專利名稱：提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
氮素是自然界中動物、植物、微生物中不可缺少的生命元素，在活細胞內(nèi)，氮是所有氨基酸、核酸及其他許多重要分子的主要組成部分。大氣中的氮，必須通過以生物固氮為主的固氮作用，才能被植物吸收利用，動物直接或間接地以植物為食物才能吸收利用氮素。生物固氮是指某些種類的固氮微生物利用體內(nèi)的固氮酶在常溫常壓下將大氣中的氮還原成氨的過程。根據(jù)固氮微生物的固氮特點以及與植物的關(guān)系，可以將生物固氮作用分為自生固氮、共生固氮和聯(lián)合固氮三類。大豆根瘤菌是共生固氮微生物中的一類，與宿主植物形成共生固氮體系后進行生物固氮，為宿主植物提供生長所必需的氮元素。統(tǒng)計表明，在3種 固氮形式中，共生固氮效率最高，固氮量最多。長期以來，人們把豆科植物根瘤的固氮作用視為糧食生產(chǎn)的基礎(chǔ)，它既可保持土壤肥力，又可提高糧食作物的產(chǎn)量。生物固氮仍然是生命科學(xué)研究中的重大課題，而且在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也具有重要的應(yīng)用價值。生物固氮不僅固氮量大，而且還可以提高土壤肥力，改善土壤板結(jié)情況，減少化肥的使用量，不污染環(huán)境；更為重要的是它有取之不盡，用之不竭的廉價氮源，常溫常壓下可以固氮，成本低，利用率高，因此，生物固氮是今后肥料發(fā)展的主要方向之一。黑龍江省是我國大豆的主產(chǎn)區(qū)，年播種面積、總產(chǎn)量和出口量均居全國首位，加強生物固氮作用的研究及應(yīng)用對提高我省大豆的產(chǎn)量有重要意義。目前,大豆根瘤菌基因工程菌株在接種到大豆幼苗后，與原始出發(fā)菌株相比，大豆植株所結(jié)根瘤數(shù)增加23. 73%，大豆產(chǎn)量增加3. 8% 51. 39%，增幅較小。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決現(xiàn)有大豆根瘤菌基因工程菌株在接種到大豆幼苗后，與原始出發(fā)菌株相比，大豆植株所結(jié)根瘤數(shù)及大豆產(chǎn)量增幅小的問題，提供一種提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法。本發(fā)明提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，按以下步驟進行一、對費氏中華根瘤菌15067進行活化和擴培，然后提取費氏中華根瘤菌15067的基因組DNA;二、采用同源序列克隆法，以費氏中華根瘤菌15067基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒TaKaRa Agarose GeL DNA Purification Kit進行純化，獲得目的基因dctA ;三、對目的基因dctA進行測序鑒定；四、將目的基因dctA與重組質(zhì)粒載體PET-Plae分別經(jīng)NdeI和BamHI進行雙酶切，將酶切后的目的基因dctA和酶切后的載體pET_Pla。連接，獲得重組載體pET-Plae-dctA ;五、以重組載體pET-Plae-dctA為模板進行PCR擴增，構(gòu)建Pla。-dctA_T7片段，然后將Pla。-dctA-17片段與pTR102質(zhì)粒載體分別經(jīng)KpnI進行單酶切，將酶切后的Plac-dctA-I7片段和酶切后的pTR102質(zhì)粒載體連接，構(gòu)建原核生物表達載體pTR-Plae-dctA ；六、采用三親本雜交技術(shù)將原核生物表達載體pTR-Plae-dctA轉(zhuǎn)化到費氏中華根瘤菌15067中，即獲得基因工程菌株HD-SF-04 ;其中步驟二中PCR擴增所用上游引物Pl為5' -CGCCATATGATGCGCGGATTACGAGTGC-3'，下游引物 P2 為 5' -GCGGGATCCTCACTCCGCTGACTTGGCAAAC-3';步驟五中PCR擴增所用上游引物P3為5' -CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG-3'，下游引物 P4 為 5' -CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA-3'。大量的研究結(jié)果已經(jīng)表明，蘋果酸、延胡索酸和琥珀酸等四碳二羧酸(dCAs)是植物體直接供給類菌體以支持其共生固氮所需要的碳源及能源。增強四碳二羧酸轉(zhuǎn)移酶基因(dctABD)的表達可以增強宿主植物體的光合產(chǎn)物向類菌體的傳遞，從而以滿足其氨類物質(zhì)的同化吸收過程和固氮作用對碳源及能量的需求。四碳二羧酸轉(zhuǎn)移酶基因dctABD是植物類菌體在共生固氮時所必需的基因，其結(jié)構(gòu)基因dctA編碼四碳二羧酸轉(zhuǎn)移酶，并且受調(diào)控于調(diào)節(jié)基因dctB和dctD，其中dctA基因和dctB、dctD基因呈現(xiàn)出反向的排列結(jié)構(gòu)。本發(fā)明獲得的基因工程菌株HD-SF-04與出發(fā)菌株及含空載體pTR102的菌株相t匕，接種轉(zhuǎn)基因工程菌株HD-SF-04的大豆植株所結(jié)根瘤的固氮酶活性增加約37%，大豆 植株所結(jié)根瘤數(shù)增加53. 73%，大豆產(chǎn)量上增加約62. 02%。本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌株HD-SF-04對黑龍江省大豆生產(chǎn)的實際需求有很大的現(xiàn)實意義。


圖I為具體實施方式
一步驟一中PCR擴增獲得的目的基因dctA電泳圖；圖2為具體實施方式
一步驟四中重組質(zhì)粒載體PET-Pla。雙酶切后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；圖3為具體實施方式
一基因工程菌株HD-SF-04的菌落發(fā)光性檢測圖。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，按以下步驟進行一、對費氏中華根瘤菌15067進行活化和擴培，然后提取費氏中華根瘤菌15067的基因組DNA;二、采用同源序列克隆法，以費氏中華根瘤菌15067基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，獲得目的基因dctA ;三、對目的基因dctA進行測序鑒定；四、將目的基因dctA與重組質(zhì)粒載體PET-Plae分別經(jīng)NdeI和BamHI進行雙酶切，將酶切后的目的基因dctA和酶切后的載體PET-Plae連接，獲得重組載體pET-Plae-dctA ;五、以重組載體pET-Plae-dctA為模板進行PCR擴增，構(gòu)建Pla。-dctA-17片段，然后將Pla。-dctA-17片段與pTR102質(zhì)粒載體分別經(jīng)KpnI進行單酶切，將酶切后的Pla。-dctA-17片段和酶切后的PTR102質(zhì)粒載體連接，構(gòu)建原核生物表達載體pTR-Plac;-dCtA ;六、采用三親本雜交技術(shù)將原核生物表達載體pTR-Plae-dctA轉(zhuǎn)化到費氏中華根瘤菌15067中，即獲得基因工程菌株HD-SF-04 ;其中步驟二中 PCR 擴增所用上游引物 PI 為 5' -CGCCATATGATGCGCGGATTACGAGTGC-3'，下游引物 P2為 5 ' -GCGGGATCCTCACTCCGCTGACTTGGCAAAC-3 ';步驟五中 PCR 擴增所用上游引物 P3 為5' -CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG-3'，下游引物 P4 為 5' -CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA_31 o步驟一中費氏中華根瘤菌15067購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)菌種保藏編號是ACCC15067，在中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心仍處于可用狀態(tài)。步驟二中所述膠回收試劑盒為購買自TaKaRa公司的瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒(TaKaRa Agarose GeL DNA Purification Kit)。步驟四中重組質(zhì)粒載體pET_Pla。的構(gòu)建方法為采用聚合酶鏈式反應(yīng)向Iac啟動子片段兩端各引入Bgl II和Nco I酶切位點，對Iac啟動子的PCR產(chǎn)物與載體pET-28a(購買自Novagen公司)分別經(jīng)BglII和Nco I進行雙酶切后，回收所需目的片段，進行連接，構(gòu)建質(zhì)粒載體PET-Plac。步驟五中所述pTR102質(zhì)粒載體由《高效固氮重組大豆根瘤菌株的構(gòu)建及其根圈定殖微生態(tài)學(xué)研究》(李友國、周俊初，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，2000年)的作者處得到。步驟一中的具體操作方法為將4°C保存的費氏中華根瘤菌15067三區(qū)劃線接種到 YMA 固體培養(yǎng)基(每 IOOOmL 由 IOg 的甘露醇、0. 2g 的 KH2P04、0. 2g 的 MgSO4 7H20、0. 2g的NaCl、0. Ig的酵母膏、5g的CaCl2、18. 0 20. Og的瓊脂粉和余量的蒸餾水組成)，放入恒溫培養(yǎng)箱中，在28°C下培養(yǎng)72h ;挑取單菌落接種到Y(jié)MA液體培養(yǎng)基(每IOOOmL由IOg的甘露醇、0. 2g 的 KH2P04、0. 2g 的 MgSO4 .7H20、0. 2g 的 NaCl,0. Ig 的酵母膏、5g 的 CaCl2 和余量的蒸餾水組成)，置于空氣搖床上，在28°C，180r/min振蕩培養(yǎng)72h進行菌株擴培，然后用CTAB法提取費氏中華根瘤菌15067的基因組DNA并用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測。將純化后的目的基因dctA與TA克隆載體pMD18-T (購買自TaKaRa公司)進行連接，連接方法參照TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒說明書，獲得連接產(chǎn)物；采用CaCl2法制備大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞；將連接產(chǎn)物和大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞在無菌條件下混勻，采用熱休克法即冰浴而后突然溫浴的方式使其轉(zhuǎn)化，加入SOC液體培養(yǎng)基(20g的蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaClUOmL的0. 25MKCl、5mL的2M MgCl2、20mL的IM葡萄糖加入蒸餾水并定容至IOOOmL)，37°C搖床180r/min振蕩培養(yǎng)lh，將菌液按不同梯度的量涂布于含Amp、IPTG、X-Gal的LB平板上進行藍白篩選；用無菌牙簽挑取平板上白色菌落于ImLLB液體培養(yǎng)基中，置于搖床中37°C，180r/min過夜培養(yǎng)，然后以菌液為模板，進行陽性克隆子的PCR鑒定，反應(yīng)結(jié)束后取5 PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；將鑒定結(jié)果為陽性的菌液活化，送至測序公司進行測序。將測序結(jié)果進行生物信息學(xué)分析，利用NCBI網(wǎng)站中的BLASTn程序?qū)y序獲得目的基因dctA的核苷酸序列進行在線分析，獲得目的基因dctA的序列與Sinorhizobium fredii (費氏中華根瘤菌)NGR234的dctA基因的序列相似性高達99%,與R. Ieguminosarum(豆科植物根瘤菌)的dctAl基因的序列相似性高達96%,該基因即為費氏中華根瘤菌15067中的dctA基因。dctA基因的堿基序列如SEQ ID NO 1所示。本實施方式步驟一中PCR擴增獲得的目的基因dctA電泳圖如圖I所示，圖I中M為DNA Marker (DL2000)，泳道1、2和3均為目±的基因dctA電泳條帶。本實施方式步驟四中重組質(zhì)粒載體PET-Pla。雙酶切后經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測圖如圖2所示，圖2中Ml為DNA Marker (DL15000)，泳道2為雙酶切后的重組質(zhì)粒載體PET-Plac, M2 為 DNA Marker (DL2000)。本實施方式獲得的基因工程菌株HD-SF-04與轉(zhuǎn)化空載體的菌株(TC :將pTR102空載體轉(zhuǎn)化費氏中華根瘤菌15067中)和原始出發(fā)菌株(費氏中華根瘤菌15067)進行對比。pTR102質(zhì)粒載體中帶有發(fā)光酶基因luxAB，與傳統(tǒng)的檢測技術(shù)相比，IuxAB基因標記技術(shù)具有靈敏、精確、操作簡便等特點。含有IuxAB基因的標記微生物能在其體內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光酶，在還原型黃素單核苷酸(FMNH2)存在下，氧化底物葵醛并產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，此現(xiàn)象可通過X光片記錄下來。根據(jù)標記微生物的發(fā)光現(xiàn)象，可以確定標記微生物的位置、數(shù)量等。將dctA基因連入PTR102后，重組質(zhì)粒也帶有發(fā)光酶基因，通過三親本雜交后，重組質(zhì)粒導(dǎo)入大豆根瘤菌中。因此，可以利用IuxAB基因標記技術(shù)可以追蹤重組載體在受體菌株中的遺傳穩(wěn)定性。在培養(yǎng)好的單菌落平板蓋上滴加癸醛溶液50mL，然后將平板倒置于暗室，再把膠片放置在平板上約lmin，然后放在顯影液中顯影至觀察到黑斑顯現(xiàn)(中間應(yīng)移動膠片以使其與顯影液充分均勻接觸)，快速將膠片放入清水中，充分洗掉顯影液，再放于定影液中定影IOmin,最后用清水沖洗30min,至此X光片就已制作完成；X光片的結(jié)果見圖3,可知的本 實施方式中的基因工程菌株HD-SF-04構(gòu)建成功。
對本實施方式制備的基因工程菌株HD-SF-04中原核生物表達載體pTR-Plae-dctA的遺傳穩(wěn)定性的測定，并將基因工程菌株HD-SF-04轉(zhuǎn)到植物盆栽中做進一步的驗證，具體步驟如下I、自生條件下遺傳穩(wěn)定性檢測基因工程菌株HD-SF-04經(jīng)純化后，隨機挑取5個單菌落，在YMA培養(yǎng)基(每IOOOmL由10. Og甘露醇、0. 2g磷酸氫二鉀、0. 2g七水硫酸鎂、0. 2g氯化鈉、0. 4g酵母粉、5. Og碳酸鈣和余量的蒸餾水組成)上連續(xù)轉(zhuǎn)接10次，最后挑取數(shù)個單菌落分別點種在加抗生素的YMA培養(yǎng)基(每IOOmL YMA培養(yǎng)基加120 u L濃度為50mg/mL的氨芐抗生素)和YMA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)至長出菌落，檢查菌落的發(fā)光性；2、共生條件下遺傳穩(wěn)定性檢測將標記后的基因工程菌株HD-SF-04制成菌懸液，接種于大豆植株根部，并以費氏中華根瘤菌15067和不接菌作對照，光照培養(yǎng)至40d左右收獲，將收獲的根瘤切成兩半，倒扣于培養(yǎng)皿底部，在培養(yǎng)皿中滴加50 ii L癸醛溶液，在暗室中即可觀察到發(fā)光，顯影并用X光片曝光記錄，由此計算發(fā)光根瘤占所有根瘤的百分率；HD-SF-04，TC的重組質(zhì)粒經(jīng)連續(xù)轉(zhuǎn)接后的保持率見表I所示；表I
權(quán)利要求
1.提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，按以下步驟進行 一、對費氏中華根瘤菌15067進行活化和擴培，然后提取費氏中華根瘤菌15067的基因組DNA ;二、采用同源序列克隆法，以費氏中華根瘤菌15067基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，獲得目的基因dctA ;三、對目的基因dctA進行測序鑒定；四、將目的基因dctA與重組質(zhì)粒載體PET-Plae分別經(jīng)NdeI和BamHI進行雙酶切，將酶切后的目的基因dctA和酶切后的載體PET-Plae連接，獲得重組載體pET-Plae-dctA ;五、以重組載體pET-Plae-dctA為模板進行PCR擴增，構(gòu)建Pla。-dctA-17片段，然后將Pla。-dctA-17片段與pTR102質(zhì)粒載體分別經(jīng)KpnI進行單酶切，將酶切后的Pla。-dctA-17片段和酶切后的PTR102質(zhì)粒載體連接，構(gòu)建原核生物表達載體pTR-Plac;-dCtA ;六、采用三親本雜交技術(shù)將原核生物表達載體pTR-Plae-dctA轉(zhuǎn)化到費氏中華根瘤菌15067中，即獲得基因工程菌株HD-SF-04 ;其中步驟二中 PCR 擴增所用上游引物 PI 為 5' -CGCCATATGATGCGCGGATTACGAGTGC-3'，下游引物 P2為 5 ' -GCGGGATCCTCACTCCGCTGACTTGGCAAAC-3 ';步驟五中 PCR 擴增所用上游引物 P3 為5' -CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG-3'，下游引物 P4 為 5' -CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA_3' o
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟二中PCR擴增的反應(yīng)體系如下 成分用量400ng/jiL費氏中華根瘤菌15067基因組DNA0 5^L 0.2(^M 引物 PlI.OpL 0.2(iM 引物 P21.0|iL \0^1-xTaq 緩沖液2.0|iL lOmmol/L dNTP1.5|iL Ex Taq DNA 聚合酶0.5|iL 無菌水13.5pL PCR擴增條件為94°C變性5min，94°C變性30s，54。。退火30s，72。。延伸90s，共35個循環(huán)，再72°C延伸7min,4°C保溫。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟四中目的基因dctA的雙酶切反應(yīng)體系如下成分用量目的基因次以IO.O|.iL 限制性內(nèi)切酶AfefeI 1.0|iL 限制性內(nèi)切酶Bamm 1.0|iL IOx T 緩沖液2.0|iLBSA (牛血清白蛋白)0.2|iL無菌水5.8|iL 酶切反應(yīng)條件37°C水浴保溫3小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟四中重組質(zhì)粒載體pET-Pla。的雙酶切反應(yīng)體系如下 成分用量重組質(zhì)粒載體pET-PlaElO.OuL限制性內(nèi)切酶MMI.OuL限制性內(nèi)切酶BamHlI .OjaL IOx T 緩沖液2.0|iL BSA0.2|iL 無菌水5.8|iL 酶切反應(yīng)條件37°C水浴保溫3小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟四中連接反應(yīng)體系如下成分用量IOxT4 DNA連接酶緩沖液2.5|iL 酶切后的目的基因dctA10 0^l酶切后的重組質(zhì)粒載體pET-Pla。2.0|iL T4DNA 連接酶1.0|iL無菌水9.5|iL 連接反應(yīng)條件16 °C水浴保溫過夜。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟五中PCR擴增的反應(yīng)體系如下成分用量400ng/VL iRflL獲休 pET-Pl;k'-dctA0.5|iL 0.2^iM 引物 P31.0|iL0.2[iM 引物 P4I.OnL IQy-Ex Taq 緩沖液2.0|iL I Ommol/L dNTP1.5 (i L ￡x DNA 聚合酶0.5|xL 無菌水13.5|iL PCR擴增條件為94°C變性5min，94°C變性30s，65。。退火30s，72。。延伸90s，共35個循環(huán)，再72°C延伸7min,4°C保溫。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟五中Pla。-dctA-17片段單酶切反應(yīng)體系如下成分用量Plac-dctA-T7 片段丨 O.OpL限制性內(nèi)切酶KpnlLOnLIOx L 緩沖液2.0|iL 無菌水7.0|iL 酶切反應(yīng)條件37°C水浴保溫3小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟五中pTR102質(zhì)粒載體單酶切反應(yīng)體系如下成分用量pTR102質(zhì)粒載體丨0.0(iL限制性內(nèi)切酶Kpnll.OuLIOx L緩沖液2.0叫 無菌水7.0(iL 酶切反應(yīng)條件37°C水浴保溫3小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟五中連接反應(yīng)體系如下成分用量IOxT4 DNA連接酶緩沖液2.5吣酶切后WPlac-dctA-T7片段10.0叫酶切后的pTR102質(zhì)粒載體2.0|iLT4DNA 連接酶1.0|iL 無菌水9.5|iL連接反應(yīng)條件16 °C水浴保溫過夜。
全文摘要
提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，涉及一種提高大豆結(jié)瘤數(shù)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法。本發(fā)明是要解決現(xiàn)有大豆根瘤菌基因工程菌株在接種到大豆幼苗后，與原始出發(fā)菌株相比，大豆植株所結(jié)根瘤數(shù)及大豆產(chǎn)量增幅小的問題。方法對費氏中華根瘤菌進行活化和擴培，提取基因組DNA；采用同源序列克隆法，PCR擴增，獲得目的基因dctA；對目的基因進行測序鑒定；構(gòu)建重組載體pET-Plac-dctA；然后構(gòu)建原核生物表達載體pTR-Plac-dctA；六、將原核生物表達載體轉(zhuǎn)化到費氏中華根瘤菌中，即獲得基因工程菌株。轉(zhuǎn)化本發(fā)明基因工程菌株的大豆植株所結(jié)根瘤數(shù)增加53.73％，大豆產(chǎn)量增加62.02％。
文檔編號C12N15/74GK102660573SQ201210148018
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者于冰, 吳川, 季琳, 宮世龍, 李海英, 李珊珊, 楊樂, 潘鈺, 王琳琳, 蒙明明, 谷丹, 賈珊珊, 趙晨曦, 陳思學(xué), 馬春泉 申請人:黑龍江大學(xué)