專利名稱：一種與大豆根瘤磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因GmPT5及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及與大豆根瘤磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因GmPT5及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大豆是重要的油料作物和蛋白質(zhì)來(lái)源，能與土壤中的根瘤菌形成互惠互利的共生系統(tǒng)，固定空氣中的氮(N)，為宿主植物提供持續(xù)的氮源(Unkovich and Pate, 2000)。隨著農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和環(huán)境保護(hù)的要求，利用根瘤菌接種大豆減輕其對(duì)氮肥的依賴，對(duì)科學(xué)種植大豆，保護(hù)環(huán)境具有重要意義。磷(P)是植物生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)元素，也是豆科植物生長(zhǎng)及生物固氮過(guò)程中需求較高的元素。根瘤固氮是高耗能的過(guò)程，每固定I摩爾的N需要 消耗16摩爾的ΑΤΡ,ΑΤΡ的形成又與磷的有效性密切相關(guān)(Schuize et al.，1999)。但是在全世界13億公頃耕地中，約5. 8億公頃存在不同程度的土壤有效磷缺乏(Ellingtoon，1999; vance, 2001;呂濱，1987)，我國(guó)有效磷缺乏的土壤約占總耕地面積的2/3 (劉建中，1994)，嚴(yán)重限制了植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，形成了一系列的機(jī)制來(lái)適應(yīng)低磷土壤的環(huán)境，其中包括誘導(dǎo)或增強(qiáng)植物體內(nèi)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白高效地吸收利用有效磷。以往的研究表明，根瘤是一個(gè)較強(qiáng)的“庫(kù)”，對(duì)磷的需求較高。低磷會(huì)抑制根瘤的形成，降低其固氮能力。到目前為止，只有一篇文獻(xiàn)研究報(bào)道了豆科作物根瘤磷獲取的兩個(gè)來(lái)源，包括從根部向根瘤運(yùn)轉(zhuǎn)的磷和根瘤從介質(zhì)直接吸收的磷(Al-Niemi，1998)，但根瘤磷獲取的生理及分子機(jī)理仍不清楚。植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，尤其是Phtl家族蛋白在植物磷的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要的作用，但是，對(duì)是否存在磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)豆科作物根瘤磷獲取的兩個(gè)途徑目前尚未有相關(guān)報(bào)道。因此，尋找參與調(diào)控大豆根瘤磷獲取的關(guān)鍵基因，不僅可以解析豆科作物根瘤磷吸收/運(yùn)轉(zhuǎn)的分子機(jī)理，而且可為培育氮磷雙高效大豆新品種提供基因資源，對(duì)發(fā)展環(huán)境友好型可持續(xù)農(nóng)業(yè)具有重要的理論和實(shí)踐意義。針對(duì)上述研究背景，在大豆基因組測(cè)序完成的基礎(chǔ)之上，申請(qǐng)人通過(guò)同源比對(duì)確定大豆Phtl磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員。根據(jù)定量PCR結(jié)果，本發(fā)明克隆了其中一個(gè)低磷誘導(dǎo)的、根瘤特異表達(dá)的高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因GmPT5，證明GmPT5基因編碼的蛋白具有將磷從根部向根瘤運(yùn)轉(zhuǎn)、促進(jìn)根瘤生長(zhǎng)發(fā)育及對(duì)磷吸收，最終提高根瘤固氮效率及植株生物量的功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種與大豆根瘤磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述基因編碼的蛋白質(zhì)，本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供上述基因及其編碼的蛋白質(zhì)的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所提供的與大豆根瘤磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因萬(wàn)，可以來(lái)源于大豆，其包含或具有選自如下的核苷酸序列
(1)SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列；
(2)與(I)的核苷酸序列的互補(bǔ)序列在低等嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件、優(yōu)選高嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列；
(3)與(I)的核苷酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、特別優(yōu)選至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的核苷酸序列；
(4)與(I)的核苷酸序列編碼相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)、但在序列上不同的核苷酸序
列； (5)編碼如下氨基酸序列之一的核苷酸序列SEQID ΝΟ:2所示的氨基酸序列，或者，由于一或多個(gè)(例如1-25個(gè)、1-20個(gè)，1-15個(gè)，1-10個(gè)，1-5個(gè)，1-3個(gè))氨基酸殘基的替代、缺失和/或插入而與SEQ ID ΝΟ:2所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，與SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的氨基酸序列；
(6)(1)-(5)任何一個(gè)的核苷酸序列的活性片段；
(7)與(1)-(5)任何一個(gè)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。SEQ ID NO: I由1566個(gè)堿基組成，其開(kāi)放閱讀框架(ORF)為第1-1566位堿基，編碼具有序列SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在本發(fā)明中稱為GmPT5蛋白。本發(fā)明提供的與大豆根瘤磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)，其包含或具有選自如下的氨基酸序列
(1)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列；
(2)由于一或多個(gè)(例如1-25個(gè)、1-20個(gè)，1-15個(gè)，1-10個(gè)，1-5個(gè)，1-3個(gè))氨基酸殘基的替代、缺失和/或插入而與SEQ ID Ν0:2中所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列；
(3)與SEQID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、特別優(yōu)選至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的
氨基酸序列；
(4)(I)或(2)或(3)所述氨基酸序列的活性片段；
(5)本發(fā)明的多核苷酸分子編碼的氨基酸序列。本發(fā)明提供的基因和蛋白質(zhì)能夠調(diào)控包含它的轉(zhuǎn)基因生物體內(nèi)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)。擴(kuò)增上述基因全長(zhǎng)或其任一片段的引物對(duì)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還提供含有上述基因的表達(dá)載體，可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體等，如pCAMBIA3301(CAMBIA, Australia,由劉耀光研究員實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，具體描述見(jiàn)http://www. cambia.org/)、pYLRNAi (由劉耀光研究員實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，具體描述見(jiàn)文獻(xiàn)胡旭霞和劉耀光，2006，分子植物育種)或其它衍生植物表達(dá)載體。本發(fā)明還提供一種基因工程菌，其含有上述的表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及細(xì)胞，其包含本發(fā)明的基因或重組載體。所述細(xì)胞可以是植物細(xì)胞，例如豆科植物細(xì)胞，或者微生物細(xì)胞，例如細(xì)菌或真菌細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是分離的、離體的、培養(yǎng)的、或者是植物的一部分。本發(fā)明還涉及植物或者植物部分，植物材料，植物種子，其包含本發(fā)明的細(xì)胞。所述植物可以是豆科植物，例如大豆，也可以是其它植物，例如單子葉植物如水稻、小麥、大麥、玉米、高粱、甘蔗、燕麥、或黑麥等，或者其他雙子葉植物如煙草、向日葵、甜菜、辣椒、馬鈴薯、番茄等。還涉及來(lái)自所述植物的轉(zhuǎn)基因種子。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)植物的方法，該方法包括從本發(fā)明的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，或者將本發(fā)明的植物與另一植物雜交。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的方法生產(chǎn)的植物。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的基因或重組載體在調(diào)控植物體內(nèi)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)中的用途，包括制備轉(zhuǎn)基因植物以及制備促進(jìn)植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)的制劑。本發(fā)明還涉及調(diào)控植物體內(nèi)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)的方法，該方法包括制備含有本發(fā)明的 GmPT5基因或重組載體的植物，例如，所述方法可以包括從本發(fā)明的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物或者將本發(fā)明的植物與另一植物雜交。本發(fā)明所提供的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是將上述基因?qū)氪蠖怪校玫睫D(zhuǎn)基因復(fù)合植物；所述轉(zhuǎn)基因復(fù)合植物接種根瘤菌后根瘤大小、根瘤數(shù)、植株生物量及氮、磷含量等高于所述目的對(duì)照植物。所述基因可以例如是通過(guò)所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入受體植物的。攜帶有本發(fā)明的基因GmPT5的植物表達(dá)載體可通過(guò)例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到大豆細(xì)胞或組織中。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果
I.基因所屬的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在擬南芥和水稻中雖已被克隆及報(bào)道，但其在豆科作物磷吸收運(yùn)轉(zhuǎn)方面的生物學(xué)功能并不清楚，尤其是在根瘤磷的吸收運(yùn)轉(zhuǎn)方面。本發(fā)明克隆的基因?qū)Υ蠖垢隽椎霓D(zhuǎn)運(yùn)有顯著的影響，這對(duì)闡明磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在豆科作物根瘤磷獲取過(guò)程中的生物學(xué)功能及根瘤磷吸收運(yùn)轉(zhuǎn)的分子機(jī)理研究有著重要意義。2.基因不僅影響了磷從大豆根部向根瘤的轉(zhuǎn)運(yùn)，超量表達(dá)該基因還增加了大豆根瘤大小(圖OT)，例如在磷充足的情況下，轉(zhuǎn)基因株系的根瘤大小明顯高于空載體對(duì)照；該基因的功能研究對(duì)于解析豆科作物根瘤磷獲取途徑的分子機(jī)理有著深遠(yuǎn)的研究意義。3.該基因的轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株超表達(dá)株系與對(duì)照對(duì)比，植株氮、磷含量都顯著增加(圖5B，C);說(shuō)明基因?qū)μ岣咧参锪姿匚绽眯始肮采到y(tǒng)固氮效率效果明顯，通過(guò)基因工程技術(shù)提高基因GmPT5的表達(dá)量能夠同時(shí)提高磷效率及固氮效率，從而達(dá)到少施肥多產(chǎn)出的目的。


圖I :田間試驗(yàn)中大豆接種有效根瘤菌后的效果圖。圖2 :水培試驗(yàn)中磷供給對(duì)根瘤生長(zhǎng)發(fā)育的影響。圖3 :酵母互補(bǔ)試驗(yàn)。圖4 ,GmPT5基因的組織化學(xué)定位。圖5基因的表達(dá)對(duì)植株生長(zhǎng)、氮、磷含量及根瘤生長(zhǎng)發(fā)育的影響。
圖6基因?qū)Υ蠖垢隽撰@取兩個(gè)途徑的影響。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例I
基因的克隆
1、基因{GmPT5、的克隆
在已公布的大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)同源比對(duì)，預(yù)測(cè)出大豆Phtl磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族共有14個(gè)成員，通過(guò)定量PCR技術(shù)，確定基因?yàn)榈土渍T導(dǎo)的、根瘤特異表達(dá)的高親和磷 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。按照TRIzoI —步法提取磷高效基因型ΗΝ98大豆根瘤總RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到全基因組cDNA作為模板，以上游引物
5， -ATGGGGAAGGAGCAAGTTCAGG-3’ (SEQ ID NO:3)
和下游引物
5’ - TTACACCTTGGTCTCCTCTTCTTG-3’ (SEQ ID NO:4)
為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50 μ ，包含10 μΜ正反向引物各I PL，10XPCRbuffer 5 μ , 2. 5 mM dNTP 8 μ ，Taq 酶 O. 3 PL，cDNA 模板量 I μ ，然后用滅菌 ddH20 補(bǔ)足50 μ 。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 V I分鐘；94 V 30秒，55 V 30秒，72 V 2分鐘，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72 °C延伸10分鐘。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖膠電泳，通過(guò)Golden view核酸染料染色后，在凝膠成像系統(tǒng)成像。DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物?；厥盏玫絇CR產(chǎn)物克隆到pMD18_T (TAKARA公司，具體描述見(jiàn)http://www. takara. com. cn/)載體上進(jìn)行測(cè)序鑒定，表明PCR產(chǎn)物片段具有SEQ ID NO: I的核苷酸序列，將該片段命名為
2、載體的構(gòu)建
酵母載體的構(gòu)建以大豆根瘤cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到GmPT5的ORF片段，用上游特異引物
5’ -ATATGCGGCCGCATGGGGAAGGAGCAAGTTCAGG-3’ (SEQ ID NO:5)
和下游特異引物
5’ -GCGCGGATCCTTACACCTTGGTCTCCTCTTCTTG-3’ (SEQ ID NO:6)
擴(kuò)增全長(zhǎng)ORF片段，將片段裝入酵母表達(dá)載體ρ112Α1ΝΕ (由復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院明鳳副教授惠贈(zèng)，具體描述見(jiàn)文獻(xiàn):Ming et al. , 2006, Science in ChinaSeries C: Life Sciences),獲得連接成功的Ypll2_GmPT5表達(dá)載體,通過(guò)酵母的轉(zhuǎn)化獲得Ypll2-GmPT5的轉(zhuǎn)化子。啟動(dòng)子分析表達(dá)載體的構(gòu)建按照常規(guī)方法，提取大豆葉片或根部基因組DNA，以大豆基因組DNA為模板，用上游特異引物
5’ -ATGCTCTAGAGCCTACTGCTGCCTGTGAAT-3’ (SEQ ID NO:7)
和下游特異引物
5’ -ATGCCCATGGCTTGCTCCTTCCCCATCGCT-3’ (SEQ ID NO:8)
擴(kuò)增GmPT5啟動(dòng)子2496 bp片段，PCR片段回收測(cè)序無(wú)誤后，通過(guò)I和Nco I對(duì)回收片段及目的載體進(jìn)行雙酶切后，將GmPT5基因連接到目的載體pCAMBIA3301。
過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建以大豆根瘤cDNA為模板，用上游特異引物5’_TGATAAAGCTTATGGGGAAGGAGCAAGTTCAGG-3’ (SEQ ID NO:9)
和下游特異引物
5’ -ATTAAACGCGTTTACACCTTGGTCTCCTCTTCTTG-3’ (SEQ ID NO:10)ψ增GmPT5 ORF 1566 bp片段，PCR片段回收測(cè)序無(wú)誤后，通過(guò)歷III和I對(duì)片段及目的載體進(jìn)行雙酶切后，將GmPT5基因連接到目的載體pYLRNAi。干涉載體的構(gòu)建以大豆根瘤cDNA為模板，用上游特異引物 5’ -TCAAGGATCCCCAAGGAGTTCATGAGTCGCCATG-3’ (SEQ ID NO:11)
和下游特異引物
5’ -TGCCAAGCTTTGGCATTAGGCCCAAAGTTTGCA-3’ (SEQ ID NO:12)
擴(kuò)增411 bp目的片段，用BernH I和"i/7i/III分別酶切PCR產(chǎn)物和目的載體pYLRNAi，回收411 bp產(chǎn)物純化后連接載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOF’ (由劉耀光研究員實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，具體描述見(jiàn)文獻(xiàn):Wang et al. , 2006, The Plant Cell),測(cè)序無(wú)誤后,用上游特異引物5’ -ATGCCTGCAGCCAGTGATCATAGGGAATGGCAA-3’ (SEQ ID NO:13)
和下游特異引物
5’ -ATGCACGCGTGAACATGGAGATTCAAGCCGAG-3’ (SEQ ID NO:14)
擴(kuò)增反向片段，用I和I雙酶切反向片段和帶有正向片段的載體后，將反向片段連接到包含有正向片段的目的載體pYLRNAi中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，測(cè)序無(wú)誤后轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌K599 (由澳大利亞昆士蘭大學(xué)豆科綜合研究中心惠贈(zèng)，保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)根系生物學(xué)研究中心實(shí)驗(yàn)室，具體描述見(jiàn)文獻(xiàn)Kereszt A, et al. , 2007),用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆下胚軸注射法進(jìn)行毛根轉(zhuǎn)化。3、酵母互補(bǔ)試驗(yàn)
應(yīng)用缺失高親和力磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的突變體酵母菌株MB192 {MATa pho3~l Dpho84::HIS3ade2 leu2~3. 112 his3~532 trp1-289 ura3~l. 2 can I)進(jìn)行功能研究，該突變體菌株由復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院明鳳教授提供，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)徐國(guó)華教授實(shí)驗(yàn)室完成，主要包括Ypll2-GmPT5轉(zhuǎn)化子對(duì)突變體MB192磷吸收功能的回補(bǔ)及放射性同位素33P標(biāo)記測(cè)定酵母對(duì)磷的吸收速率等試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，其中A :酵母生長(zhǎng)試驗(yàn)驗(yàn)證基因?qū)θ笔?nèi)源高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的酵母突變體ΜΒ192 (對(duì)照)磷素吸收功能的互補(bǔ)。初始體積時(shí)酵母細(xì)胞數(shù)為6Χ105，依次等體積10倍稀釋后分別等量接種于100和50 μΜ Pi濃度YNB培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)3天；B :用同位素33P測(cè)定酵母轉(zhuǎn)化子Ypll2- GmPT5對(duì)磷素吸收的速率(pH
6.O)。
4、GmPT5組織表達(dá)定位分析
通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆下胚軸注射轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根后，將主根剪掉，保留從愈傷組織處長(zhǎng)出來(lái)的毛狀根，將毛狀根浸泡在根瘤菌菌液中30分鐘后移入水培，水培營(yíng)養(yǎng)液全為低氮(100 μ mol/L )處理,設(shè)低磷(5 μ mol/L)和正常磷(250 μ mol/L)兩個(gè)磷水平，根系生長(zhǎng)一周后，開(kāi)始有根瘤出現(xiàn)時(shí)，取一株上愈傷組織所有毛根(大概5條左右)的側(cè)根進(jìn)行GUS染色，去掉非轉(zhuǎn)基因的毛狀根，接種后15天、30天分別摘取根、根瘤進(jìn)行GUS報(bào)告基因表達(dá)的組織定位分析，確定基因在大豆根瘤生長(zhǎng)不同階段的組織表達(dá)部位，基因表達(dá)的組織定位可進(jìn)一步通過(guò)石蠟切片進(jìn)行觀察。結(jié)果見(jiàn)圖4，其中A-C為對(duì)照35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的空載，A，B為根部，C為根瘤；D-I為GmPT5pro::⑶S在根部(未接種根瘤菌，D-F)和根瘤中(接種根瘤菌后，G-I)的表達(dá)。D :根尖；E和F :成熟根部縱切和橫切。G :根瘤形成早期根瘤和根部連接處(接種后15天)出和I分別是中等大小及成熟根瘤(接種后30天)。轉(zhuǎn)化空載的對(duì)照植株和GmPT5 pro::⑶S轉(zhuǎn)基因植株全為低磷低氮營(yíng)養(yǎng)液處理。圖中除A, D標(biāo)尺為500 μπι及F，G標(biāo)尺為20 μ m外，其余圖中標(biāo)尺均為100μ m0實(shí)施例2
轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株的研究
I、轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株的獲得
將構(gòu)建好的表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至發(fā)根農(nóng)桿菌K599中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆下胚軸注射法獲得轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株(根部為轉(zhuǎn)基因毛狀根、地上部為非轉(zhuǎn)基因)，后續(xù)的表型鑒定 均使用此株系?？蛰d體對(duì)照按照上述方法，將表達(dá)載體pYLRNAi同樣方法轉(zhuǎn)化大豆，獲得轉(zhuǎn)pYLRNAi空載對(duì)照株系(CK)。 2、轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株的檢測(cè)
接種后15天，先采取根部樣品提取RNA，轉(zhuǎn)基因毛根篩選標(biāo)記為潮霉素，可用潮霉素抗性基因Qfyg)檢測(cè)毛根的真假；接種40天后，根瘤處于成熟期時(shí)，摘取兩個(gè)根瘤，提取RNA，進(jìn)一步用定量PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)及干涉的效果，定量PCR試驗(yàn)中以大豆看家基因TefSl為參照基因，相對(duì)表達(dá)量為目的基因GmPT5的表達(dá)量與看家基因表達(dá)量的比值。 定量PCR步驟
1)取§"基因的引物為
Hyg F: 5’ -GCTGTTATGCGGCCATTGTC-3’ (SEQ ID NO:15)
Hyg R: 5’ -GACGTCTGTCGAGAAGTTTC-3’ (SEQ ID NO:16)
TefSl基因的引物為
TefSl F: 5’ - TGCAAAGGAGGCTGCTAACT -3’ (SEQ ID NO:17)
TefSl R: 5’ - CAGCATCACCGTTCTTCAAA -3’ (SEQ ID NO: 18)
基因的引物為
GmPT5 F: 5’ - GAACACTTTCAGGGCAACTC -3， (SEQ ID NO:19)
GmPT5 R: 5’ - GTCATCACAGTCTTTGCATCG -3’ (SEQ ID NO:20)
2)反應(yīng)體系
2 X SYBR Green PCR master mix 10 μ L上游引物·(10 mol/L) 0· 6 μ L下游引物· (10 mol/L) O. 6 μ LMili-Q 水 補(bǔ)至 20 μ L稀釋的cDNA: 2 yL
3)反應(yīng)條件95O I分鐘
9% T1 # !
―― > 35-40 循環(huán) 55-60X! 15 秒 J—. ，rc 10秒 <采集熒光)
經(jīng)過(guò)抗性基因的檢測(cè)及定量PCR確認(rèn)得到有效的不同轉(zhuǎn)基因株系。3、轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株表型分析
I)植株鮮重及根瘤生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定
收獲接種根瘤菌50天后的不同轉(zhuǎn)基因株系測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)，包括植株生物量、根 瘤鮮重、根瘤數(shù)、根瘤大小等,其中根瘤大小為單個(gè)根瘤的鮮重(根瘤鮮重與根瘤數(shù)的比值)。生物量百分之一天平稱量地上部和根部樣品鮮重，將根部的根瘤摘下計(jì)數(shù)后，用萬(wàn)分之一天平稱取鮮重，所有樣品在105 1烘箱殺青30分鐘后置于75 °C烘干至恒重，稱取干重。2)氮、磷含量測(cè)定
先將植株各部分樣品粉碎，用H2SO4-H2O2法消煮，然后按一定比例吸取消煮液進(jìn)行氮和磷的測(cè)定。氮濃度用2300自動(dòng)定氮儀(Kjedahl2300，F(xiàn)OSSJ^i)測(cè)定，磷濃度用鑰銻抗比色法(Murphy and Riley, 1963)測(cè)定。植株養(yǎng)分含量用單位植株氮、磷量表示，計(jì)算公式為
氮含量(mg/plant)=氮濃度(mg/g) X植株干重(g/plant)
磷含量(mg/plant)=磷濃度(mg/g) X植株干重(g/plant)
圖5為基因的表達(dá)對(duì)植株生長(zhǎng)、氮、磷含量及根瘤生長(zhǎng)發(fā)育的影響。其中A :植株鮮重；Β :植株氮含量；C :植株磷含量；D :根瘤數(shù)及根瘤大小。不同轉(zhuǎn)基因株系接種根瘤菌后在不同磷濃度(低磷5 μΜ P;高磷250 μ M P)低氮營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)50天。CK，轉(zhuǎn)化空載的對(duì)照株系；0Χ，的超表達(dá)株系；RNAi的干涉株系。圖中數(shù)據(jù)為同一轉(zhuǎn)基因植物4個(gè)系數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。星號(hào)表示同一指標(biāo)在OX或RNAi株系與對(duì)照CK株系之間的顯著性比較表示顯著水平Z7〈O. 05時(shí)，差異顯著；**表示顯著水平O. 001 <Ρ〈O. 01時(shí)，差異顯著性介于顯著與極顯著之間；***表示顯著水平P〈O. 001時(shí)，差異極顯著；ns表示差異不顯著。4、轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株根瘤磷吸收試驗(yàn)(33P同位素標(biāo)記法)
I)根段吸收[33P] Pi同位素試驗(yàn)
不同磷濃度處理50天后的基因過(guò)表達(dá)、對(duì)照、干涉三種轉(zhuǎn)基因株系，保留各株系根段上有相同數(shù)目的根瘤(最好靠近根上部)，只供給下部一定長(zhǎng)度出cm)根段(沒(méi)有根瘤)33P標(biāo)記的營(yíng)養(yǎng)液(100 mL營(yíng)養(yǎng)液中加入10 μ Cl 33P同位素原液)，保證根瘤不直接接觸33P標(biāo)記的營(yíng)養(yǎng)液(如圖6Β所示)。吸收8小時(shí)之后，把根系放入杯子中相同磷濃度的營(yíng)養(yǎng)液浸泡清洗，用吸水紙吸干，重復(fù)3次左右，至清洗液中幾乎檢測(cè)不到放射性為止。將植株用透明膠固定在硬紙上，105 °C殺青30 min后，用壓片盒蓋住后進(jìn)行放射自顯影，3天后洗片。洗片后將樣品分為三部分(接觸33P標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)液的吸收根段、上部根段、根瘤)，稱取各自的重量后，剪碎放入5 mL離心管，加入4 mL閃爍液，放入白色閃爍瓶中，放置過(guò)夜后用 LS6500 Multi-purpose Scintillation Counter BECKMAN COULTER 閃爍計(jì)數(shù)儀(南京農(nóng)業(yè)大學(xué))測(cè)定樣品的cpm值(單位時(shí)間的計(jì)數(shù)次數(shù))。2)根瘤離體吸收[33P] Pi試驗(yàn)
低磷處理50天后的基因過(guò)表達(dá)、對(duì)照、干涉三種轉(zhuǎn)基因株系各摘取3個(gè)根瘤，稱取鮮重后，放入一定體積33P標(biāo)記的不同磷濃度營(yíng)養(yǎng)液，33P標(biāo)記強(qiáng)度為10 μ Ci per μ mo IPO4,根瘤與根接觸點(diǎn)傷口處用硅脂封住避免液體直接從傷口進(jìn)入，處理2小時(shí)后，把根瘤放入杯子中用相同磷濃度營(yíng)養(yǎng)液浸泡清洗，用吸水紙吸干，重復(fù)3次左右，到清洗液幾乎檢測(cè)不到放射性為止。將根瘤研磨后，轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中，加入4 mL閃爍液，放入白色閃爍瓶中，放置過(guò)夜后用 LS6500 Multi-purpose Scintillation Counter BECKMAN COULTER閃爍計(jì)數(shù)儀(南京農(nóng)業(yè)大學(xué))測(cè)定樣品的cpm值(單位時(shí)間的計(jì)數(shù)次數(shù))。圖6為基因?qū)Υ蠖垢隽撰@取兩個(gè)途徑的影響。其中A :大豆根段[33P]Pi吸收試驗(yàn)操作圖示，6cm直接接觸33P標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)液的根段作為吸收根段；箭頭表示上部根 段中根瘤的位置，上部根段及根瘤不接觸33P標(biāo)記的營(yíng)養(yǎng)液不同轉(zhuǎn)基因株系33P根段吸收試驗(yàn)；C不同轉(zhuǎn)基因株系根瘤離體33P同位素吸收試驗(yàn)。CK，轉(zhuǎn)化空載的對(duì)照株系；0X，的超表達(dá)株系；RNAi，的干涉株系。cpm表示通過(guò)液閃儀測(cè)定得到的每分鐘計(jì)數(shù)次數(shù)。圖中數(shù)據(jù)為同一轉(zhuǎn)基因植物4個(gè)系數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。星號(hào)表示同一指標(biāo)在OX或RNAi株系與對(duì)照CK株系之間的顯著性比較*表示顯著水平P <0. 05時(shí)，差異顯著；**表示顯著水平0. 001〈產(chǎn)〈0. 01時(shí)，差異顯著性介于顯著與極顯著之間；***表不顯者水平P〈0. 001時(shí)，差異極顯者；ns表不差異不顯者。5、田間試驗(yàn)與水培試驗(yàn)
圖I為田間試驗(yàn)中大豆接種有效根瘤菌后的效果圖。A :田間試驗(yàn)大豆接種根瘤菌50天后整體生長(zhǎng)狀況圖；B :根瘤鮮重和籽粒產(chǎn)量；C :植株氮磷含量；試驗(yàn)中每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包括3株大豆。圖中柱子為試驗(yàn)各處理5個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。星號(hào)表示同一指標(biāo)在不接種根瘤菌處理(-R)和接種根瘤菌處理(+R)時(shí)通過(guò)測(cè)驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性比較的結(jié)果，*表示顯著水平P <0. 05時(shí)，差異顯著；**表示顯著水平0. 001< P〈0.01時(shí)，差異顯著性介于顯著與極顯著之問(wèn)；***表示顯著水平P <0. 001時(shí)，差異極顯著。圖2為水培試驗(yàn)中磷供給對(duì)根瘤生長(zhǎng)發(fā)育的影響。A :圖中所示為低氮情況下高低磷處理大豆根瘤生長(zhǎng)情況(接種后50天)；Β :根瘤數(shù)和根瘤大?。籆 :植株鮮重和磷含量；D :植株葉片、根部及根瘤可溶性磷濃度。大豆幼苗接種根瘤菌后在不同磷濃度處理的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)50天，其中低磷為5 μΜ P，高磷為250 μ M P。試驗(yàn)中每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，圖中柱子為試驗(yàn)各處理4個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。B圖和C圖中星號(hào)表示同一指標(biāo)在高低磷處理時(shí)通過(guò)t-測(cè)驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性比較的結(jié)果，*表示顯著水平P〈0.05時(shí)，差異顯著；**表示顯著水平0. 001 <P <0. 01時(shí)，差異顯著性介于顯著與極顯著之間；***表示顯著水平/7 <0. 001時(shí)，差異極顯著。D圖中不同的字母表示磷濃度在不同組織間的差異性比較，大小寫(xiě)字母分別表示高低磷處理下的比較情況。
權(quán)利要求
1.一種與大豆根瘤磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO: I 所示。
2.—種權(quán)利要求I所述與大豆根瘤磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。
3.—種表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求I所述與大豆根瘤磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因GmPT5。
4.一種基因工程菌，其特征在于含有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
5.權(quán)利要求I所述與大豆根瘤磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求I所述與大豆根瘤磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在制備促進(jìn)植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)的制劑中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體在制備促進(jìn)植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)的制劑中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為雙子葉植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述雙子葉植物為大豆。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種與大豆根瘤磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因GmPT5及其應(yīng)用。該與大豆根瘤磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因GmPT5的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。GmPT5基因不僅調(diào)控磷從根部向根瘤的轉(zhuǎn)運(yùn)，超表達(dá)該基因還增加了大豆根瘤大小及植株生物量及氮、磷含量。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102757969SQ20121020707
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者廖紅, 田江, 秦璐, 趙靜 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)