瓶種子的工藝條件是：挑取2環(huán)斜面菌種接入滅菌后的搖瓶種子培養(yǎng)基中，經(jīng)振蕩培養(yǎng)制成搖瓶種子，培養(yǎng)溫度為31℃，搖床轉(zhuǎn)速為210轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)周期為11小時(shí)；搖瓶種子培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成：葡萄糖2.6％；麥芽糖1.6％；蛋白胨1.1％；玉米漿粉1.2％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3。所述的擴(kuò)大培養(yǎng)過程步驟(2)中的擴(kuò)大培養(yǎng)依次包括一級種子的制備、二級種子的制備，其中一級種子培養(yǎng)液由下列質(zhì)量百分含量的組分組成：葡萄糖2.6％；麥芽糖1.6％；酵母膏0.45％；硫酸銨0.22％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3；接種量為搖瓶種子：一級種子培養(yǎng)液的體積比＝0.8％-1.0％，將搖床種子接入滅菌后的一級種子培養(yǎng)液經(jīng)過培養(yǎng)制成一級種子，一級種子的制備過程中的工藝條件是培養(yǎng)溫度31℃，通風(fēng)量0.95vvm，培養(yǎng)周期12小時(shí)。所述的二級種子培養(yǎng)液由如下質(zhì)量百分含量的組份組成：葡萄糖2.6％；麥芽糖1.6％；豆粉0.85％；硫酸銨0.22％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3；接種量為一級種子：二級種子培養(yǎng)液的體積比＝13％，將一級種子接入滅菌后的二級種子培養(yǎng)液經(jīng)過培養(yǎng)制成二級種子，二級種子的制備過程中的工藝條件是培養(yǎng)溫度31℃，通風(fēng)量0.95vvm，培養(yǎng)周期8.5h。其余內(nèi)容與實(shí)施例1相同。實(shí)施例5本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于：所述的步驟A中按種子液：培養(yǎng)液的體積百分比為17％的接種量將菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954接入發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液中。所述的步驟A中培養(yǎng)液由如下質(zhì)量百分含量的組份組成：玉米淀粉水解液4.4％；麥芽糖2.4％；豆粉0.45％；硫酸鎂0.14％；豆油0.13％；余量為無菌水；pH＝8.0-8.5。所述的步驟A中培養(yǎng)液配制過程如下：將培養(yǎng)液中各組分按比例投入發(fā)酵罐中，加自來水至規(guī)定計(jì)料體積，攪拌38分鐘使之溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)培養(yǎng)液pH＝8.0-8.5，攪拌38分鐘混合均勻。步驟B包括如下工藝步驟:10-30小時(shí)：溫度31℃，壓力0.045MPa，pH＝7.0-7.3，通風(fēng)量0.45vvm；31小時(shí)-放罐：溫度28℃，壓力0.045MPa，pH＝7.0-7.3，通風(fēng)量0.45vvm。所述的步驟B中進(jìn)行通氣攪拌發(fā)酵過程中補(bǔ)入雙氧水及微量元素；具體條件如下：12-15小時(shí)：補(bǔ)入微量元素；23-26小時(shí)：補(bǔ)入雙氧水；步驟A是將菩薩根瘤菌(Rhizobiumpusense)CGMCCNo.12954經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后，按照種子液：發(fā)酵規(guī)定計(jì)料體積培養(yǎng)液的體積百分比為17％的接種量接種于培養(yǎng)液中。所述的擴(kuò)大培養(yǎng)過程步驟(1)中制備搖瓶種子的工藝條件是：挑取2環(huán)斜面菌種接入滅菌后的搖瓶種子培養(yǎng)基中，經(jīng)振蕩培養(yǎng)制成搖瓶種子，培養(yǎng)溫度為32℃，搖床轉(zhuǎn)速為215轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)周期為13小時(shí)；搖瓶種子培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成：葡萄糖2.7％；麥芽糖1.8％；蛋白胨1.4％；玉米漿粉1.4％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3。所述的擴(kuò)大培養(yǎng)過程步驟(2)中的擴(kuò)大培養(yǎng)依次包括一級種子的制備、二級種子的制備，其中一級種子培養(yǎng)液由下列質(zhì)量百分含量的組分組成：葡萄糖2.7％；麥芽糖1.8％；酵母膏0.55％；硫酸銨0.28％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3；接種量為搖瓶種子：一級種子培養(yǎng)液的體積比＝1.0％，將搖床種子接入滅菌后的一級種子培養(yǎng)液經(jīng)過培養(yǎng)制成一級種子，一級種子的制備過程中的工藝條件是培養(yǎng)溫度30℃，通風(fēng)量1.0vvm、培養(yǎng)周期13h。所述的二級種子培養(yǎng)液由如下質(zhì)量百分含量的組份組成：葡萄糖2.7％；麥芽糖1.8％；豆粉0.95％；硫酸銨0.28％；余量為無菌水；pH＝7.0-7.3；接種量為一級種子：二級種子培養(yǎng)液的體積比＝17％，將一級種子接入滅菌后的二級種子培養(yǎng)液經(jīng)過培養(yǎng)制成二級種子，二級種子的制備過程中的工藝條件是培養(yǎng)溫度30℃，通風(fēng)量0.95vvm，培養(yǎng)周期9.5h。其余內(nèi)容與實(shí)施例1相同。申請人對實(shí)施例1-5中的發(fā)酵收率及所制備的產(chǎn)品粘度進(jìn)行了檢測，相關(guān)結(jié)果如下：發(fā)酵收率(g/L)發(fā)酵制備的產(chǎn)品粘度(cp)實(shí)施例15.01550實(shí)施例25.21600實(shí)施例35.41580實(shí)施例45.51650實(shí)施例55.281630當(dāng)前第1頁1 2 3